우리는 프로토콜을 편집 도움을 Mariani 연구소의 회원 감사드립니다. 이 작품은 CIRM 박사 과정 이수 교육 기금 (JLF), CIRM 다리 인턴쉽 (TZTT), 로버트 E. 5 월 R. 라이트 재단 (FVM), 그리고 남부 캘리포니아 대학 (FVM)에 의해 재정 지원되었다.

1. 마우스 태아의 LysoTracker의 착색 <ol><li> 남성 스터드 케이지에 젊은 (성인 5-6 일주일 정도) 여성을 배치하여 마우스 배아를 생성합니다. 그 결합을 나타내는 질 플러그의 모양에 대한 다음과 같은 아침에 모니터가 발생했습니다. 여성의 임신 인 경우 그 날의 정오에는 0.5 dpc (일 게시물 성교)라고합니다. 여기에 제시된 절차는 배아 7-13 dpc에 이상적입니다. </li><li> 관심 배아 일에 승인 된 프로토콜에 따라 여성을 안락사시켜야과 자궁을 제거합니다. 행크스 BSS (페놀 레드 제외) 10cm 배양 접시에 decidua에서 배아를 제거합니다. 추가 - 배아 세포막을 제거하고 적어도 하나는 관계없는 조직과 혈액을 제거 할 행크스 BSS와 린스 않습니다. </li><li> LysoTracker의 배아 착색 솔루션 (행크스 BSS 5 밀리미터 LysoTracker)를 준비합니다. 1-2 litters을위한 편리한 볼륨은 5 ML입니다. 부드럽게 골고루 염료를 지출 할 수 섞는다. </li><li> LysoTracker의 배아 착색의 Solut에 배아를 추가합니다45 분의 microfuge 튜브 또는 37 ° C에서 유리 병 및 배양에 이온. </li><li> 행크스 BSS에서 매우 부드럽게 네 번, 5 분마다 빨래를 헹굴. </li><li> 밤새 4 % Paraformaldehyde에 해결했습니다. </li><li> 수정 프로그램을 제거 할 행크스 BSS, 10 분에 한 번 씻어. </li><li> 배경 얼룩을 제거 할 수있는 메탄올 시리즈 (50 %, 75 %, 80 %, 100 %, 5 분 각 단계)를 통해 탈수. 이 영상 중에 좋은 신호 대 노이즈를 달성하는 것이 중요합니다. </li><li> 이 시점에서 당신은 빛으로부터 보호, -20 ° C에서 메탄올에 무한정 배아 샘플을 저장할 수 있습니다. </li></ol> 참고 : 조직 샘플은 DNA의 genotyping에 대한 단계에서 촬영 될 수 있지만, 그렇게가이 단계에 대한 모든 샘플 배치 처리 할 수 있도록 단지 저장하기 전에 샘플을 채취하는 것이 가장 편리 할 수 있습니다. 각 배아의 꼬리, 다리, 또는 머리에서 조직 샘플을 수집하고 별도의 튜브에 모두 넣어. 조직 샘플을 Rehydrate하고 genoty 준비핑 (Ping). 2. ES 문화를 차별화 LysoTracker의 착색 <ol><li> 20 μl 드롭 당 500 세포의 시작 밀도 공중 드롭 방법 15을 통해 embryoid 몸을 준비합니다. </li><li> 삼일 후, 10cm 비 점착성의 배양 접시 (세균 작업에 사용되는 즉)에 정지 문화에 embryoid 몸을 전송할 수 있습니다. 미디어마다 2 일 변경 오일에 대한 문화. </li><li> 일 7, gelatinized 8 잘 챔버 슬라이드에 embryoid 기관을 이전 (챔버에 젤리 0.1 %를 추가, 5 분 기다리 제거 및 미디어 추가). 챔버 1-2 embryoid 몸을 전송합니다. </li><li> 매일 미디어를 변경 십일에 대한 문화. embryoid 몸이 유리 표면에 부착 교란하지 할만큼 챔버 슬라이드의 모서리에있는 피펫을 배치 할주의하십시오. 또한 신선한 미디어는 챔버의 모서리에있는 피펫을 넣고 천천히 미디어를 해제 추가 할 때. </li><li> 컬트 10 일 후우레는 긍정적 인 제어로 apoptosis를 유도하기 위해, 0.1 mm와 1.0 mm까지 H 2 O 2와 우물의 일부를 치료 60 분에 (신선한 미디어 믹스에 H 2 O 2를 추가 한 다음 셀에 추가). D-PBS와 일반 미디어 야간 문화와 두 번 씻어. </li><li> 부드럽게 기존의 미디어를 기음과 LysoTracker 셀 착색 솔루션을 (미디어 500 나노 미터 LysoTracker (최종 농도), 챔버 300 μl)를 추가합니다. </li><li> 15 분에 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> D-PBS 2 회, 5 분 각각 두 번 씻어. </li><li> RT에서 15 분에 4 % paraformaldehyde에 고정. </li><li> D-PBS, 5 분으로 두 번 씻어. </li></ol> 3. LysoTracker의 얼룩진의 태아 나 ES의 문화보기 <ol><li> D-PBS를 aspirating하여 현미경의 세포 샘플을 준비하고, 슬라이드에서 챔버를 제거, 공기는​​ 약 5 분 동안 건조, 그리고 수성 설치 매체 (DAPI 또는 이와 유사한과 Vectashield)을 추가. 마르고 동안 호일 장벽을 놓습니다g는 형광의 표백 감소합니다. Vectashield 또는 유사한에서 깊은 우울증 유리 접시 또는 작은 페트리 접시에 배아를 탑재합니다. </li><li> rhodamine 또는 텍사스 레드 필터를 장착 해부 또는 복합 현미경으로 시각화 (LysoTracker RED DND-99 여기 / 방출 : 590분의 577 nm의).에게 얼룩은 일반적으로 매우 밝은 오랫동안 노출은 일반적으로 필요하지 않습니다. </li></ol> 4. 이미징 기술을 사용하여 결과의​​ 정량화 <ol><li> 수동 모드에서 동일한 노출 상황에서 샘플의 디지털 사진을 찍습니다. </li><li> 어도비 포토샵 또는 이와 유사한 이미징 프로그램에서 이미지를 엽니 다. LysoTracker의 착색의 양을 확인하려면 빨간색 채널과 임계 값 붉은 얼룩은 이제 흰색 픽셀로 표시되는 등의 이미지 (검은 색과 흰색으로 이미지를 변환)를 선택합니다. 흰색 픽셀을 선택하고 전체 수를 얻기 위해 히스토그램 기능을 사용하십시오. </li><li> 계산하려면 파란색 채널을 사용하여분야에서 핵의 수. 이 이미지를 주석으로 수의 기록을 유지하는 데 유용 할 수 있습니다. </li><li> 값을 기록하고 세포 당 평균 착색 수준을 계산합니다. 당신은 샘플링하고자하는 모든 이미지에 대해 동일한 임계 값 설정으로이 분석을 반복합니다. </li></ol> 5. 대표 결과 이러한 소닉 고슴도치 (쉬)와 같은 성장 인자의 유전자가, 16,17을 제거 할 때 변경할 수 배아 발달 동안 PCD의 정상적인 패턴이 있습니다. LysoTracker 매우 diffusible있는 작은 분자 염료이기 때문에, 전체 난자는 mesenchyme 12,13 내도 깊은 PCD의 영역을 평가하는 시각화 할 수 있습니다 그림 1은 정상과 쉬에 대한 LysoTracker의 착색 패턴 표시 -.에서 돌연변이 마우스 배아 - /를 10.5dpc. 특히 다리와 체절 regio에 돌연변이 배아 - / -이 단계에서, PCD은 크게 쉬에 증가NS. 배아의 일부는 전체 패턴을 평가하기 위해 높은 배율 (1B)에서 전체 마운트에 이미징 할 수 있습니다. 해부하는 부분은 진동 마이크로톰 (1C) 또는 더 자세히 PCD 지역을 표시하는 방법으로 그라 이오 스탯 (DF)와 sectioned 수 있습니다. transferase 터미널의 침투가 덜 문제가있는 곳 TUNEL 분석은 가장 얇은 부분으로 이루어집니다. LysoTracker의 착색과 TUNEL 분석은 같은 조직 (그림 1D-G)에서 수행 할 수 있습니다. 이러한 결과는 보여주고 LysoTracker 및 TUNEL의 착색, 상당히 PCD 중복의 일반적인 지역 사이에 엄격한 1시 1분 상관 관계가 있지 않지만. 높은 배율에서, 그것은 puncta를 볼 수 있습니다 그 TUNEL 분석과 긍정적 인 얼룩 아니라 LysoTracker의 LysoTracker의 염료와 만 금방 치료 염료, puncta, 그리고 puncta는 착색을 중복 그게.주세요 EB는 젤라틴 코팅 표면에 도금하는 경우, 차별화 세포는 migrat합니다e는 외부. 문화 10 일 후, 세포는 뉴런, 근육 세포, 그리고 cardiomyocytes 등의 세포 유형의 다양한으로 차별화해야합니다. 그림 2에 표시된 문화가 이러한 세포 유형의 혼합 인구를 포함하지만 하나는 관심의 특정 세포 유형의 PCD 공부하기위한 프로토콜을 적응 수 있습니다. 예를 들어, EB는 뉴런 19 차별화를 향상시킬 수 Retinoic 산성과 치료를 할 수 있으며, 다음 LysoTracker 분석은 서로 다른 조건 하에서 neuronal 세포 사망을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 차별화 된 ES 세포의 정상적인 문화에서 LysoTracker 및 / 또는 TUNEL의 assays (그림 2A)로 PCD 받아야하고 이러한이 감지 할 수있는 몇 가지 세포가 있습니다. PCD는 산화 손상을 유도하고 apoptotic 경로주세요 20,21을 시작 이러한 과산화수소 등 다양한 세포 독성 에이전트의 수 (H 2 O 2)에 의해 유도 할 수 있습니다. H 2 O 2의 저용량 둘 다 증가LysoTracker 및 TUNEL의 착색은, 아니 치료에 비해 세포 수축과 확산 LysoTracker 및 TUNEL의 긍정적에서 다량 결과 동안. 배아의 결과와 마찬가지로, 그것은 puncta를 볼 수 있습니다 그 TUNEL 분석과 긍정적 인 얼룩 아니라 LysoTracker의 LysoTracker의 염료와 만 금방 치료 염료, puncta, 그리고 puncta는 착색을 중복 그게.주세요 apopotosis을 유도 세포 독성 에이전트의 응용 프로그램의 결과는 autophagy (그림 2D)을 유도 혈청 기아 조건에 비교됩니다. 혈청 기아 (1 시간)의 기간을받은 세포는 LysoTracker과 TUNEL 염색법의 높은 상관 관계를하지 않는 다른 패턴을 나타냅니다. LysoTracker의 착색은 많은 치료 문화에 비해 증가하지만 TUNEL의 긍정적는 정상 수준에 있습니다. 어도비 포토샵에서 사용할 수있는 표준 도구 고용 LysoTracker의 착색은 단순 임계 값 방식을 정량화 할 수그 하나는 세포의 인구의 평균 착색 수준을 계산 할 수 있습니다. 그림 3A-B는 샘플 이미지가 정량화 과정에서 보이는 방법을 보여줍니다. 파란색 채널 (패널 3A)에 빨간색 채널 및 DAPI-스테인드 핵의 LysoTracker의 착색있는 기준 이미지를 시작으로,이 이미지의 붉은 채널이 흑백으로 이미지를 변환하고 흰색 픽셀이었습니다 thresholded되었습니다 그런 다음 선택하고 (그림 3A &#39;)시켰다. 임계 값 수준은 LysoTracker의 착색 패턴을 나타낸다는 것을 선정되었습니다. 이미지를 사용하는 정량화 방법과 마찬가지로, 그것은 잠재적으로 오버 강조 차이가 발생할 수 있습니다이로 사진을 overexposing 않도록하는 것이 중요합니다. 분야에서 핵의 수는 다음 갑자기 채널 (그림 3B)에서보고 (그림 3B &#39;) 계산하는 동안 같은 붓으로 그리기 도구를 사용하여 핵을 표시하여 계산 될 수있다. 하나는 일을 표현할 수 있습니다셀 당 얼룩의 평균 수준을 계산하여 착색의 전자 수준 (픽셀 / 핵 카운트 수). 바라던가 높은 통한 놔 검사를 위해이 알고리즘을 사용하면 대부분의 심사 패키지는 특정 채널에 밝기를 측정하고 또한 가장 일반적인 응용 프로그램 수동 방법은 빠른 그러나, 현장에서 핵을 계산하고, 될 개체 식별자 기능을 할 수 있습니다 간단합니다. 예를 제공하기 위해,도 2A-C에서 샘플 지역은 정량 및 결과 확인이 LysoTracker의 착색 높은 수준의 (그림 3C)에 H 2 O 2 결과의 농도를 증가시킨다.되었습니다 <img src="/files/ftp_upload/4254/4254fig1.jpg" alt="그림 1"/> 1 그림. / - - 배아 정상과 쉬의 LysoTracker의 착색. A, A &#39;보통과 쉬 -. / - LysoTracker 레드 물들 10.5 dpc,에서 마우스 배아는 Vectashield에 장착하고 아래 사진epiflourescence는 현미경을 해부. 괄호는 forelimbs의 위치를 나타냅니다 B, B &#39;정상과 쉬의 Forelimb -.. / - 배아는 높은 배율의 이미징. &#39;뒤 괴사 지대&#39;(별표로 표시)과 사지 꽃 봉오리 (화살표로 표시)의 근위 mesenchyme의 지역을 포함한 세포 죽음의 정상적인 도메인을 확인합니다. 쉬 수혜 사지 안쪽과 말초 부분에 강한 얼룩을 전시 정상과 널을 모두 사지 봉오리의 forelimb 꽃 봉오리를 통해. C, C &#39;. 중간 섹션을 제공합니다. 널 사지 꽃 봉오리에서 정상 사지 봉오리 등쪽과 복부 및 말초 mesenchyme 내에서 강한 착색의 근위 mesenchyme (화살표)와 AER (화살촉)에 착색의 존재를 확인합니다. DF. 같은 섹션 (12 미크론, 냉동 섹션) LysoTracker과 TUNEL의 착색 (로슈 1684795)에 대한 이미징되었습니다. 섹션 쉬 널 mesenc의 말초 부분을 통과hyme. AER에 화살촉을 가리 킵니다. 전체 패턴이 두 방법을 사용하여 매우 비슷 얼마나 참고 그러나 착색이 완전히 중복되지 않습니다. G, G &#39;가. AER과 mesenchyme 높은 배율에서, 하나는 LysoTracker 또는 TUNEL - 긍정적 인 puncta의 존재를 모두 볼 수 있습니다 만뿐만 아니라 puncta으로 착색을 중복는데. <img src="/files/ftp_upload/4254/4254fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 차별화 된 ES 세포의 LysoTracker의 착색. ​​세포를 차별화는 난생의 부재에 8 챔버 슬라이드에 도금되었습니다. autophagy 경로는 혈청 기아 1 시간을 사용하여 유도 동안 LysoTracker과 TUNEL 염색법의 비교 방법을 표시하려면, apoptosis 경로는 H 2 O 2 개 중 2 개의 다른 복용을 유도했습니다. 이 이미지는 Zeiss LSM5 공 촛점 현미경으로 촬영 된 A- &#39;:. LysoT로 표시로 치료 문화는 몇 가지 일반적인 apoptosis를 보여racker 및 TUNEL의 착색. 대부분 두 기술 중복 (흰색 화살표)를 사용하여 패턴 그러나, 한 LysoTracker 만 긍정적 인 (빨간색 화살표)입니다 몇 puncta을 볼 수 B-B &#39;, CC &quot;. H 2 증가 양의 치료를 O 2는 apoptosis를 촉진 . 낮은 복용량보다 LysoTracker 및 치료 세포에 비해 TUNEL 긍정적 인 puncta을 보여줍니다. 높은 용량을 더욱 LysoTracker과 TUNEL 긍정적 인 puncta에 유도한다. 흰색 화살표 지점 중복 착색에 만 LysoTracker에 양성 반응이 그 puncta에 빨간색 화살표가 점하는 동안. 이 TUNEL의 착색 (녹색 화살표) 만 긍정적 인 puncta를 볼 수도 있습니다 DD &quot;. 세럼 기아는 리소좀과 autophagolysosomes의 자료 축적을 자극 할 수있는 autophagy를 유도 할 수 있습니다. 치료 문화에 비해 볼 수 있습니다 얼마나 많은 LysoTracker의 puncta합니다. TUNEL 긍정적 인 puncta이 존재 (이 대부분 LysoTracker는 얼룩 중복ING, 흰색 화살표)는 그러나, 그 수는 치료 조건에 비해 크게 증가하지 않습니다. 또한, 혈청 기아 조건 하에서, LysoTracker 전용 긍정적 puncta은 매우 유행 아르 (빨간색 화살표). <img src="/files/ftp_upload/4254/4254fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 어도비 포토샵을 사용하여 세포의 인구에 얼룩의 수준을 평가하는 정량화 방법. A : 그림 2A의 부분은 선택했고 LysoTracker (적색 채널) 및 DAPI의 얼룩은 (핵, 파랑 채널)이 패널에 표시됩니다 A &#39;:. 그림 3A의 붉은 채널은 검은 색과로 변환 thresholded되었습니다 이미지 흰색. 흰색 픽셀는 선택하고 히스토그램 함수를 사용하여 계산 될 수 B-B &#39;:. 파란색 채널은 핵을 보여줍니다 그들을 계산하는 동안 이미지는 붓으로 그리기 기능을 사용하여 주석을 추가 할 수 있습니다 C :.이가 전합니다패널 2A-C에서 샘플의 충분한 양을 정함. 데이터는 핵 당 픽셀로 표현되는 것은. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4254/4254fig3large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+autophagy+visualized+in+live+cells:+from+autophagosome+formation+to+fusion+with+endo/lysosomes.">The dynamics of autophagy visualized in live cells: from autophagosome formation to fusion with endo/lysosomes.</a> Autophagy. 1, 23-36 (2005).</li><li>Boya, P., Mellen, M. A., de la Rosa, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+autophagy+is+related+to+programmed+cell+death+during+the+development+of+the+nervous+system.">How autophagy is related to programmed cell death during the development of the nervous system.</a> Biochem. Soc. Trans. 36, 813-817 (2008).</li><li>Galluzzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes.</a> Autophagy. 4, 151-175 (2008).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

apoptosis의 중요한 특징은 caspase 활동의 검출과 함께 TUNEL 분석과 DNA 손상의 검출 (mAbs 또는 ZVAD-fmk으로 구속력 분자를 감​​지), 세포 변화의 관찰, 그리고 phosphatidylserine의 표현 (PS를 포함 막 표면에) (Annexin V 구속력을 감지). 이러한 assays의 각 몇 가지 단점이 있습니다. 예를 들어, TUNEL 분석에 사용 transferase 터미널은 몇 세포 층 이상 침투하지 않습니다. 또한 Annexin V는 막 손상 (Annexin V는 세포 안으?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td></td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> LysoTracker 레드 DND-99 </td><td> Invitrogen </td><td> # L-7528 </td><td></td></tr><tr><td> 행크스 BSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14025-076 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> EMD </td><td> EM-PX0055-3 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> 벡터 </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10-013 - CV </td><td></td></tr><tr><td> 비 필수 아미노산 </td><td> Cellgro </td><td> 25-025 - CI </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 pyruvate </td><td> Cellgro </td><td> 25-000 - CI </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.02 </td><td></td></tr><tr><td> 펜 패 혈성 </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> B-메르 캅토 에탄올, 50 MM </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td></td></tr><tr><td> LabTek-II 상공 회의소 슬라이드 (8도) </td><td> Nalge Nunc 인터내셔널 </td><td> 154534 </td><td></td></tr><tr><td> 젤리 0.1 % </td><td> Millipore </td><td> ES-006-B </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco의 PBS (D-PBS) </td><td> Cellgro </td><td> 21-031 - CV </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 솔루션 요리법 4 % Paraformaldehyde 100 ML는 다음과 같습니다 <ol><li> 4g의 paraformaldehyde, 90 ML H 2 O와 NaOH를 (2N NaOH의 드롭) 섞는다. 당신은 pH를 높이기 위해 몇 가지 NaOH를 추가 할 때까지 paraformaldehyde이 솔루션으로 이동하지 않습니다. </li><li> 60 저어와 열 ° C 모든 가루가 솔루션 (~ 10-20 분)에까지. 과열하지 마십시오. </li><li> 100 ML의 최종 볼륨을 달성하기 위해 ~ 10 ML 10X PBS를 추가합니다. </li><li> 편리 (~ 10 ML 또는 ~ 40 ML) aliquots에서 -20 ° C에서 저장합니다. </li></ol> 경고 : &#39;주름&#39;양식 (작은 알약을 압축)에서 Paraformaldehyde이 덜 가루이며, 따라서 후드의 외부 측정 할 수 있습니다. 하지만 당신은 여전히 보호 먼지 마스크 (N95를 착용해야합니다이상) 처리하는 동안. EB 문화 미디어 500 ML EB 미디어를 들면 : <table border="1"><tbody><tr><td> DMEM : </td><td> 404.5 ML </td></tr><tr><td> FBS : </td><td> 75.0 ML </td></tr><tr><td> L-글루타민 : </td><td> 5.0 ML </td></tr><tr><td> 페니실린은 / 스트렙토 마이신 : </td><td> 5.0 ML </td></tr><tr><td> 비 필수 아미노산 : </td><td> 5.0 ML </td></tr><tr><td> 나트륨 pyruvate : </td><td> 5.0 ML </td></tr><tr><td> β-메르 캅토 에탄올 : </td><td> 500μl </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

use of lysotracker to detect programmed cell death in embryos and differentiating embryonic stem cells

프로그래밍 세포 죽음 (PCD)는 일반 조직 항상성을 유지하고 embryological 개발하는 동안 조직과 장기 1,2,6,7를 형성하기 위해 성인에서 발생합니다. 개발하는 동안 독성 화학 물질이나 유전자 변이가 PCD 증가 시키거나 발달 이상이나 기형아 출산은 3-5의 결과 PCD 패턴을 변경할 수 있습니다. 이러한 결함의 병인을 이해하기 위해서는 배아의 연구는 배아 줄기 (ES) 세포를 차별화 사용하는 체외 assays에 구비 할 수 있습니다. Apoptosis는 caspase 효소 폭포를 활성화 신호 고유와 외부를 모두 포함 PCD의 잘 공부 형태입니다. 특성 세포 변화가 막 blebbing, 원자력 축소, 그리고 DNA의 조각이 포함되어 있습니다. PCD의 다른 형태의 caspase 활성화를 포함하지 않고 장시간 autophagy의 최종 결과 일 수 있습니다. 상관없이 PCD 경로의, 죽어가는 세포를 제거해야합니다. 성인에서 면역 세포 완벽하게태아에 면역 체계가 아직 발달되지 않은 곳, 제거 다른 메커니즘에 의해 발생하는 동안이 기능을 ORM. 이 메커니즘은에 복용 이웃 세포를 ( &quot;비 전문 phagocytes&quot;)를 포함 phagocytic 역할들이 죽어 셀 빨아들이다 그것에게 8-10를의 표면에 신호 &#39;내 식사&#39;를 인식하고 있습니다. engulfment 후, 그 잔해가 저하의 lysosome로 이동합니다. 따라서 관계없이 PCD 메커니즘, lysosomal 활동의 증가는 증가 세포 죽음과 상관 될 수 있습니다. PCD, 두꺼운 조직 및 다층 차별화의 문화권에서 리소좀을 시각화하는 간단한 분석을 공부하려면 유용 할 수 있습니다. LysoTracker의 염료는 lysosome 11-13로 산성 subcellular 구획에서 유지되는 높은 가용성 작은 분자이다. 염료는 확산 의해 순환 통해 이루어집니다. 침투는 두꺼운 조직 및 멀티 레이어 문화에 PCD의 방해, 시각화 아니므로 12,13 수 있습니다 </&gt;를 논의하게 될 것입니다. 절차는 단말기의 입력 / 투자율이 transferase 필요하기 때문에 반대로, TUNEL (터미널 deoxynucleotidyl transferase dUTP 닉 최종 라벨) 분석 14, 작은 샘플, 조직 학적 부분, 그리고 monolayer 문화로 제한됩니다. diffuses 및 용매에 의해 용해되어 아닐린 블루, 대조적으로, LysoTracker 레드 DND-99은 고칠 밝고 안정적​​입니다. 착색는 전체 마운트 또는 수성이나 솔벤트 기반의 설치 미디어 12,13를 사용하여 섹션의 표준 형광 또는 공 촛점 현미경으로 시각화 할 수 있습니다. 여기 정상과 음속의 고슴도치 널 마우스 배아에서 PCD 볼이 염료를 사용하여 프로토콜을 설명합니다. 또한, 우리는 ES 세포의 문화를 차별화의 PCD의 분석을 보여줍니다 및 간단한 정량화 방법을 제시한다. 요약하면, LysoTracker의 착색은 PCD을 검출 다른 방법에 큰 보완 할 수 있습니다.

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Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

우리는 마우스 배아의 프로그래밍 세포 죽음의 영역 (PCD)와 LysoTracker라는 높은 가용성 염료를 사용하여 배아 줄기 (ES) 세포 문화를 차별화를 시각화하는 간단한 프로토콜을 제시한다.

태아의 프로그래밍 셀 죽음을 감지 할 LysoTracker의 이용 및 배아 줄기 세포를 차별화

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

use-lysotracker-to-detect-programmed-cell-death-embryos

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23.1K 조회수.  University of Southern California. 우리는 마우스 배아의 프로그래밍 세포 죽음의 영역 (PCD)와 LysoTracker라는 높은 가용성 염료를 사용하여 배아 줄기 (ES) 세포 문화를 차별화를 시각화하는 간단한 프로토콜을 제시한다.

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Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

6.5 DPC 마우스 태아의 해부

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

연구

생물학

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Murine 배아 줄기 세포로부터 조혈 줄기 세포의 유도

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Immunosurgery에 의해 인간 배아 줄기 세포의 유도

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

의 전자 현미경을위한 배아의 준비 Drosophila 태아의 심장 관

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

절연 및 마우스 배아 새싹 세포의 유도

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

비디오 생물 정보학 인간의 배아 줄기 세포 콜로니 성장 분석

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Oligodendrocyte 엽 성의 전구 물질로 배아 줄기 세포의 분화

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

기형 종의 형성에 의해 인간 배아 줄기 세포의 운명 매핑

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

배아 림브 스킨 Vasculature에 대한 전체 마운트 Immunohistochemical 분석 : 엠브료에 혈관 분기 Morphogenesis를 공부하는 모델 시스템

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.