Los autores desean agradecer a los Dres. Wenjun Li y Daniel Kreisel (Escuela Universitaria de Medicina de Washington en St. Louis) por su ayuda en la formación de la cirugía. RYL es apoyada por los Institutos Nacionales de Salud de subvención R01 DK068057 y el Fondo de Investigación del Presidente de la Universidad de Saint Louis.

1. Preparación de células Notas: 1) RPMI 1640 completo basado en la cultura receta medios (500 ml) contiene 435 ml RPMI 1640, 50 ml de FBS inactivado por calor, los aminoácidos no esenciales 5 ml, piruvato de sodio 5 ml, 5 ml de antibiótico antimicótico; 2) lugar matrigel a 4 º C un día antes de la recogida de células. <ol><li> Línea celular humana ATC THJ-11T 8 se cultivan en placas de cultivo de 6 pocillos y se cosechan una vez que el 80-90% de confluencia. </li><li> Precipitar las células por centrifugación a 200 g durante 4 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Aspirar los medios de comunicación y las células se resuspenden en medio RPMI 1640 [2 ml / placa de 6]. </li><li> Tome un pequeño volumen de la suspensión de células, añadir a un volumen de 0,4% de colorante azul tripán y determinar la densidad celular usando TC10 contador de células automatizado. </li><li> Calcular el volumen de suspensión celular necesario para obtener 5 x 10 5 células / ratón veces los ratones número inyectables. </li></ol> Nota: Para garantizar la publicidad<html> equiparar suspensión celular para inyección, preparar células como si se inyecta el doble del número de los ratones (por ejemplo, si la inyección de 5 ratones, a continuación, preparar la suspensión celular como si estuviera inyectando 10 ratones). <ol start="6"><li> Transferencia volumen necesario de la suspensión celular en un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Precipitar las células por centrifugación a 200 g durante 4 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Aspirar los medios de comunicación y las células se resuspenden en RPMI completo 1640. </li><li> Transfiera las células a un tubo de 1,6 ml, añadir 1 volumen de matrigel y mezclar suavemente con la pipeta lentamente dentro y fuera. </li></ol> Nota: Cada ratón recibirá 10 l de la suspensión / matrigel cóctel celular. Dado que las células 5 x 10 5 en suspensión en un volumen de 10 l inyectable se han utilizado con éxito en anteriores estudios de ATC ortotópico 9-10, utilizamos los parámetros en este informe. <ol start="10"><li> Coloque suspensión de células en hielo hasta que esté listo para su uso. </li></ol>_title Preparación &quot;&gt; 2 Mouse. <ol><li> Limpiar la zona quirúrgica, que incluye el microscopio de disección y el área circundante, limpiando todas las superficies con etanol al 70%. </li><li> Encienda las lámparas / almohadillas térmicas, donde los animales se recuperan de la cirugía. </li><li> Administrar 0,1 ml de ketamina / xilazina (cóctel de fármacos que consta de ketamina 9 mg / ml y xilazina 1mg/ml) por 10 g de peso corporal por vía intraperitoneal utilizando un 1 ml, 27G ½ &quot;jeringa de tuberculina. </li><li> Preparación para la cirugía del ratón: 1) afeitarse región del cuello de ratón (de la línea de la mandíbula hacia arriba del esternón y fuera de los brazos), 2) frote el área quirúrgica tres veces con chorhexadine cuadrados de gasa empapados, 3) scrub último hecho con betadine gasa empapada, 4 ) aplicar suavemente pomada para los ojos para evitar que los ojos se sequen. </li><li> Compruebe reflejo pedal para garantizar ratón está sedado adecuadamente. </li><li> Coloque animal en decúbito dorsal sobre una barrera de campo estéril desechable bajo el microscopio de disección y asegurar al animal en su lugar con cinta de tela. </li><li> Manos y pi Scrubsingernails a continuación, poner los guantes quirúrgicos estériles. </li><li> De una manera estéril, la cirugía abierta empacar y organizar instrumentos. </li><li> Coloque paño estéril sobre animales, dejando solo sitio quirúrgico expuesto. </li></ol> 3. Surgical Acceso a la tiroides y la inyección de células <ol><li> El uso de un estéril, desechable bisturí, hacer una incisión longitudinal de 1 a 1,5 cm a lo largo de la línea media de la garganta. </li></ol> Nota: La desviación de la línea media complica más profundo de corte para acceder a la tráquea. Bastante incisión precisa le permite tomar el pelo y cortar a través del tejido membranoso que sostiene glándulas salivales izquierdo y derecho y reduce la probabilidad de mellar o cortar grandes arterias. <ol start="2"><li> Hacer una segunda incisión en los músculos que rodean la correa de la tráquea a continuación, tire de la parte derecha de la incisión del músculo a un lado para exponer la glándula tiroides derecha. </li><li> Hemostats se pueden utilizar en este momento para mantener la capa muscular de unparte para facilitar el acceso a la glándula tiroides (Figura 1). </li></ol> Nota: Como alternativa, si el procedimiento realizado por dos miembros del personal quirúrgico, la capa muscular puede simplemente ser retenido con una pinza mientras una jeringa inyectable lista se entrega al cirujano por el personal de asistencia. <ol start="4"><li> Inyecte lentamente 10 l de suspensión celular en la glándula tiroides a la derecha con una &quot;jeringa de insulina 31G 5/16 a continuación, retire con cuidado la aguja. </li></ol> 4. Clausura del sitio quirúrgico y la recuperación del ratón <ol><li> Capa muscular de sutura con 6,0 material de sutura utilizando ya sea un estilo sutura continua o interrumpida. </li><li> Puntada de la piel de la misma manera. </li><li> Aplicar una capa de ungüento antibiótico triple directamente sobre sitio de la incisión. </li><li> Permitir animal pueda recuperarse en decúbito dorsal sobre almohadilla térmica. Una vez animal puede lograr decúbito esternal sin ayuda, que puede ser colocado de nuevo con otros ratones. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Monitoreo Post-operatorio y la recogida de tejidos <ol><li> Revise el sitio de la incisión y la salud general de los animales todos los días durante una semana después de la cirugía, a continuación, comprobar una vez por semana. Si las suturas están todavía intactas después de 14 días, se retiran. </li></ol> Nota: Los animales que presentan signos de deterioro de la salud (por ejemplo, pérdida de peso sustancial, el cabello desaliñado, dificultad para respirar) deben ser sacrificados y los tejidos tomados. <ol start="2"><li> Una vez que los ratones han llegado a un punto de tiempo después de la operación predeterminada, administrar ketamina / xilazina como se ha descrito anteriormente para sedar. </li><li> Perfundir animales intracardiaca y la cosecha de tiroides / tráquea y otros tejidos de interés (no descrita en detalle aquí). </li></ol>

<ol>
	<li>Bibby, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+models+of+cancer+for+preclinical+drug+evaluation:+advantages+and+disadvantages.">Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation: advantages and disadvantages.</a> Eur. J. Cancer. 40, 852-857 (2004).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+metastatic+mouse+models+for+anticancer+drug+discovery+and+evaluation:+a+bridge+to+the+clinic.">Orthotopic metastatic mouse models for anticancer drug discovery and evaluation: a bridge to the clinic.</a> Invest. New Drugs. 17, 343-359 (1999).</li><li>Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+models+are+necessary+to+predict+therapy+of+transplantable+tumors+in+mice.">Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice.</a> Cancer Metastasis Rev. 17, 279-284 (1998).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthotopic+model+of+anaplastic+thyroid+carcinoma+in+athymic+nude+mice.">An orthotopic model of anaplastic thyroid carcinoma in athymic nude mice.</a> Clin. Cancer Res. 11, 1713-1721 (2005).</li><li>Nucera, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+orthotopic+mouse+model+of+human+anaplastic+thyroid+carcinoma.">A novel orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid carcinoma.</a> Thyroid. 19, 1077-1084 (2009).</li><li>Todaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumorigenic+and+metastatic+activity+of+human+thyroid+cancer+stem+cells.">Tumorigenic and metastatic activity of human thyroid cancer stem cells.</a> Cancer Res. 70, 8874-8885 (2010).</li><li>Tran Cao, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+tumor+progression+in+a+fluorescent+orthotopic+mouse+model+of+thyroid+cancer.">Real-time imaging of tumor progression in a fluorescent orthotopic mouse model of thyroid cancer.</a> Anticancer Res. 30, 4415-4422 (2010).</li><li>Marlow, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+molecular+fingerprinting+of+four+new+anaplastic+thyroid+carcinoma+cell+lines+and+their+use+for+verification+of+RhoB+as+a+molecular+therapeutic+target.">Detailed molecular fingerprinting of four new anaplastic thyroid carcinoma cell lines and their use for verification of RhoB as a molecular therapeutic target.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 95, 5338-5347 (2010).</li><li>Nehs, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+Intervention+with+anti-BRAF+(V600E)+therapy+induces+tumor+regression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+human+anaplastic+thyroid+cancer.">Late Intervention with anti-BRAF (V600E) therapy induces tumor regression in an orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid cancer.</a> Endocrinology. 153, 985-994 (2012).</li><li>Nucera, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+BRAFV600E+with+PLX4720+displays+potent+antimigratory+and+anti-invasive+activity+in+preclinical+models+of+human+thyroid+cancer.">Targeting BRAFV600E with PLX4720 displays potent antimigratory and anti-invasive activity in preclinical models of human thyroid cancer.</a> Oncologist. 16, 296-309 (2011).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En nuestro modelo, los animales demostraron metástasis de tumores de tiroides y enfermedad relacionada con la caquexia y angustia respiratoria por 4 semanas después de la inyección. Al igual que con la mayoría de otros modelos ortotópico utilizando el suministro por inyección de una suspensión de células, la inyección en los tejidos circundantes y las fugas después de la inyección, que se propaga más allá del objetivo son posibles. Con eso se dice, se desconoce el potencial reconocible producida por este procedimiento es el efecto de la exposición de destino fuera de metástasis o complicaciones no relacionadas con la enfermedad. Esta es una preocupación general con la mayoría de los trasplantes de xenográfico, independientemente de la enfermedad que está siendo investigado. Sin embargo, las consecuencias no intencionadas de la metástasis pueden ser minimizados significativamente por asegurar todo el bisel de la punta de la aguja ha penetrado la membrana perfectamente superposición de la glándula tiroides y expulsar lentamente la suspensión celular. Si se observa fugas durante o después de la inyección, los animales pueden ser omitidos del estudio. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Es esencial que los animales se sometieron a perfusión antes de la recolección de la tiroides / tráquea y otros tejidos. Morfología de los tejidos y la integridad Los beneficios son dobles, 1) las células rojas de la sangre se purgarán y no saturar las muestras histológicas y 2) se conservan. Además, resecado tiroides / tráquea que tienen ya sea una masa tumoral unido o están enterrados dentro de ella se debe cortar de una manera que puntos de referencia anatómicos pueden ser identificados antes de ser incorporado para la preparación histológica. Esto reducirá drásticamente el tiempo de preparación de la muestra. En este informe se describe el crecimiento local y la invasión del tumor de tiroides avanzado después de la inyección ortotópico de células ATC. ATC metástasis puede ser investigada mediante el análisis de preparaciones histológicas de otros tejidos, utilizando tinciones histológicas estándar, tales como hematoxilina y eosina, o mediante técnicas de inmunohistoquímica utilizando células o marcadores pertinentes patología. Este sistema puede ser desarrollado por genetically modificación de las células del cáncer de tiroides con los reporteros de fluorescencia de modo que imágenes en vivo puede ser usado para monitorear la metástasis y la eficacia de los tratamientos terapéuticos.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640 cell culture media</td>
 <td>Mediatech</td>
 <td>10-041-CV</td>
 <td>Media and additives used depend on cell line</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TC10 Automated Cell Counter</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>145-0001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Matrigel</td>
 <td>Becton, Dickinson and Company</td>
 <td>354234</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Graefe Forceps, Serrated; Slight Curve, 4"</td>
 <td>Roboz</td>
 <td>RS-5135</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disposable scalpel, No. 15</td>
 <td>Feather</td>
 <td>2975#15</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Olsen Hegar Needle Holder - 4 &frac12;" delicate serrated</td>
 <td>gSource</td>
 <td>gS 21.5400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-0 nylon black monofilament suture</td>
 <td>Surgical Specialties Corporation</td>
 <td>1279B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heating Pad, reusable, 8" x 12"</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cloth tape, 1" X 10 yds</td>
 <td>Medline</td>
 <td>MIINON260101</td>
 <td>For restraining anesthetized mouse</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peanut Clipper/Trimmer</td>
 <td>Wahl</td>
 <td>8655</td>
 <td>For removing hair from surgical site</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ChlorHex-Q SCRUB 2%</td>
 <td>Penn Veterinary Supply</td>
 <td>VED1222</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Betadine</td>
 <td>Henry Schein Company</td>
 <td>6906727</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petrolatum ophthalmic ointment</td>
 <td>Dechra Veterinary Products</td>
 <td>17033-211-38</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 x 2 gauze, 12-ply</td>
 <td>Butler Animal Health Supply</td>
 <td>6936</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile Field, Barrier, 18" x 26"</td>
 <td>Busse</td>
 <td>696</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Drapes (CSR Wrap)</td>
 <td>Cardinal Health</td>
 <td>AT 21 412</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>27G &frac12;" needle</td>
 <td>Becton, Dickinson and Company</td>
 <td>309623</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>31G 5/16" needle</td>
 <td>Becton, Dickinson and Company</td>
 <td>328438</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ketamine (9 mg/ml) / xylazine (1 mg/ml) solution</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Triple antibiotic ointment</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

an orthotopic mouse model of anaplastic thyroid carcinoma

Se han establecido varios tipos de modelos animales de carcinomas de tiroides humanos, incluyendo subcutánea xenoinjerto y la implantación ortotópica de las células cancerosas en ratones inmunodeficientes. Modelos de xenoinjertos subcutáneos han sido valiosos para la detección y evaluación de nuevos tratamientos terapéuticos preclínicos. Hay un número de ventajas a la utilización de un modelo subcutáneo; 1) rápido, 2) reproducibles, y 3) el establecimiento del tumor, el crecimiento, y la respuesta a los agentes terapéuticos pueden ser verificados por la inspección visual. Sin embargo, la evidencia sustancial ha arrojado luz sobre las defi-ciencias de los modelos de xenoinjertos subcutáneos 1-3. Por ejemplo, los tratamientos medicinales que demuestran propiedades curativas en los modelos de xenoinjertos subcutáneos a menudo no tienen un impacto notable en la enfermedad humana. El microambiente del sitio de trasplante xenográfico o inyección se encuentra en el corazón de esta disimilitud. Modelos de xenoinjertos de tumor ortotópico proporcionan una más Biologicamente contexto pertinente para estudiar la enfermedad. Las ventajas de la implantación de las células enfermas o tejidos en su anatómica equivalente origen dentro de un animal huésped incluye un sitio adecuado para interacciones tumor-huésped, el desarrollo de metástasis relacionados con la enfermedad y la capacidad de examinar la influencia específica de sitio en remedios terapéuticos en investigación. Por lo tanto, los modelos de xenoinjertos ortotópico albergan valor mucho más clínica, ya que cerca se reproducen las enfermedades humanas. Por estas razones, un número de grupos han tomado ventaja de un modelo ortotópico de cáncer de tiroides como una herramienta de investigación 4-7. Aquí se describe un enfoque que establece un modelo ortotópico para el estudio de carcinoma de tiroides anaplásico (ATC), que es altamente invasiva, se resiste al tratamiento, y es mortal en prácticamente todos los pacientes diagnosticados. ATC células cultivadas se prepararon como una suspensión celular disociada en una solución que contiene una matriz de membrana basal. Un pequeño volumen es lenta injeja en la glándula tiroidea derecha. La apariencia general y la salud de los ratones se controlan para asegurar complicaciones post-operatorias y mínimos para medir penetrancia patológica del cáncer. Los ratones se sacrificaron a las 4 semanas, y los tejidos se recogieron para el análisis histológico. Los animales pueden ser tomadas en puntos de tiempo después de examinar más la progresión de avance de la enfermedad. La producción de este modelo de ratón ortotópico establece una plataforma que cumple dos objetivos: 1) promover la comprensión de la patología ATC, y 2) la pantalla agentes terapéuticos actuales y futuros para la eficacia en la lucha contra el ATC.

No se detectaron 19 tumores tiroideos invasoras de un total de 20 ratones inyectados con células ATC después de 4 semanas. En el ejemplo mostrado en la figura 2A, los ratones que recibieron una inyección ortotópica de células ATC 5X10 5 cultivados bajo condiciones adjuntos, exhiben infiltración significativa de células cancerosas dentro de la tiroides por 4 semanas después de la inyección. La naturaleza de las células invasoras ATC con una característica de las células fusiformes y células a medio y de tamaño gigante con citoplasma eosinófilo y núcleos grandes se verificó mediante hematoxilina y eosina (H &amp; E) tinción. Para la comparación, la tiroides y la tráquea de un animal de control no inyectado se muestra en la Figura 2B. Los folículos del animal no inyectada mostrar su fin, sin embargo, suelta, de asociación y tienen esencialmente una morfología redonda. Debido al pequeño tamaño de la tiroides y el uso de suministro por inyección, pueden surgir los efectos no deseados. Figura 3A ilustra lamás comúnmente observada, que es el desarrollo de una masa tumoral fuera, pero no abarca la tiroides. Esto es más que probable debido a la penetración de la aguja a través y más allá de la tiroides cuando se expulsan las células. Ocasionalmente, los ratones que presentan sin crecimiento del tumor, tanto macroscópica e histológicamente, se detectan como se muestra en la Figura 3B. Ausencia de desarrollo del tumor detectable puede ser causada por la expulsión de la suspensión de células desde el sitio de inyección y difusión en los tejidos y las cavidades vecinas. <img src="/files/ftp_upload/50097/50097fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. La exposición de la tiroides. Las etiquetas indican las glándulas tiroides derecha e izquierda que flanquean la tráquea. <img src="/files/ftp_upload/50097/50097fig2.jpg" alt="La figura 2"/> Figura 2. El examen histológico de crecimiento del tumor y eninvasión de tiroides después de la inyección con éxito. Las muestras de tejido se seccionaron a lo largo del plano coronal. A) Imagen tomada a 200X de ratón exhibe crecimiento sustancial del tumor con las células fusiformes característicos y las células a medio y de tamaño gigante con citoplasma eosinófilo y núcleos grandes en hematoxilina y eosina ( H &amp; E) tinción Tu indica la lesión primaria a partir de la cual las células tumorales invaden la tiroides B) la tráquea y de la tiroides de control de animales (imagen tomada a 100X) Tu, tumores;... S, músculo liso; Tr, la tráquea; Thy, glándula tiroides. <img src="/files/ftp_upload/50097/50097fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Los resultados no intencionales de la inyección ortotópica. Muestras de tejido fueron seccionadas por el plano coronal. A) el crecimiento del tumor periférico sin crecimiento evidente en la tiroiditisd (flecha negro, imagen tomada a 100X). B) La falta de detección de tumores en bruto (no mostrado) o el examen histológico (imagen tomada en 50X). Thy, la glándula tiroides.

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An Orthotopic Mouse Model of Anaplastic Thyroid Carcinoma

Generación de un modelo de ratón ortotópico de carcinoma de tiroides anaplásico se describe aquí. Esta técnica emplea la colocación quirúrgica de las células de cáncer de tiroides anaplásico humanos dentro de la tiroides de los ratones inmunodeficientes, creando así un entorno más clínicamente relevante para estudiar la progresión de la enfermedad, así como de pantalla intervenciones terapéuticas innovadoras.

Un modelo de ratón ortotópico de carcinoma de tiroides anaplásico

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

21.0K vistas.  Saint Louis University School of Medicine. Generación de un modelo de ratón ortotópico de carcinoma de tiroides anaplásico se describe aquí. Esta técnica emplea la colocación quirúrgica de las células de cáncer de tiroides anaplásico humanos dentro de la tiroides de los ratones inmunodeficientes, creando así un entorno más clínicamente relevante para estudiar la progresión de la enfermedad, así como de pantalla intervenciones terapéuticas innovadoras.

Video: An Orthotopic Mouse Model of Anaplastic Thyroid Carcinoma

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

Un modelo ortotópico de cáncer de vejiga murino

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

Investigación

Medicina

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotón imágenes de invasión de células tumorales en un modelo de ratón ortotópico de carcinoma oral de células escamosas

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Combination Radiotherapy in an Orthotopic Mouse Brain Tumor Model

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the understanding of the mechanics of tumor invasion, and direct intracerebral inoculation of tumor provides the opportunity of observing the invasive process in a physiologically appropriate environment2. As far as human brain tumors are concerned, the orthotopic models currently available are established either by stereotaxic injection of cell suspensions or implantation of a solid piece of tumor through a complicated craniotomy procedure3. In our technique we harvest cells from tissue culture to create a cell suspension used to implant directly into the brain. The duration of the surgery is approximately 30 minutes, and as the mouse needs to be in a constant surgical plane, an injectable anesthetic is used. The mouse is placed in a stereotaxic jig made by Stoetling (figure 1). After the surgical area is cleaned and prepared, an incision is made; and the bregma is located to determine the location of the craniotomy. The location of the craniotomy is 2 mm to the right and 1 mm rostral to the bregma. The depth is 3 mm from the surface of the skull, and cells are injected at a rate of 2 &mu;l every 2 minutes. The skin is sutured with 5-0 PDS, and the mouse is allowed to wake up on a heating pad. From our experience, depending on the cell line, treatment can take place from 7-10 days after surgery. Drug delivery is dependent on the drug composition. For radiation treatment the mice are anesthetized, and put into a custom made jig. Lead covers the mouse's body and exposes only the brain of the mouse. The study of tumorigenesis and the evaluation of new therapies for GBM require accurate and reproducible brain tumor animal models. Thus we use this orthotopic brain model to study the interaction of the microenvironment of the brain and the tumor, to test the effectiveness of different therapeutic agents with and without radiation.

The purpose of this article is to describe the use of an orthotopic glioblastoma model for chemoradiation studies. This article will go though cell processing, implanting, and radiotherapy of the mouse using an intracranial model.

Combinación de radioterapia en un modelo ortotópico de tumor cerebral del ratón

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the ...

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder tumor model. The mouse model is established by urethral catheterization under inhaled general anesthetic. Chemical burn is then introduced to the bladder mucosa using intravesical silver nitrate solution to disrupt the bladder glycosaminoglycan layer and allows cells to attach. Following several washes with sterile water, human bladder cancer KU-7-luc2-GFP cells are instilled through the catheter into the bladder to dwell for 2 hours. Subsequent growth of bladder tumors is confirmed and monitored by in vivo bladder ultrasound and bioluminescent imaging. The tumors are then treated intravesically with saRNA formulated in lipid nanoparticles (LNPs). Tumor growth is monitored with ultrasound and bioluminescence. All steps of this procedure are demonstrated in the accompanying video.

Establishing an orthotopic bladder tumor model to evaluate antitumor effects of intravesically delivered saRNA and monitoring tumor growth by ultrasound and bioluminescent imaging.

Un modelo de tumor vesical ortotópica y la Evaluación de tratamiento intravesical SARNA

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are needed. The tumor microenvironment can significantly influence tumor development and therapy response. It is therefore often desirable to grow tumor cells in the organ from which they originated. This protocol describes an orthotopic model of bladder cancer, in which MB49 murine bladder carcinoma cells are instilled into the bladder via catheterization. Successful tumor cell implantation in this model requires disruption of the protective glycosaminoglycan layer, which can be accomplished by physical or chemical means. In our protocol the bladder is treated with trypsin prior to cell instillation. Catheterization of the bladder can also be used to deliver therapeutics once the tumors are established. This protocol describes the delivery of an adenoviral construct that expresses a luciferase reporter gene. While our protocol has been optimized for short-term studies and focuses on gene delivery, the methodology of mouse bladder catheterization has broad applications.

Implantation of cancer cells into the organ of origin can serve as a useful preclinical model to evaluate novel therapies. MB49 bladder carcinoma cells can be grown within the bladder following intravesical instillation. This protocol demonstrates catheterization of the mouse bladder for the purpose of tumor implantation and adenoviral delivery.

Un modelo ortotópico de cáncer de vejiga de Estudios de liberación de genes

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

Bioluminescent Orthotopic Model of Pancreatic Cancer Progression

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%. New therapeutic options are critically needed and depend on improved understanding of pancreatic cancer biology. To better understand the interaction of cancer cells with the pancreatic microenvironment, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression. Luciferase-tagged pancreatic cancer cells are resuspended in Matrigel and delivered into the pancreatic tail during laparotomy. Matrigel solidifies at body temperature to prevent leakage of cancer cells during injection. Primary tumor growth and metastasis to distant organs are monitored following injection of the luciferase substrate luciferin, using in vivo imaging of bioluminescence emission from the cancer cells. In vivo imaging also may be used to track primary tumor recurrence after resection. This orthotopic model is suited to both syngeneic and xenograft models and may be used in pre-clinical trials to investigate the impact of novel anti-cancer therapeutics on the growth of the primary pancreatic tumor and metastasis.

Improved understanding of pancreatic cancer biology is critically needed to enable the development of better therapeutic options to treat pancreatic cancer. To address this need, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression using in vivo bioluminescence imaging.

Modelo ortotópico bioluminiscente de la progresión del cáncer de páncreas

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%.  New therapeutic options are critically needed and depend on improved ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Un modelo murino de cáncer de próstata humano Metástasis ortotópico

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology rely on the injection of a suspension of glioma cells into the brain parenchyma following incision of the dura-mater. Whereas the cells have to be injected superficially to be accessible to intravital two-photon microscopy, superficial injections fail to recapitulate the physiopathological conditions. Indeed, escaping through the injection tract most tumor cells reach the extra-dural space where they expand abnormally fast in absence of mechanical constraints from the parenchyma.
Our improvements consist not only in focally implanting a glioma spheroid rather than injecting a suspension of glioma cells in the superficial layers of the cerebral cortex but also in clogging the injection site by a cross-linked dextran gel hemi-bead that is glued to the surrounding parenchyma and sealed to dura-mater with cyanoacrylate. Altogether these measures enforce the physiological expansion and infiltration of the tumor cells inside the brain parenchyma. Craniotomy was finally closed with a glass window cemented to the skull to allow chronic imaging over weeks in absence of scar tissue development.
Taking advantage of fluorescent transgenic animals grafted with fluorescent tumor cells we have shown that the dynamics of interactions occurring between glioma cells, neurons (e.g. Thy1-CFP mice) and vasculature (highlighted by an intravenous injection of a fluorescent dye) can be visualized by intravital two-photon microscopy during the progression of the disease.
The possibility to image a tumor at microscopic resolution in a minimally compromised cerebral environment represents an improvement of current GBM animal models which should benefit the field of neuro-oncology and drug testing.

We have established a cortical orthotopic glioblastoma model in mice for intravital two-photon microscopy that recapitulates the biophysical constraints normally at play during the growth of the tumor. A chronic glass window replacing the skull above the tumor enables the follow-up of the tumor progression over time by two-photon microscopy.

El mantenimiento de un modelo de ratón ortotópico Glioblastoma Restricciones cerebral parenquimatosa físicas y Conveniente para intravital microscopía de dos fotones

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and highly vascularized, making it an ideal system for tumor implantation. Furthermore, the CAM contains extracellular matrix proteins such as fibronectin, laminin, collagen, integrin alpha(v)beta3, and MMP-2, making it an attractive model to study tumor invasion and metastasis. Scientists have long taken advantage of the physiology of the CAM by using it as a model of angiogenesis. More recently, the CAM assay has been modified to work as an in vivo xenograft model system for various cancers that bridges the gap between basic in vitro work and more complex animal cancer models. The CAM assay allows for the study of tumor growth, anti-tumor therapies, and pro-tumor molecular pathways in a biologically relevant system that is both cost- and time-effective. Here, we describe the development of CAM xenograft model of hepatocellular carcinoma (HCC) with embryonic survival rates of up to 93% and reliable tumor take leading to growth of three-dimensional, vascularized tumors.

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane CAM Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.

los<em&gt; En Ovo</em&gt; Chick corioalantoidea de membrana (CAM) Ensayo como un modelo de xenoinjerto eficiente de carcinoma hepatocelular

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

Dynamic Contrast Enhanced Magnetic Resonance Imaging of an Orthotopic Pancreatic Cancer Mouse Model

Dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) has been limitedly used for orthotopic pancreatic tumor xenografts due to severe respiratory motion artifact in the abdominal area. Orthotopic tumor models offer advantages over subcutaneous ones, because those can reflect the primary tumor microenvironment affecting blood supply, neovascularization, and tumor cell invasion. We have recently established a protocol of DCE-MRI of orthotopic pancreatic tumor xenografts in mouse models by securing tumors with an orthogonally bent plastic board to prevent motion transfer from the chest region during imaging. The pressure by this board was localized on the abdominal area, and has not resulted in respiratory difficulty of the animals. This article demonstrates the detailed procedure of orthotopic pancreatic tumor modeling using small animals and DCE-MRI of the tumor xenografts. Quantification method of pharmacokinetic parameters in DCE-MRI is also introduced. The procedure described in this article will assist investigators to apply DCE-MRI for orthotopic gastrointestinal cancer mouse models.

The goal of this protocol is to apply dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) for orthotopic pancreatic tumor xenografts in mice. DCE-MRI is a non-invasive method to analyze microvasculature in a target tissue, and useful to assess vascular response in a tumor following a novel therapy.