1. Mantenimiento Colony Mosca Blanca <ol><li> Condiciones ambientales: colonias de mosca blanca se deben mantener en una cámara de crecimiento controlada. El control de la humedad relativa, la temperatura, fotoperiodo y la intensidad de luz son esenciales para el crecimiento de las colonias óptima (Figura 1). Una temperatura de 28 ° C, 30-50% de humedad relativa, y un fotoperiodo de 14 horas dará lugar a una colonia que se desarrolla desde el huevo hasta la emergencia del adulto en 18 días (este tiempo varía con la planta huésped). La humedad relativa debe mantenerse por debajo de 70% para desalentar el crecimiento de insectos y hongos patógenos de plantas. Las tasas de fertilización y riego debe reducirse para desalentar los hongos patógenos y la acumulación de sal. La intensidad de la luz de la colonia debe ser bastante alta. Bombillas fluorescentes VHO utilizados en número suficiente para generar aproximadamente 800-1.000 velas ft a la altura del dosel son adecuados para la mayoría de las plantas (es decir. Algodón, haba común, frijol lima, tomate). La limpieza es esencial enuna colonia de mosca blanca para mantener las condiciones óptimas de crianza. </li><li> Jaulas Colony: Las moscas blancas se deben mantener las plantas en cajas, en vez de gratis en la habitación crecimiento. Las jaulas se pueden construir de diversos materiales, pero deben permitir: la ventilación, la facilidad de acceso, la capacidad de impedir la fuga o infiltración de mosca blanca, y de un tamaño suficiente para mantener suficientes plantas para generar la población de mosca blanca es necesario. Buenos resultados se han obtenido con organza más proyección de aluminio (por la fuerza), así como la detección de mosca blanca a prueba (véase la tabla de equipos e insumos específicos). </li><li> Colony Preparación de la planta: Las especies de plantas seleccionadas es una consideración importante cuando se inicia una colonia de mosca blanca. La planta debe ser capaz de soportar una alta población de insectos sin colapsar. La planta elegida para una colonia nonviruliferous debe ser un no huésped para el virus o virus que están destinados a ser transmitida para evitar la contaminación en la colonia y si el mantenimiento de un virulicolonia ferous, debe ser portador del virus. Las plantas deben crecer con bastante rapidez para apoyar aparición de nuevos adultos dentro de los 18 días de haber sido introducido a la colonia, pero no tan rápidamente como para superar las jaulas dentro de cuatro semanas. Enano, arbusto, o variedades de plantas de tipo patio se recomiendan ya que a menudo producen un área foliar similar a los cultivares más altos, pero sin el alargamiento del tallo. </li><li> Es muy importante para las plantas traseras para la colonia en invernaderos en jaulas que excluyen la mosca blanca y otros insectos. El uso de las plantas que están infestadas con la mosca blanca, trips, ácaros o antes de entrar en la colonia puede causar la colonia se colapse. Las plantas infestadas también tienen el potencial de ser infectado con virus transmitidas por insectos que puedan interferir con los estudios de transmisión de virus. </li></ol> 2. Establecimiento Colonia Mosca Blanca <ol><li> Empezar una colonia por primera vez el uso de moscas blancas limpias - los libres del virus de plantas, otros insectos y patógenos de insectos. Estos pueden ser obtenidosde los colaboradores o de campo. Si el campo recolectada, moscas blancas deben ser criados durante al menos 8 semanas en las plantas hospedantes del virus de la planta, y comprobar la ausencia de síntomas de la planta para asegurarse de que están libres de virus de plantas. </li><li> Semana 1: Introducir la mosca blanca limpia a la primera jaula de plantas. Las moscas blancas pueden ser introducidos por aspiración de números conocidos o agitando suavemente las moscas blancas de otra planta de origen en función de las demandas de la colonia. En la semana 1, moscas blancas están poniendo huevos en el envés de la superficie foliar de la planta. Un tamaño de la población aproximada se puede predecir para cada aparición basado en el número de adultos utilizados para poner los huevos y el número promedio de huevos puestos por hembra en la mosca blanca de la planta huésped en cuestión. </li><li> Semana 2: Comenzar otra jaula con la introducción de la mosca blanca a las nuevas plantas hospederas para poner sus huevos. Las plantas en la jaula se inició en la semana 1 tendrán los huevos, y algunas moscas blancas inmaduras que cubren el envés de las hojas (Figura 2). Algunosmoscas blancas adultas introducidas durante 1 semana seguirán con vida. </li><li> Semana 3: Comenzar una tercera jaula mediante la introducción de la mosca blanca de nuevas plantas para poner sus huevos. Las plantas en la jaula se inició en la semana 1 se tienen muchas nuevas moscas blancas adultas emergentes inmaduros, así como y debe haber un aumento muy notable de la mosca blanca adulta de la población. Las plantas en la jaula se inició en la semana 2 tendrá muchos huevos y moscas blancas inmaduras que cubren la parte inferior de las hojas. </li><li> Semana 4: Comienza la cuarta caja mediante la introducción de la mosca blanca de nuevas plantas para poner sus huevos. Las plantas en la jaula se inició en la semana 1 tendrán muchas moscas blancas adultas que son aproximadamente una semana después de la emergencia. Las plantas en la jaula se inició en la semana 2 tendrá muchas nuevas moscas blancas adultas emergentes y debe haber un aumento muy notable de la población de mosca blanca. Las plantas en la jaula iniciadas durante la semana 3 tendrá muchos huevos y moscas blancas inmaduras que cubren la parte inferior de las hojas. </li><li> Semanal después de la primera 4 weeks: Cada semana, comienza una nueva jaula mediante la introducción de las moscas blancas adultas desde la cuarta caja más antigua (la jaula comenzó en la semana 1) en nuevas plantas en una nueva jaula limpia. La jaula de edad debe ser retirado y desechado sus plantas. Estas moscas blancas son de aproximadamente 1 semana de post-emergencia. En el caso de la colonia virulífero, estas moscas blancas se transmitir el virus a las nuevas plantas, así como ponen huevos para la próxima generación de moscas blancas. </li><li> Experimentos de transmisión va a utilizar la mosca blanca que surgirán en la jaula de la tercera semana. Si se necesitan más moscas blancas, el número de plantas se pueden aumentar las moscas blancas y más pueden ser añadidos a la semana 1 jaula para aumentar la población de mosca blanca. </li></ol> 3. Método para la inoculación de plantas de ensayo <ol><li> Para asegurar altas tasas de transmisión: 1) Las moscas blancas se deben manejar el mayor cuidado posible para evitar daños a los insectos que reducirá las tasas de transmisión, 2) Debe haber suficiente área foliar disponible para la mosca blanca de IETsu sonda o alimentación. Un aumento en el tiempo de adquisición o un aumento en el número de plantas hospedantes de adquisición puede aumentar las bajas tasas de infectividad en plantas de ensayo por la aglomeración, ya sea en la adquisición o el periodo de acceso de la inoculación. </li><li> Colección de moscas blancas. El siguiente es un procedimiento para la recogida y el movimiento de los números precisos de moscas blancas requeridos para fines experimentales. Para mover un gran número de moscas blancas, como se necesita para la detección de la resistencia, por ejemplo, sólo es necesario agitar suavemente las plantas infestadas de mosca blanca en las plantas de prueba o de adquisición de los anfitriones infectados por el virus (y más tarde las plantas de ensayo). Asegúrese de agitar las plantas durante muchos lugares para minimizar los efectos de agregación. </li><li> Recientemente surgieron moscas blancas adultas (1-3 días después del brote) son muy activos y se alimentan a menudo así tienden a dar a las velocidades de transmisión más altas 4. Moscas blancas mayores, pero todavía transmiten a una frecuencia más baja. Varias moscas blancas por planta de ensayo (15-40 por plant) se debe utilizar para altas tasas de transmisión desde una proporción de 1 mosca blanca por planta a menudo resulta en inaceptablemente bajas tasas de transmisión 3,4. El número necesario dependerá del virus de la especie y de la adquisición y plantas de ensayo. </li><li> Montar los dispositivos de aspiración y viales de colección. (Figura 3) </li><li> Con una mano, sostenga una tarjeta de plástico de color amarillo dentro de la jaula de la colonia que contiene las moscas blancas que se recojan. Golpear suavemente las plantas para estimular las moscas blancas adultas para volar. Las moscas blancas se sentirán atraídos por la tarjeta amarilla que volarán desde la planta hasta la tarjeta donde se pueden recoger con un aspirador y una respiración muy suave. Nunca aspirar moscas blancas que se alimentan en las plantas. Sus estiletes están incrustados en la planta mientras que la alimentación para tirar de ellos fuera de las plantas se romperán sus estiletes y haciéndolos incapaces ya sea adquirir o transmitir virus (Figura 4). </li><li> Recoge unas 20 moscas blancas adultas en un solo collección vial para minimizar el daño físico a los insectos de las aspiraciones repetidas (Figura 5). </li><li> Para cambiar el tubo de recolección, toque suavemente el vial sobre una superficie dura y tapa con Parafilm mientras que las moscas blancas están desorientados desde el tapping. </li><li> Ponga un nuevo vial cobrar el aspirador y repetir hasta que se recogen el número de moscas blancas necesarios. Las moscas blancas pueden permanecer en los viales de recolección a temperatura ambiente durante varias horas. </li><li> Adquisición. Moscas blancas se colocan en una planta infectada del virus y se les permite alimentarse de las plantas infectadas durante 48-72 h. Períodos de adquisición de más de 72 horas generalmente no aumentan las tasas de transmisión. Para los virus transmitidos de manera no persistente o semipersistente, 1 hora y varias horas, respectivamente, son suficientes periodos de acceso de adquisición (Tabla 1). Los mejores resultados se obtienen cuando las moscas blancas se les da acceso libre a las plantas en jaulas que encierran a los insectos a una sola planta o avarias plantas. Sin embargo, algunos experimentos requieren la adquisición de las hojas específicas en las que se pueden utilizar de casos jaulas de clip. Al utilizar jaulas de clip es importante dar cabida a la preferencia alimentaria mosca blanca de la parte inferior de las hojas. Además, el hacinamiento de la mosca blanca en jaulas de clip puede reducir las tasas de transmisión - tasas aceptables de transmisión se han cumplido con 10 moscas blancas femeninas por clip jaula de 2,5 cm de diámetro. </li><li> La inoculación. Preparar una jaula apropiada para el tamaño de la inoculación y colocar las plantas de ensayo en el interior. Si sólo una planta es para ser inoculados considerar una sola jaula planta. Si más de una planta se inoculó en cuenta un pequeño marco / organza bolsa de jaula de PVC o una jaula de aluminio (Figura 6). El tamaño de la jaula se utiliza para la inoculación debe ser ligeramente más grande es el tamaño de la planta (s) a ser inoculados. Velocidades de transmisión más altas se obtienen cuando la mosca blanca se mantienen cerca de la copa de la planta y no dan mucho espacio libre. </li><li> Colección de moscas blancas de anfitriones de adquisición depende de las necesidades del experimento. Si se necesitan pequeñas cantidades, aspirar moscas blancas como se describió anteriormente. Colocar los viales de recolección de moscas blancas dentro de la jaula cerca de las plantas y quitar la tapa (Figura 7). Abra el frasco y liberar las moscas blancas o invertir y golpear suavemente el vial para liberar las moscas blancas. Si se necesitan grandes cantidades basta con mover las plantas de adquisición con la mosca blanca en las jaulas donde están ubicadas las plantas de ensayo y agite suavemente las moscas blancas de la planta huésped adquisición. Para ambos tipos de presentación, asegúrese de distribuir las moscas blancas a través de las plantas para minimizar la agregación y asegurar una inoculación uniforme. </li><li> Permita que las moscas blancas para sondear o piensos con la cantidad adecuada de tiempo, una vez más dependiente del virus y, en cierta medida, la planta huésped (Tabla 1). </li><li> Compruebe las moscas blancas, al menos una vez durante el período de acceso inoculación para asegurar que las moscas blancas sonsondeo o alimentar al abrir la jaula y girando sobre unas hojas de cada planta. </li><li> Para los períodos de acceso inoculación largos, molestar a las plantas con cuidado (con una vara de bambú o equivalente) para repasar las puntas de las plantas y fomentar las moscas blancas para redistribuir en las plantas. La redistribución de la mosca blanca ayuda a asegurar una velocidad de transmisión superior al contrarrestar la tendencia natural de la mosca blanca a agregarse. </li><li> Terminación. El periodo de acceso inoculación se terminó matando las moscas blancas con productos químicos autorizados. Aplicar dos insecticidas, una tras otra: un insecticida de contacto para poner fin rápidamente moscas blancas adultas y un insecticida sistémico para cerrar todas las moscas blancas que se desarrollan en las siguientes semanas y las perdidas por el insecticida de contacto (Figura 8). Un insecticida de contacto, tales como el jabón insecticida e insecticidas sistémicos, tales como imidacloprid o pimetrozina se han utilizado con buenos resultados. </li></ol>

<ol>
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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+efficiency+and+epidemiology+of+Criniviruses.">Transmission efficiency and epidemiology of Criniviruses.</a> Bemisia: Bionomics and Management of a Global Pest. , 319-332 (2010).</li><li>Yang, Y., Sherwood, T. A., Patte, C. P., Hiebert, E., Polston, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus+(TYLCV)+Rep+gene+sequences+to+engineer+TYLCV+resistance+in+tomato.">Use of Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) Rep gene sequences to engineer TYLCV resistance in tomato.</a> Phytopathology. 94, 490-496 (2004).</li><li>Zehnder, G. W., Yao, C., Murphy, J. F., Sikora, E. R., Kloepper, J. W., Schuster, D. J., Polston, J. 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No hay conflictos de interés declarado.

Los métodos descritos aquí se han desarrollado durante un período de dos décadas y se basan en la información básica proporcionada por muchos estudios de transmisión de la mosca blanca, el comportamiento y la biología. Puesto que hay muchas publicaciones, este manuscrito se refiere principalmente a las revisiones y para algunas publicaciones específicas seleccionadas para ilustrar el tipo de datos que se utilizan para desarrollar esta técnica. Es muy importante en este procedimiento que las moscas blancas se manejan con cuidado ya que la rotura de las piernas y antenas puede conducir a comportamientos anormales y menores tasas de transmisión. Colección con aspiradoras y otros dispositivos mecánicos de aspiración nunca ha dado buenos resultados. Otra consideración para el éxito es que el número de moscas blancas utilizados para obtener 100% de transmisión a las plantas de prueba, se debe determinar para cada combinación de huésped de la planta y el virus. Esta relación óptima sólo necesita ser establecida una vez. Los mejores resultados se han obtenido utilizando las moscas blancas adultas jóvenes (1-3 días surgimiento pasado) ya que g másive las mayores tasas de transmisión. Los adultos mayores pueden ser utilizados, pero se necesitará un mayor número de moscas blancas para compensar las tasas reducidas de transmisión. Las hembras son conocidos por transmitir a velocidades más altas que los hombres, ya que se alimentan con más frecuencia que los hombres. Sin embargo, por lo general no vale la pena el tiempo para separar los sexos para la transmisión. Este procedimiento se puede modificar de muchas maneras para adaptarse a los recursos y las necesidades del investigador. Cuando se trabaja con múltiples virus que lo mejor es mantener una colonia de moscas blancas criadas en plantas hospedantes del virus. Estas moscas blancas se pueden recoger coloca en plantas infectadas por virus para la adquisición y a continuación, después de la adquisición de las moscas blancas se pueden mover de nuevo a las plantas de ensayo. Vegetales destinados a la colonia deben ser cultivadas en invernaderos en jaulas para impedir la introducción de las moscas blancas que podrían infectar con otro virus. La infestación de estas plantas con ácaros, trips y otras plagas de las plantas puede comprometer la halud de la colonia y causar su colapso. Finalmente el riego de las plantas de colonias que hay que hacer con cuidado. Estas plantas están sometidas a un estrés extremo por la alimentación de tantas moscas blancas y las condiciones de luz normales inferiores. Root descomposición hongos que se introducen en la turba en las mezclas sin suelo puede convertirse en un problema si las plantas se overwatered ni una sola vez. El tratamiento previo de las plantas con un fungicida empapar puede eliminar algunos de los problemas. Si bien la transmisión de los virus de la mosca blanca de la planta puede llevar mucho tiempo y requerir recursos valiosos (como salas de crecimiento) es esencial para la transmisión de algunos virus para los que no tenemos otro medio de transmisión. También es un medio valioso para la selección de plantas para la resistencia a los virus, ya que utiliza el mismo tipo de transmisión que se espera que las plantas en el campo de resistir. El uso de los medios más artificiales de transmisión no siempre producen los mejores resultados en las evaluaciones de germoplasma de virus-resistencia.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Item</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue No.</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whitefly proof screening</td>
			<td>Klayman Meteor Ltd. Petah Tikva 49130, Israel</td>
			<td>---</td>
			<td>BioNet 50 mesh screen Antivirus Insect Screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whitefly proof screening</td>
			<td>Hummert International (www.hummert.com)</td>
			<td>27-4050-1 - 27-4062-1</td>
			<td>BioNet 50 mesh screen Antivirus Insect Screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whitefly Collection Devices</td>
			<td>BioQuip</td>
			<td>1135A</td>
			<td>Can also be made using eye droppers, flexible plastic tubing, plastic vacuum adaptors, and cheesecloth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection vials</td>
			<td>BioQuip</td>
			<td>8909</td>
			<td>Vials used depend on which aspirator is used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yellow plastic cards</td>
			<td>any company</td>
			<td>---</td>
			<td>Any bright yellow plastic card will work, can be purchased in many places.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whitefly Cages</td>
			<td>---</td>
			<td>---</td>
			<td>These are not commercially available and must be constructed. 60 cm x 60 cm x 60 cm cages work well for us. Our preference is for those constructed of aluminum window screening, nylon organdy, vinyl plastic, with a structure created using aluminum window frames. Doors are attached using piano hinges and sealed with weather stripping; tops of the cages are vinyl plastic. Cages can also be made of 1) plexiglass glued together on the edges with ventilation provided by screened openings cut on the side pieces; 2) large bags of nylon organdy, organza, or 50 mesh whitefly screening with internal supports provided by PVC pipes and fittings cut to desired lengths and assembled inside the bags, 3) wood frames and nylon organdy, organza, or 50 mesh whitefly screening.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transmitting plant viruses using whiteflies

Las moscas blancas, Hemiptera: Aleyrodidae, Bemisia tabaci, un complejo de especies morfológicamente indistinquishable 5, son vectores de muchos virus de plantas. Varios géneros de estos virus vegetales transmitidos por moscas blancas (Begomovirus, Carlavirus, Crinivirus, Ipomovirus, torrado) incluyen varios cientos de especies de patógenos emergentes y económicamente importantes de alimento importante y los cultivos de fibra (revisado por 9,10,16). Estos virus no se multiplican en su vector, pero sin embargo se mueven fácilmente a partir de una planta a otra por la mosca blanca adulta por diversos medios (revisado por 2,6,7,9,10,11,17). Para la mayoría de estos virus alimentación mosca blanca se requiere para la adquisición e inoculación, mientras que para otros se requiere sólo de sondeo. Muchos de estos virus no pueden o no pueden ser fácilmente transmitidos por otros medios. Por lo tanto, el mantenimiento de cultivos de virus, biológicos y caracterización molecular (identificación de rango de hospedantes y síntomas) 3,13, Ecología 2,12, requiere que los virus se transmiten a los hosts experimentales utilizando el vector de mosca blanca. Además del desarrollo de nuevos métodos de gestión, tales como la evaluación de nuevas sustancias químicas o compuestos 14 15, nuevos enfoques culturales 1,4,19, o la selección y el desarrollo de cultivares resistentes 7,8,18, requiere el uso de la mosca blanca de la transmisión del virus. El uso de la transmisión de la mosca blanca de los virus de las plantas de selección y desarrollo de cultivares resistentes en los programas de mejoramiento es particularmente desafiante 7. Selección eficaz y la detección de la resistencia emplea un gran número de plantas y hay una necesidad para el 100% de las plantas para ser inoculados con el fin de encontrar los pocos genotipos que poseen genes de resistencia. Estos estudios utilizan un gran número de moscas blancas virulíferos, a menudo varias veces por año. Mantenimiento Mosca Blanca descrito aquí puede generar cientos o milesde moscas blancas adultas de las plantas a la semana, durante todo el año, sin la contaminación de otros virus de plantas. Las plantas libres de las dos moscas blancas y virus deben ser producidos a introducir en la colonia de mosca blanca cada semana. Mosca Blanca culturas deben mantenerse libres de patógenos, parásitos, moscas blancas y parasitoides que pueden reducir las poblaciones de mosca blanca y / o reducir la eficiencia de la transmisión del virus. Las colonias producidas en la forma descrita se puede escalar rápidamente para aumentar o disminuir las cifras de población, según sea necesario, y se pueden ajustar para adaptarse a las preferencias de alimentación de la base de mosca blanca en la planta huésped del virus. Hay dos tipos básicos de colonias de mosca blanca que se pueden mantener: un nonviruliferous y una colonia virulífero mosca blanca. La colonia nonviruliferous se compone de moscas blancas criadas en las plantas libres de virus y permite la disponibilidad semanal de moscas blancas que pueden ser utilizados para transmitir los virus a partir de diferentes cultivos. La colonia viruliferous mosca blanca,compuesto de moscas blancas criadas en plantas infectadas por virus, permite disponibilidad semanal de moscas blancas que han adquirido el virus omitiendo por lo tanto un paso en el proceso de transmisión del virus.

Estos métodos para el establecimiento de colonias de mosca blanca y el mantenimiento, así como la manipulación de transmitir los virus de plantas se han utilizado con éxito en una serie de estudios 4,11,12,14, así como otros muchos no citados. El uso de estos métodos con los virus transmitidos persistentemente, hemos obtenido rutinariamente las tasas deseadas de transmisión de 100% para la selección para la resistencia, el cribado insecticidas por su capacidad para interferir con la transmisión (y evaluación de compuestos que inducen resistencia) 13,14,17,18 ( la Figura 9). Los procedimientos descritos aquí pueden ser y han sido adaptados a muchos lugares en los centros públicos y privados de investigación. <table border="1"><tbody><tr><td> Tipo de Cambio </td><td> Período de acceso Adquisición (horas) </td><td> Período de acceso inoculación (horas) </td><td> Ref.. </td></tr><tr><td> No persistente </td><td> 1 </td&gt; <td> 2-24 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Semipersistentes </td><td> 6-24 </td><td> 8-24 </td><td> 10, 16 </td></tr><tr><td> Persistente </td><td> 48-72 </td><td> 48-72 </td><td> 3, 6, 8, 9 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Tiempos estimados que se pueden utilizar para producir altas tasas de transmisión de virus con diferentes tipos de relaciones con sus vector especies Bemisia tabaci complejos. Duración estimada se basa en tiempos mínimos públicos que se exigen para la transmisión de 80-100% y modificado en algunos casos para tener en cuenta los períodos de latencia y las diferencias entre poblaciones de mosca blanca, virus, y las plantas anfitrionas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig1.jpg" /> Figura 1. Un ejemplo de una colonia virulífero mosca blanca. Esta cámara de crecimiento contiene jaulas de plantas infectadas con un begomovirus y INFEsted con moscas blancas virulíferos. <img alt="La figura 2" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig2.jpg" /> Figura 2. Izquierda: inmaduros etapas de la mosca blanca, Bemisia tabaci MEAM clado sensu De Barro 6 aproximadamente 1 semana después de la aparición y la derecha: un adulto de mosca blanca, un vector eficaz de muchos virus de plantas. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4332/4332fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig3.jpg" /> Figura 3. Tipos de dispositivos de recogida que pueden ser utilizados para recoger las moscas blancas para la transmisión de virus de plantas. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig4.jpg" /> La Figura 4. Izquierda: Tarjeta de plástico amarillo utilizado para recoger los adultos de mosca blanca que muestran moscas blancas listas para la recolección<html> . Derecha: Recogida de la mosca blanca de una tarjeta de plástico amarillo. Las moscas blancas se pueden ver en la tarjeta como pequeñas manchas blancas / gris. <img alt="La figura 5" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig5.jpg" /> Figura 5. Las moscas blancas recogieron por aspiración (20 en un vial) de la colonia listo, ya sea para la adquisición o la inoculación. <img alt="La figura 6" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4332/4332fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig6.jpg" /> La Figura 6. Superior izquierda:. Jaulas de plantas individuales utilizados, ya sea para la adquisición o inoculación superior derecha: jaulas más grandes hechas de tubos de pvc y organza. Inferior: Aluminio / pantalla y jaulas organdí en algunas plantas que contienen gases destinados a una colonia de mosca blanca. 32fig7.jpg &quot;/&gt; Figura 7. Las moscas blancas siendo transferidos a una sola planta para la inoculación (o adquisición). <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig8.jpg" /> Figura 8. La adición de un insecticida sistémico drench al terminar el período de acceso inoculación mosca blanca. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig9.jpg" /> La Figura 9. Coloque las plantas en evaluación para la resistencia al virus del rizado amarillo del tomate. Todas las plantas fueron inoculadas en un 5 semanas de edad, las plantas de semillero y luego trasplantadas al campo para su evaluación. Las plantas en el primer plano son una línea de germoplasma resistente, las plantas en el fondo son la línea de germoplasma susceptible.

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Transmitting Plant Viruses Using Whiteflies

Mejorar nuestra comprensión y nuestra capacidad para gestionar muchos de los virus de las plantas transmitidas por insectos requiere el uso del vector. La transmisión por insectos de los virus de plantas es una interacción tritrófica, y como tal, requiere la manipulación de los insectos, virus, y de plantas. Vectores deberán ser criados en grandes números y manipulados de tal manera como para asegurar altas tasas de transmisión a las plantas de prueba. Los fundamentos de la cría y la manipulación de la mosca blanca,<em&gt; Bemisa tabaci</em&gt; (<em&gt; Hemiptera: Aleyrodidae</em&gt;), Se presenta un vector de virus de plantas pertenecientes a varios géneros emergentes virus de planta, lo que representa un gran número de virus económicamente importantes.

La transmisión de los virus de plantas usando moscas blancas

Whiteflies, Hemiptera: Aleyrodidae, Bemisia tabaci, a complex of morphologically indistinquishable species5, are vectors of many plant viruses. Several ...

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Research

JoVE Journal

Biology

28.7K vistas.  University of Florida. Mejorar nuestra comprensión y nuestra capacidad para gestionar muchos de los virus de las plantas transmitidas por insectos requiere el uso del vector. La transmisión por insectos de los virus de plantas es una interacción tritrófica, y como tal, requiere la manipulación de los insectos, virus, y de plantas. Vectores deberán ser criados en grandes números y manipulados de tal manera como para asegurar altas tasas de transmisión a las plantas de prueba. Los fundame...

Video: Transmitting Plant Viruses Using Whiteflies

Testing the Physiological Barriers to Viral Transmission in Aphids Using Microinjection

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When an uninfected aphid feeds on an infected plant it contracts the virus through the plant phloem. Once ingested, the virus must pass from the insect gut to the hemolymph (the insect  blood ) and then must pass through the salivary gland, in order to be transmitted back to a new plant. An aphid may take up different viruses when munching on a plant, however only a small fraction will pass through the gut and salivary gland, the two main barriers for transmission to infect more plants. In the lab, we use physalis plants to study PLRV transmission. In this host, symptoms are characterized by stunting and interveinal chlorosis (yellowing of the leaves between the veins with the veins remaining green). The video that we present demonstrates a method for performing aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut is preventing viral transmission.
The video that we present demonstrates a method for performing Aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut or salivary gland is preventing viral transmission.

Aphids are effective transmitters of plant viruses. Aphid microinjection of virus, the procedure we will show you today, is a technique allowing researchers to inject virus directly into the hemocoel of the aphid, bypassing the gut, one of the 2 major barriers for virus transmission in a circulative manner. The same technique is also used to inject dsRNA for RNAi.

Prueba de las barreras fisiológicas a la transmisión del virus en los áfidos con microinyección

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When ...

Investigación

Biología

Testing Nicotine Tolerance in Aphids Using an Artificial Diet Experiment

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well know to have insecticidal properties. One response of tobacco plants to herbivory, or being gnawed upon by insects, is to increase the production of this neurotoxic alkaloid. Here, we will demonstrate how to set up an experiment to address this question of whether a tobacco-adapted strain of the green peach aphid, Myzus persicae, can tolerate higher levels of nicotine than the a strain of this insect that does not infest tobacco in the field.

In this video and assay is demonstrated that tests the tolerance of nicotine to two types of aphids one that infests tobacco plants in the field and one that does not.

Prueba de tolerancia a la nicotina en los áfidos El uso de un experimento de una dieta artificial

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well ...

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Inducida por el virus de silenciamiento génico (VIGS) en Nicotiana benthamiana Y tomate

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Perfiles de Polímeros Glycan la pared celular vegetal utilizando microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

De Alto Rendimiento La titulación de luciferasa que expresan virus recombinantes

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, several traits are typically characterized using molecular assays to aid in epidemiological studies. These traits include species identification, insecticide resistance, parasite infection status, and host preference. Since populations of the Anopheles gambiae complex are morphologically indistinguishable, a polymerase chain reaction (PCR) is traditionally used to identify species. Once the species is known, several downstream assays are routinely performed to elucidate further characteristics. For instance, mutations known as KDR in a para gene confer resistance against DDT and pyrethroid insecticides. Additionally, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) or Plasmodium parasite DNA detection PCR assays are used to detect parasites present in mosquito tissues. Lastly, a combination of PCR and restriction enzyme digests can be used to elucidate host preference (e.g., human vs. animal blood) by screening the mosquito bloodmeal for host-specific DNA. We have developed a multi-detection assay (MDA) that combines all of the aforementioned assays into a single multiplex reaction genotyping 33SNPs for 96 or 384 samples at a time. Because the MDA includes multiple markers for species, Plasmodium detection, and host blood identification, the likelihood of generating false positives or negatives is greatly reduced from previous assays that include only one marker per trait. This robust and simple assay can detect these key mosquito traits cost-effectively and in a fraction of the time of existing assays.

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Un ensayo multi-detección para los mosquitos transmisores de la malaria

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

De alto rendimiento CRISPR vector de la construcción y caracterización de las modificaciones del ADN mediante la generación de raíces peludas tomate

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis of the screen is to generate a mutant population that can be screened with a phenotype of interest. EMS (ethyl methane sulfonate) is a commonly used alkylating agent for inducing random mutation in a classical forward genetic screen to identify multiple genes involved in any given process. Cytosolic calcium (Ca2+) elevation is a key early signaling pathway that is activated upon stress perception. However the identity of receptors, channels, pumps and transporters of Ca2+ is still elusive in many study systems. Aequorin is a cellular calcium reporter protein isolated from Aequorea victoria and stably expressed in Arabidopsis. Exploiting this, we designed a forward genetic screen in which we EMS-mutagenized the aequorin transgenic. The seeds from the mutant plants were collected (M1) and screening for the phenotype of interest was carried out in the segregating (M2) population. Using a 96-well high-throughput Ca2+ measurement protocol, several novel mutants can be identified that have a varying calcium response and are measured in real time. The mutants with the phenotype of interest are rescued and propagated till a homozygous mutant plant population is obtained. This protocol provides a method for forward genetic screens in Ca2+ reporter background and identify novel Ca2+ regulated targets.

A forward genetic screen based on Ca2+ elevation as a read-out leads to identification of genetic components involved in calcium dependent signaling pathways in plants.

Antaño de la pantalla genética utilizando la aequorin de la reportera transgénica de calcio para identificar nuevas metas en la señalización del calcio

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...

High-Throughput Analysis of Non-Photochemical Quenching in Crops Using Pulse Amplitude Modulated Chlorophyll Fluorometry

Photosynthesis is not optimized in modern crop varieties, and therefore provides an opportunity for improvement. Speeding up the relaxation of non-photochemical quenching (NPQ) has proven to be an effective strategy to increase photosynthetic performance. However, the potential to breed for improved NPQ and a complete understanding of the genetic basis of NPQ relaxation is lacking due to limitations of oversampling and data collection from field-grown crop plants. Building on previous reports, we present a high-throughput assay for analysis of NPQ relaxation rates in Glycine max (soybean) using pulse amplitude modulated (PAM) chlorophyll fluorometry. Leaf disks are sampled from field-grown soybeans before transportation to a laboratory where NPQ relaxation is measured in a closed PAM-fluorometer. NPQ relaxation parameters are calculated by fitting a bi-exponential function to the measured NPQ values following a transition from high to low light. Using this method, it is possible to test hundreds of genotypes within a day. The procedure has the potential to screen mutant and diversity panels for variation in NPQ relaxation, and can therefore be applied to both fundamental and applied research questions.

The protocol introduces a high-throughput method for measuring the relaxation of non-photochemical quenching by pulse amplitude modulated chlorophyll fluorometry. The method is applied to field-grown Glycine max and can be adapted to other species to screen for genetic diversity or breeding populations.

Análisis de alto rendimiento del enfriamiento no fotoquímico en cultivos mediante fluorometría de clorofila modulada por amplitud de pulso

Photosynthesis is not optimized in modern crop varieties, and therefore provides an opportunity for improvement. Speeding up the relaxation of ...

Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the plant. Many sophisticated techniques have been developed to measure these properties; however, atomic force microscopy (AFM) remains the most convenient for studying cell wall elasticity at the cellular level. One of the most important limitations of this technique has been that only superficial or isolated living cells can be studied. Here, the use of atomic force microscopy to investigate the mechanical properties of primary cell walls belonging to the internal tissues of a plant body is presented. This protocol describes measurements of the apparent Young&#39;s modulus of cell walls in roots, but the method can also be applied to other plant organs. The measurements are performed on vibratome-derived sections of plant material in a liquid cell, which allows (i) avoiding the use of plasmolyzing solutions or sample impregnation with wax or resin, (ii) making the experiments fast, and (iii) preventing dehydration of the sample. Both anticlinal and periclinal cell walls can be studied, depending on how the specimen was sectioned. Differences in the mechanical properties of different tissues can be investigated in a single section. The protocol describes the principles of study planning, issues with specimen preparation and measurements, as well as the method of selecting force-deformation curves to avoid the influence of topography on the obtained values of elastic modulus. The method is not limited by sample size but is sensitive to cell size (i.e., cells with a large lumen are difficult to examine).

Studies of cell wall biomechanics are essential for understanding plant growth and morphogenesis. The following protocol is proposed to investigate thin primary cell walls in the internal tissues of young plant organs using atomic force microscopy.

Caracterización de las propiedades mecánicas de la pared celular primaria en órganos vegetales vivos mediante microscopía de fuerza atómica

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the ...