نشكر ميليسا Klocke للحصول على المساعدة وإعداد الشكل 1 راتليف آنا لبيان البروتوكول. وأيد هذا العمل من قبل هيئة البحوث للتقدم العلوم.

1. أنيبيب الانزلاق الفحص حلول للسهم إعداد مقايسة قبل مزلق. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتبلمر ميكروتثبول 0.5 مغ المسمى قليلة مع fluorophore العضوية مشرق 22. تركيز التسمية الهدف هو 1 ميكرون من fluorophore في أنيبيب، أو وضع العلامات من الكثافة ما يقرب من 1 في fluorophore dimers تويولين 1،500. متجر في ضوء الغرفة، ودرجة الحرارة حماية بورق الألمنيوم لمدة تصل إلى أسبوعين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية البيوتين-21 في كينيسين حوالي 1 ميكرومتر. المحل في -80 درجة مئوية في 5 ميكرولتر مأخوذة لاستخدامها في التجارب الفردية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مقايسة المخزن المؤقت (AB) من imidiazole 50 مم، 50 مم كلوريد البوتاسيوم (بوكل)، و 4 ملي كلوريد المغنيسيوم (MgCl 2)، 2 مم جلايكول الإثيلين tetraacetic حمض (EGTA)، ودرجة الحموضة 6.7. تصفية العقيمة وتخزينها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل الأبقار مصل الزلال المعقدة البيروكسيديز (البيوتين-BSA) إلى 2 ملغ / مل في AB. تصفية مع 0.2 ميكرون تصفية حقنة.المحل في -80 درجة مئوية في 100 ميكرولتر مأخوذة لفترات طويلة، في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل streptavidin (SA) إلى 10 ملغ / مل في AB. تصفية مع 0.2 ميكرون تصفية حقنة. المحل في -80 درجة مئوية في 20 ميكرولتر مأخوذة لفترات طويلة، في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل α-الكازين إلى 5 ملغ / مل في AB. تصفية مع 0.2 ميكرون تصفية حقنة. المحل في -80 درجة مئوية في 100 ميكرولتر مأخوذة لفترات طويلة، في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل dithiothreitol (DTT) في الماء منزوع الأيونات في 200 ملم. المحل في -20 درجة مئوية في 100 ميكرولتر مأخوذة، استخدم ساعة في غضون 8 من الذوبان. يمكن أن يكون أعيد تجميدها مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل باكليتاكسيل (PT) في الصف HPLC سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) في 4 مم. متجر في 10 ميكرولتر مأخوذة في -80 ° C المدى الطويل، -20 ° C على المدى القصير. استخدام في غضون 8 ساعات من الذوبان. يمكن أن يكون أعيد تجميدها مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل الجلوكوز في الماء منزوع الأيونات في 120 ملغ / مل. مخزن في 100 ميكرولتر مأخوذة في -20 ° C. يمكن أن يكون أعيد تجميدها مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ديسحل الأدينوساين ثلاثي (ATP) في الماء منزوع الأيونات في 150 مم، 7.0 درجة الحموضة. متجر في 5 ميكرولتر مأخوذة في -80 ° C، استخدم ساعة في غضون 8 من الذوبان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الأسهم 100X الأكسجين الكسح 25 بحلول حل 10000 أوكسيديز الجلوكوز وحدات وحدات و156،000 الكاتلاز إلى 600 ميكرولتر العازلة الفحص الإجمالي. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة في ميكروسنتريفوج إلى المواد الصلبة بيليه؛ طاف مرشح مع 0.2 ميكرون تصفية حقنة. المحل في -80 درجة مئوية في 10 ميكرولتر مأخوذة لفترات طويلة، في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. </li></ol> 2. أنيبيب الانزلاق الفحص، ونفس إعداد الحل اليوم إعداد الحلول في 2،1-2،6 في يوم التجربة. مع الممارسة، يمكن إعداد حلول 2،2-2،6 خلال تدفق خلايا الغسيل. ما لم يذكر خلاف ذلك، والحفاظ على حلول الأسهم على الجليد. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد AB، 1 مل من العازلة مقايسة مع 10 ميكرولتر من DTT الأسهم (AB مع DTT ملم 2). تبقي في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحيوي BSA العازلة، 40 &amp; مو؛ لتر من خليط 1:1 من المخزون البيوتين-BSA وAB. تبقي في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد BSA العازلة، خلط 645 ميكرولتر من AB مع 5.5 ميكرولتر BSA (1 ملغ / مل BSA في AB). تبقي في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد SA العازلة، والاختلاط 57 ميكرولتر من AB مع 3 streptavidin الأسهم ميكرولتر (0.5 ملغ / مل في streptavidin AB). تبقي في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد α-الكازين العازلة، خلط 200 ميكرولتر من العازلة BSA، و 50 ميكرولتر الأسهم الكازين، و 0.8 ميكرومتر ATP ميكرولتر من 15 (1 ملغ / مل α-الكازين، 0.8 ملغ / مل BSA، و 50 نانومتر في ATP AB). تبقي في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مضان مكافحة التبييض العازلة، والاختلاط 95 ميكرولتر العازلة الكازين-α، 2.5 ميكرولتر الجلوكوز المخزون، 1 ميكرولتر مزيج الأكسجين 100X الكسح، 1 ميكرولتر الأسهم باكليتاكسيل، 1 ميكرولتر 2-المركابتويثانول (βME). إضافة βME تحت غطاء محرك السيارة الدخان. استخدام مضان مكافحة التبييض عازلة داخل 1 ساعة إعداد تنبيه: βME شديد السمية ورائحة فظيعة. تأكد من فتح فقط تحت غطاء محرك السيارة الدخان. متجر في زجاجةغياب الضوء؛ ضوء يحط βME وقدرتها على خفض photobleaching. </li></ol> 3. أنيبيب الانزلاق الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بناء الممرات حول تدفق الأربع بين ساترة × 24 مم 60 و 22 × 22 مم باستخدام ساترة الشحوم فراغ، مقذوف من حقنة من خلال تلميح ماصة، كفاصل. يجب أن تكون كل حارة تدفق حوالي 10 ميكرولتر من حيث الحجم (حجم اللاحقة وفقا لذلك النطاق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل 10 ميكرولتر من العازلة الحيوي BSA في كل حارة. احتضان 5 دقائق للسماح للBSA معطف السطوح الزجاجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل كل حارة ثلاث مرات مع 15 ميكرولتر العازلة BSA لإزالة مجانا البيوتين-BSA، مع الاستمرار في منع سطح الشريحة. استخدام ورق الترشيح أو Kimwipe لإزالة العازلة من الجانب الآخر من الغرفة تدفق، ويجري التأكد من عدم السماح فقاعات الهواء من خلال الذهاب الى غرفة التدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل ميكرولتر 15 SA-العازلة في كل حارة. الانتظار 10 دقيقة، أو ساعة لتصل إلى 2. فإن streptavidin ربط BSA-البيوتين سطح محدد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل كل حارة ثلاث مرات مع 15 ميكرولتر العازلة BSA لإزالة مجانا SA مع الاستمرار في منع سطح الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل كل حارة مع 15-α العازلة ميكرولتر الكازين. α-الكازين يساعد منع مزيد غير محددة ملزمة للكينيسين وميكروتثبول على الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع كينيسين إلى 10 نانومتر في α-الكازين العازلة ويغسل كل حارة مع 15 ميكرولتر من هذا كينيسين - α-الكازين الحل. الانتظار 15 دقيقة (أو ما يصل إلى ساعة واحدة) لكينيسين المعقدة البيروكسيديز لربط تحديدا إلى streptavidin سطح محدد. والمحرك المجالات كينيسين تظل حرة في ربط الأنابيب الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع باكليتاكسيل إلى 40 ميكرومتر في درجة حرارة الغرفة α-الكازين العازلة، ويغسل كل حارة مع 15 ميكرولتر من هذا الحل لتغسل كينيسين الحرة ومسبقا تحميل كل غرفة تدفق بمحلول باكليتاكسيل لمنع ميكروتثبول من depolymerizing. depolymerizes الباردة أيضا ميكروتثبول، لذلك تأكد من هذه الخطوات تحدث في درجة حرارة الغرفة مع غرفة temperatuإعادة الحلول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع fluorescently المسمى ميكروتثبول 1:100-1:1،000 في مكافحة التبييض العازلة مضان مع ATP مم 1. غسل ميكرولتر 15 في مسار واحد ونلاحظ في غضون 30 دقيقة. </li></ol> 4. جمع البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة مزلق باستخدام المجهر مضان ميكروتثبول؛ مطلوب المجهر قادرة على حل واحد fluorophores مثل الإعداد TIRF تجارية أو بناء منزل-26 (الشكل 2). وينبغي دفع ميكروتثبول من قبل محركات كينيسين على الركيزة في حوالي 0.5 ميكرون / ثانية، اعتمادا على درجة الحرارة. إذا كان الحقل من رأي من المجهر هو 50 ميكرون، وينبغي أن تكون واضحة ميكروتثبول الفردية لحوالي 100 ثانية. تعيين شدة الإضاءة بحيث fluorophores واحد لا photobleach بسرعة أكبر من 100 ثانية. في حالة استخدام الإثارة الليزر، وهو وضع قوة حوالي 3-5 ميغاواط مناسبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع متواليات من الصور للتحليل. 600 الصور في5 هرتز (2 إجمالي دقيقة) يعمل بشكل جيد. استخدام تسلسل طويلة بما فيه الكفاية أن ميكروتثبول اجتياز كامل مجال للرؤية. </li></ol> 5. تحليل البيانات روتين IDL، <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50117/50117IDL_Routines.zip" target="_blank">get_lp.pro</a> يتم إرفاق. هذا الروتين بإرجاع قيمة طول استمرار بناء على كل مزلق ميكروتثبول في تسلسل الصور معين. إما تشغيل هذا الروتين في كل تسلسل الصور، وتعديل المعلمات اعتمادا على شدة الإعداد المجهر معينة، أو القيام بما يلي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتبع كل fluorophore تعلق على أنيبيب لخلق مسارات fluorophore. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين جميع المسارات من fluorophores على أنيبيب نظرا إلى مسار أنيبيب الشاملة؛ تكرار لكل أنيبيب في تسلسل الصور (الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب الزاوية الظل الى كل نقطة على طول المسار (الشكل 4)، وحساب &lt;cos θ سبت&gt; في المعادلة. 1 من المتوسط ​​جيب تمام الزاوية من الفرق لكل زوج من نقاط مفصولة ق مسار بطول (الشكل 5). العثور على طول استمرار لأنيبيب واحد أو مجموعة من الأنابيب الدقيقة من قبل &lt;cos المناسب θ سبت&gt; لالمعادلة. 1، الترجيح نقاط البيانات الفردية في مجال التجهيزات من قبل عدد من القيم مستقلة عن كوس θ ق التي يتم استخدامها لحساب المتوسط. </li></ol>

<ol>
	<li>Hawkins, T., Mirigian, M., Selcuk Yasar, M., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+microtubules.">Mechanics of microtubules.</a> Journal of biomechanics. 43, 23-30 (2010).</li><li>Pampaloni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+fluctuations+of+grafted+microtubules+provide+evidence+of+a+length-dependent+persistence+length.">Thermal fluctuations of grafted microtubules provide evidence of a length-dependent persistence length.</a> Proceedings of the national academy of sciences U S A. 103, 10248-10253 (2006).</li><li>Taute, K. M., Pampaloni, F., Frey, E., Florin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+depart+from+the+wormlike+chain+model.">Microtubule dynamics depart from the wormlike chain model.</a> Physical review letters. 100, 028102 (2008).</li><li>Van den Heuvel, M. G., de Graaff, M. P., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+curvatures+under+perpendicular+electric+forces+reveal+a+low+persistence+length.">Microtubule curvatures under perpendicular electric forces reveal a low persistence length.</a> Proceedings of the national academy of sciences U.S.A. 105, 7941-7946 (2008).</li><li>Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexural+rigidity+of+microtubules+and+actin+filaments+measured+from+thermal+fluctuations+in+shape.">Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape.</a> Journal of cell biology. 120, 923-934 (1993).</li><li>Brangwynne, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bending+dynamics+of+fluctuating+biopolymers+probed+by+automated+high-resolution+filament+tracking.">Bending dynamics of fluctuating biopolymers probed by automated high-resolution filament tracking.</a> Biophysical journal. 93, 346-359 (2007).</li><li>Cassimeris, L., Gard, D., Tran, P. T., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XMAP215+is+a+long+thin+molecule+that+does+not+increase+microtubule+stiffness.">XMAP215 is a long thin molecule that does not increase microtubule stiffness.</a> Journal of cell science. 114, 3025-3033 (2001).</li><li>Valdman, D., Atzberger, P. J., Yu, D., Kuei, S., Valentine, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+analysis+methods+for+the+robust+measurement+of+the+flexural+rigidity+of+biopolymers.">Spectral analysis methods for the robust measurement of the flexural rigidity of biopolymers.</a> Biophysical. 102, 1144-1153 (2012).</li><li>van Mameren, J., Vermeulen, K. C., Gittes, F., Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveraging+single+protein+polymers+to+measure+flexural+rigidity.">Leveraging single protein polymers to measure flexural rigidity.</a> Journal of physical chemistry b. 113, 3837-3844 (2009).</li><li>Hua, W., Chung, J., Gelles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+inchworm+and+hand-over-hand+processive+kinesin+movement+by+neck+rotation+measurements.">Distinguishing inchworm and hand-over-hand processive kinesin movement by neck rotation measurements.</a> Science. 295, 844-848 (2002).</li><li>Duke, T., Holy, T. E., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Gliding+assays"+for+motor+proteins:+A+theoretical+analysis.">"Gliding assays" for motor proteins: A theoretical analysis.</a> Physical review letters. 74, 330-333 (1995).</li><li>Mehrbod, M., Mofrad, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+significance+of+microtubule+flexural+behavior+in+cytoskeletal+mechanics.">On the significance of microtubule flexural behavior in cytoskeletal mechanics.</a> PLoS one. 6, e25627 (2011).</li><li>Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Kelley, M. W., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+changes+in+actin+and+microtubules+underlie+the+developing+surface+mechanical+properties+of+sensory+and+supporting+cells+in+the+mouse+cochlea.">Cytoskeletal changes in actin and microtubules underlie the developing surface mechanical properties of sensory and supporting cells in the mouse cochlea.</a> Development. 139, 2187-2197 (2012).</li><li>Gal, N., Weihs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Mechanics+and+Activity+of+Breast+Cancer+Cells+Correlate+with+Metastatic+Potential.">Intracellular Mechanics and Activity of Breast Cancer Cells Correlate with Metastatic Potential.</a> Cell biochemistry and biophysics. , (2012).</li><li>Volokh, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+tensegrity+in+cell+mechanics.">On tensegrity in cell mechanics.</a> Mol. Cell Biomech. 8, 195-214 (2011).</li><li>Kasas, S., Dietler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+measuring+microtubule+stiffness.">Techniques for measuring microtubule stiffness.</a> Current nanoscience. 3, 85-96 (2007).</li><li>Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexural+rigidity+of+individual+microtubules+measured+by+a+buckling+force+with+optical+traps.">Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps.</a> Biophysical journal. 90, 1687-1696 (2006).</li><li>Venier, P., Maggs, A. C., Carlier, M. F., Pantaloni, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+microtubule+rigidity+using+hydrodynamic+flow+and+thermal+fluctuations.">Analysis of microtubule rigidity using hydrodynamic flow and thermal fluctuations.</a> Journal of biological chemistry. 269, 13353-13360 (1994).</li><li>van den Heuvel, M. G., Bolhuis, S., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+length+measurements+from+stochastic+single-microtubule+trajectories.">Persistence length measurements from stochastic single-microtubule trajectories.</a> Nano letters. 7, 3138-3144 (2007).</li><li>Phillips, R., Kondev, J., Theriot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physical biology of the cell. , (2008).</li><li>Berliner, E., Young, E. C., Anderson, K., Mahtani, H. K., Gelles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+of+a+single-headed+kinesin+to+track+parallel+to+microtubule+protofilaments.">Failure of a single-headed kinesin to track parallel to microtubule protofilaments.</a> Nature. 373, 718-721 (1995).</li><li>Anderson, E. K., Martin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+GTP+analog+as+a+specific,+high-precision+label+of+microtubules.">A fluorescent GTP analog as a specific, high-precision label of microtubules.</a> Biotechniques. 51, 43-48 (2011).</li><li>Hyman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+modified+tubulins.">Preparation of modified tubulins.</a> Methods in enzymology. 196, 478-485 (1991).</li><li>Lee, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curve+reconstruction+from+unorganized+points.">Curve reconstruction from unorganized points.</a> Computer aded geometric design. 17, 161-177 (2000).</li><li>Yildiz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+V+walks+hand-over-hand:+Single+fluorophore+imaging+with+1.5-nm+localization.">Myosin V walks hand-over-hand: Single fluorophore imaging with 1.5-nm localization.</a> Science. 300, 2061-2065 (2003).</li><li>Friedman, L. J., Chung, J., Gelles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viewing+dynamic+assembly+of+molecular+complexes+by+multi-wavelength+single-molecule+fluorescence.">Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence.</a> Biophysical. 91, 1023-1031 (2006).</li><li>Smith, C. S., Joseph, N., Rieger, B., Lidke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+single-molecule+localization+that+achieves+theoretically+minimum+uncertainty.">Fast, single-molecule localization that achieves theoretically minimum uncertainty.</a> Nature Methods. 7, 373-375 (2010).</li><li>Nitzsche, B., Ruhnow, F., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum-dot-assisted+characterization+of+microtubule+rotations+during+cargo+transport.">Quantum-dot-assisted characterization of microtubule rotations during cargo transport.</a> Nature. 3, 552-556 (2008).</li></ol>

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.

قياسات طول استمرار هي توصيف جيد من الخواص الميكانيكية للالبوليمرات الحيوية الفردية. في هذه المقالة، ووصف لنا طريقة لقياس طول استمرار ميكروتثبول. كما لوحظ في المقدمة، ويمتد هذا الأسلوب بسهولة إلى دراسة الخصائص الميكانيكية أنيبيب في مجموعة متنوعة من الظروف ببساطة من...

الهيكل الخلوي، وهي شبكة من البوليمرات الحيوية موجودة في الخلايا حقيقية النواة الأكثر، يلعب دورا في تنظيم الخلوية، والنقل داخل الخلايا، والميكانيكا الخلية. الخصائص الميكانيكية للالبوليمرات الحيوية من الهيكل الخلوي (أكتين في المقام الأول وميكروتثبول) تلعب دورا هاما في تحديد الخواص الميكانيكية للخلية كما في 12 كله. منذ ميكانيكا خلية كاملة يمكن أن تميز الخلايا السليمة والمريضة 13،14 وتشارك في الحركة الخلوية 15، وكانت الخواص الميكانيكية للهيكل الخلية الأساسية في مكونات منطقة نشطة للدراسة على مدى العقدين الماضيين 1. وتتميز بالمرونة (أو تصلب) من البوليمرات الحيوية من طول استمرار، وطول البوليمر الذي ينحني من راديان واحد تقريبا تحت تقلبات الحرارية عند درجة حرارة الغرفة. وقد تم تطوير عدد من التقنيات لقياس طول استمرار 16، لأمثلتقنيات جنيه بالموقع التي تنطوي على الانحناء البوليمر باستخدام تدفق الهيدروديناميكية، والفخاخ البصرية، أو المجالات الكهربائية 4،17،18، وتقنيات قياس السلبي الذي تقلبات البوليمرات الحرة في حل 5،6. القياسات بالموقع، ومع ذلك، تتطلب الاجهزة المتخصصة لتنفيذ القوات المعروفة على مقياس الميكرومتر، وقياسات الحرة تقلب يمكن أن يكون تحديا بسبب نشرها من الطائرة من تركيز المجهر المستخدمة. في هذه المقالة، ونحن تصف، السلبي التكميلية، تقنية لقياس طول استمرار ميكروتثبول، بوليمر هيكل الخلية. والأسلوب الذي ينطوي المقايسات مزلق، والتي تضمن أن يبقى دائما البوليمر في المستوى البؤري 19. وعلاوة على ذلك، فإنه ينطوي fluorophores واحدة تتبع تثبت بصورة دائمة على البوليمر في المصالح، بحيث تتميز كذلك مواقع محددة على طول البوليمر. ويرد كارتون الأسلوب في الارقام ..ه 1. كينيسين يتحرك على وجه التحديد في أواخر + من الأنابيب الدقيقة، بحيث يتم دفع ميكروتثبول مزلق في مقايسة unidirectionally. نهاية الرائدة في مجال أنيبيب، وراء كينيسين مشاركة المرفقة، حر في أن تتقلب تحت قوات الحرارية من الحل المحيطة بها. كما دفعت أنيبيب إلى الأمام، حتى نهاية يتقلب الربط إلى جزيء جديد كينيسين على امتداد شريحة زجاجية يتجمد في تذبذب معين. لأن تعلق كينيسين ميكروتثبول بقوة، يتم تقييد أنيبيب لمتابعة مسار نهاية الرائدة. ولذلك، فإن التقلبات الإحصائية المجمدة في مسار أنيبيب هي نفس التقلبات الإحصائي للنهاية خالية من الأنابيب الدقيقة 11، وبالتالي يمكن استخدامها لحساب طول استمرار فقا إلى 20 <img alt="المعادلة 1" fo:content-width="1in" fo:src="/files/ftp_upload/50117/50117eq1highres.jpg" srج = &quot;/ files/ftp_upload/50117/50117eq1.jpg&quot; /&gt; حيث L هو طول ع استمرار أنيبيب، θ s هو الزاوية بين الظلال لمسار مفصولة كفاف ق الطول، و&lt;&gt; يدل على متوسط ​​على كل زوج من المواقف مفصولة كفاف ق الطول. الفحص مزلق نفسه يستخدم المعقدة البيروكسيديز كينيسين في ال 21 ملفوف لفائف ملزمة على وجه التحديد إلى شريحة زجاجية عن طريق الربط streptavidin-البيوتين. هذا المرفق يضمن أن محرك المجالات أحرار في ربط ودفع ميكروتثبول. من أجل تتبع مسارات أنيبيب، وصفت قليلة ميكروتثبول مع fluorophores العضوية 22،23 - التسميات يجب أن تكون كافية متفرق التي لحل fluorophores واحدة باستخدام جزيء واحد المجهري مضان. يتم تعقب fluorophores واحدة باستخدام إجراءات تحليل الصور مكتوب في IDL. مسارات من كل fluorophore منضم إلى هيئة التصنيع العسكري نظرايتم الجمع بين rotubule في مسار مركب 24 أنيبيب تلقائيا. يتم حساب زوايا الظل θ إلى كل نقطة على طول المسار، ومن هذه الزوايا الظل ويتم احتساب &lt;cosθ سبت&gt; قيمة كل كفاف ق الطول. وأخيرا، وتناسب هذه البيانات إلى المعادلة. (1) بغية انتزاع طول استمرار لأنيبيب معين، أو لميكروتثبول كثيرة في نفس الفحص مزلق. طريقة قوية بما فيه الكفاية للعمل مع ميكروتثبول أعدت في مجموعة متنوعة واسعة من الظروف (مع مختلف وكلاء استقرار أو الجزيئات الصغيرة الأخرى منضمة إلى أنيبيب، مع البروتينات أنيبيب ملزمة المرتبطة (خرائط)، أو مع مجموعة متنوعة من الحلول لزجة). في المختبر، وقد استخدمت هذه التقنية لوصف طول استمرار ميكروتثبول بوصفها وظيفة من طول على طول الأنابيب الدقيقة والأنابيب الدقيقة مع مختلف وكلاء الاستقرار. تقييد الرئيسي هو أن ميكروتثبول يجب أن لا يزال لياليupport كينيسين الحركة. منذ كينيسين هو انزيم محرك قوي، وهذا هو تقييد فضفاضة إلى حد ما. من خلال استبدال الأنابيب الدقيقة مع الأكتين وكينيسين مع انزيم الأسرة الميوسين، يمكن قياس طول استمرار الأكتين باستخدام نفس التقنية.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt; الكواشف</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; إيميدازول</td&gt;<td&gt; سيغما الدريخ</td&gt;<td&gt; I2399</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; كلوريد البوتاسيوم</td&gt;<td&gt; سيغما الدريخ</td&gt;<td&gt; P9541</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; المغنيسيوم الكلوريد</td&gt;<td&gt; سيغما الدريخ</td&gt;<td&gt; M8266</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EGTA</td&gt;<td&gt; سيغما الدريخ</td&gt;<td&gt; E3889</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BSA</td&gt;<td&gt; Calbiochem</td&gt;<td&gt; 126615</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; المعقدة البيروكسيديز BSA</td&gt;<td&gt; الحرارية العلمية</td&gt;<td&gt; 29130</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; α-الكازين</td&gt;<td&gt; سيغما الدريخ</td&gt;<td&gt; C6780</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; streptavidin</td&gt;<td&gt; الحرارية العلمية</td&gt;<td&gt; 21125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; dithiothreitol</td&gt;<td&gt; سيغما الدريخ</td&gt;<td&gt; D0632</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; باكليتاكسيل</td&gt;<td&gt; LC المختبرات</td&gt;<td&gt; P-9600</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; الجلوكوز أوكسيديز</td&gt;<td&gt; سيغما الدريخ</td&gt;<td&gt; G2133</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; الكاتلاز</td&gt;<td&gt; سيغما الدريخ</td&gt;<td&gt; C100</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; الجلوكوز</td&gt;<td&gt; سيغما الدريخ</td&gt;<td&gt; G8270</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ATP</td&gt;<td&gt; سيغما الدريخ</td&gt;<td&gt; A2383</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 2-المركابتويثانول</td&gt;<td&gt; سيغما الدريخ</td&gt;<td&gt; M3148</td&gt;<td&gt; السامة. شراء كمية صغيرة.</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 24X60 مم رقم 1 1/2 كوب غطاء</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48393-252</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 22X22 مم رقم 1 كوب غطاء</td&gt;<td&gt; الذهب خاتم</td&gt;<td&gt; 3306</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; الشحوم عالية الفراغ</td&gt;<td&gt; داو كورنينج-</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt; معدات</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TIRF المجهر</td&gt;<tdالعديد&gt;</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt; وكان المجهر TIRF المستخدمة في هذه الطريقة محلية الصنع.</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; IDL (البرمجيات)</td&gt;<td&gt; Exelis</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<tdهل يمكن&gt; استبدال MATLAB، يماغيج، أو غيرها من البرامج تحليل الصور.</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

flexural rigidity measurements of biopolymers using gliding assays

ميكروتثبول هي البوليمرات هيكل الخلية التي تلعب دورا في انقسام الخلايا، والميكانيكا الخلية، والنقل داخل الخلايا. كل من هذه المهام يتطلب ميكروتثبول التي هي قاسية بما فيه الكفاية وتمتد مباشرة إلى جزء كبير من الإطارات الخلية. ونتيجة لذلك، تم طول استمرار أنيبيب، وهو مقياس لصلابة، ودرس بنشاط على مدى العقدين الماضيين 1. ومع ذلك، تبقى الأسئلة مفتوحة: ميكروتثبول قصيرة هي 10-50 مرات أقل من ميكروتثبول طويلة قاسية 2-4، وميكروتثبول حتى قياس أطوال طويلة والتي تختلف استمرار بأمر من حجم 5-9. هنا، نقدم طريقة لقياس طول أنيبيب المثابرة. وتستند هذه الطريقة على فحص أنيبيب مزلق كينيسين يحركها 10. من خلال الجمع بين العلامات الفلورية متفرق من ميكروتثبول الفردية مع تتبع جسيم واحد من fluorophores الفردية التي تعلق على أنيبيب، وglidinيتم تعقب مسارات غرام من ميكروتثبول نانومتر واحد مع المستوى من الدقة. طول مسارات استمرار هو نفس طول استمرار أنيبيب وفقا للشروط استخدامها 11. يستخدم روتين تتبع الآلي لخلق مسارات أنيبيب من fluorophores تعلق على ميكروتثبول الفردية، ويتم حساب طول استمرار هذا المسار باستخدام إجراءات مكتوبة في IDL. هذه التقنية قابلة للتطبيق بسرعة، وقادرة على قياس طول استمرار ميكروتثبول من 100 في يوم واحد من التجريب. ويمكن تمديد طريقة لقياس طول ظل استمرار مجموعة متنوعة من الظروف، بما في ذلك استمرار طول بوصفها وظيفة من طول الأنابيب الدقيقة جنبا إلى جنب. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تمتد إجراءات التحليل المستخدمة لالميوسين القائم على المقايسات مزلق التمثيل، لقياس طول خيوط الأكتين استمرار كذلك.

ويرد لقطة من الفحص مزلق في الشكل 2. A الكثافة أنيبيب الجيد هو ميكروتثبول 1-10 في مجال الرؤية؛ حد كبير سوف يؤدي إلى مزيد من mistracking كما ميكروتثبول عبر بعضها البعض. ويرد مؤامرة من مسارات أنيبيب 11 من مقايسة مزلق في الشكل 2 في الشكل 3. مسارات نموذجية م...

Watch this Scientific Journal Video about Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays at JoVE.com

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

ووصف طريقة لقياس طول جمود العاطفة أو استمرار من البوليمرات الحيوية. أسلوب يستخدم كينيسين يحركها مقايسة مزلق أنيبيب تجريبيا لتحديد طول استمرار ميكروتثبول الفردية وقابلة للتكيف مع المقايسات مزلق الأكتين مقرا لها.

قياسات جمود العاطفة من البوليمرات الحيوية باستخدام فحوصات الانزلاق

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

flexural-rigidity-measurements-of-biopolymers-using-gliding-assays

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.7K Views.  Lawrence University. ووصف طريقة لقياس طول جمود العاطفة أو استمرار من البوليمرات الحيوية. أسلوب يستخدم كينيسين يحركها مقايسة مزلق أنيبيب تجريبيا لتحديد طول استمرار ميكروتثبول الفردية وقابلة للتكيف مع المقايسات مزلق الأكتين مقرا لها.

Video: Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to the complexity of development on alternate platforms. BioScale's proprietary Acoustic Membrane MicroParticle (AMMP) technology allows sandwich immunoassays to be easily developed for use on the ViBE platform, providing better sensitivity, reproducibility, and automated operation. Provided as an example, this protocol outlines the procedure for developing a custom Chinese Hamster Ovary- Host Cell Protein (CHO-HCP) assay. The general principles outlined here can be followed for the development of a wide variety of immunoassays.
An AMMP assay measures antigen concentration by measuring changes in oscillation frequency caused by the binding of microparticles to the sensor surface to calculate. It consists of four major components: (1) a cartridge that contains a functionalized eight sensor chip (2) antibody labeled magnetic microparticles, (3) hapten tagged antibody that binds to the surface of the functionalized chip (4) samples containing the antigen of interest. BioScale's biosensor is a resonant device that contains eight individual membranes with separate fluidic paths. The membranes change oscillation frequency in response to mass accumulating on the surface and this frequency change is used to quantitate the amount of added mass.
To facilitate use in a wide variety of immunoassays the sensor is functionalized with an anti-hapten antibody. Assay specific antibodies are modified through the covalent conjugation of a hapten tag to one antibody and biotin to the other. The biotin label is used to bind the antibody to streptavidin coupled magnetic beads which, in combination with the hapten-tagged antibody, are used to capture the analyte in a sandwich. The complex binds to the chip through the anti-hapten/hapten interaction. At the end of each assay run the sensors are cleaned with a dilute acid enabling the sequential analysis of columns from a 96-well plate.
Here, we present the method for developing a custom CHO-HCP AMMP assay for bioprocess development. Developing AMMP assays or modifying existing assays into AMMP assays can provide better performance (reproducibility, sensitivity) in complex samples and reduced operator time. The protocol shows the steps for development and the discussion section reviews representative results. For a more in-depth explanation of assay optimization and customization parameters contact BioScale. This kit offers generic bioprocess development assays such as Residual Protein A, Product titer, and CHO-HCP.

Development of custom assays on the ViBE platform for more sensitive, reproducible, automated results in complex matrices is described. The universal cartridge allows assays to be easily adapted for use with custom assays. This versatility enables rapid development and validation of novel assays or automated versions of existing manual assays, exemplified in this video.

مخصص الصينية النامية الهامستر بروتين الخلية المبيض في استضافة فحوصات باستخدام التكنولوجيا الصوتية Microparticle الغشائية

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

المضاعفة واحدة جزيء القياسات التحلل البروتيني باستخدام الملقط قوة مغناطيسية

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to give an accurate velocity profile. A protocol is presented for &mu;PIV measurements of blood flows in microchannels. At the scale of the microcirculation, blood cannot be considered a homogeneous fluid, as it is a suspension of flexible particles suspended in plasma, a Newtonian fluid. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate can be derived from these measurements. Several key parameters such as focal depth, particle concentration, and system compliance, are presented in order to ensure accurate, useful data along with examples and representative results for various hematocrits and flow conditions.

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows which are cross-correlated to give an accurate velocity profile. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate, each of which has clinical applications, can be derived from these measurements.

الجسيمات الدقيقة Velocimetry صورة لسرعة الشخصي قياسات يتدفق الدم مايكرو

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and modified as part of a set of complex, two-way mechanosensitive interactions. While the development of biologically-relevant 3D tumor models have facilitated mechanistic studies on the impact of matrix rheology on tumor growth, the inverse problem of mapping changes in the mechanical environment induced by tumors remains challenging. Here, we describe the implementation of particle-tracking microrheology (PTM) in conjunction with 3D models of pancreatic cancer as part of a robust and viable approach for longitudinally monitoring physical changes in the tumor microenvironment, in situ. The methodology described here integrates a system of preparing in vitro 3D models embedded in a model extracellular matrix (ECM) scaffold of Type I collagen with fluorescently labeled probes uniformly distributed for position- and time-dependent microrheology measurements throughout the specimen. In vitro tumors are plated and probed in parallel conditions using multiwell imaging plates. Drawing on established methods, videos of tracer probe movements are transformed via the Generalized Stokes Einstein Relation (GSER) to report the complex frequency-dependent viscoelastic shear modulus, G*(&#969;). Because this approach is imaging-based, mechanical characterization is also mapped onto large transmitted-light spatial fields to simultaneously report qualitative changes in 3D tumor size and phenotype. Representative results showing contrasting mechanical response in sub-regions associated with localized invasion-induced matrix degradation as well as system calibration, validation data are presented. Undesirable outcomes from common experimental errors and troubleshooting of these issues are also presented. The 96-well 3D culture plating format implemented in this protocol is conducive to correlation of microrheology measurements with therapeutic screening assays or molecular imaging to gain new insights into impact of treatments or biochemical stimuli on the mechanical microenvironment.

Particle-tracking microrheology can be used to non-destructively quantify and spatially map changes in extracellular matrix mechanical properties in 3D tumor models.

قياس طولية من خارج الخلية مصفوفة جمود في 3D نماذج ورم عن طريق تتبع الجسيمات Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

حبة تجميع فحوصات لتوصيف المزعومين خلية التصاق جزيئات

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Molecular Entanglement and Electrospinnability of Biopolymers

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope was found to be an essential prerequisite for successful electrospinning. Rheology is a powerful tool to probe the molecular conformation and interaction of biopolymers. In this report, we demonstrate the protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan, from their dimethyl sulfoxide (DMSO)/water dispersions. Well-formed starch and pullulan fibers with average diameters in the submicron to micron range were obtained. Electrospinnability was evaluated by visual and microscopic observation of the fibers formed. By correlating the rheological properties of the dispersions to their electrospinnability, we demonstrate that molecular conformation, molecular entanglement, and shear viscosity all affect electrospinning. Rheology is not only useful in solvent system selection and process optimization, but also in understanding the mechanism of fiber formation on a molecular level.

Electrospinning is a fascinating technique used to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. Molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope is essential for successful electrospinning. We present a protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan.

تشابك الجزيئية وElectrospinnability من البوليمرات الحيوية

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and macro-structures, as seen in the cases of moving water in vascular bundles and moisturizing water in skin layers. In this study, we developed a method for assessing the effect of aqueous liquid crystalline (LC) solutions composed of biopolymers on drying. As LC biopolymers have megamolecular weight, we chose to study polysaccharides, cytoskeletal proteins, and DNA. The observation of biopolymer solutions during drying under polarized light reveals milliscale self-integration starting from the unstable air-LC interface. The dynamics of the aqueous LC biopolymer solutions can be monitored by evaporating water from a one-side-open cell. By analyzing the images taken using cross-polarized light, it is possible to recognize the spatio-temporal changes in the orientational order parameter. This method can be useful for the characterization of not only artificial materials in various fields, but also natural living tissues. We believe that it will provide an evaluation method for soft materials in the biomedical and environmental fields.

A method for the drying-induced self-integration of megamolecular biopolymers on the air-liquid crystalline interface is provided here. This methodology will be useful not only for understanding the macroscopic potentials of biopolymers, but also as an evaluation method for soft materials in biomedical and environmental fields.

طرق لالتكامل الذاتي للMegamolecular البوليمرات الحيوية على تجفيف الهواء-LC واجهة

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during rotation. However, the experimental determination of the power input in small-scale vessels is still challenging due to relatively high friction losses inside typically used bushings, bearings and/or shaft seals and the accuracy of commercially available torque meters. Thus, only limited data for small-scale bioreactors, in particular single-use systems, is available in the literature, making comparisons among different single-use systems and their conventional counterparts difficult.
This manuscript provides a protocol on how to measure power inputs in benchtop scale bioreactors over a wide range of turbulence conditions, which can be described by the dimensionless Reynolds number (Re). The aforementioned friction losses are effectively reduced by the use of an air bearing. The procedure on how to set up, conduct and evaluate a torque-based power input measurement, with special focus on cell culture typical agitation conditions with low to moderate turbulence (100 &#60; Re &#60; 2&#183;104), is described in detail. The power input of several multi-use and single-use bioreactors is provided by the dimensionless power number (also called Newton number, P0), which is determined to be in the range of P0 &#8776; 0.3 and P0 &#8776; 4.5 for the maximum Reynolds numbers in the different bioreactors.

The power input in stirred bioreactors can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during rotation. This manuscript describes how an air bearing can be used to effectively reduce friction losses observed in mechanical seals and improve the accuracy of power input measurements in small-scale vessels.

قياسات الطاقة الإدخال في المفاعلات الحيوية المقلبة في المختبرات

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the flexural behavior of these LBBSs is important for understanding the origins of their remarkable mechanical functions.
We describe a protocol for performing three-point bending tests using a custom-built mechanical testing device that can measure forces ranging from 10-5 to 101 N and displacements ranging from 10-7 to 10-2 m. The primary advantage of this mechanical testing device is that the force and displacement capacities can be easily adjusted for different LBBSs. The device&#39;s operating principle is similar to that of an atomic force microscope. Namely, force is applied to the LBBS by a load point that is attached to the end of a cantilever. The load point displacement is measured by a fiber optic displacement sensor and converted into a force using the measured cantilever stiffness. The device&#39;s force range can be adjusted by using cantilevers of different stiffnesses.
The device&#39;s capabilities are demonstrated by performing three-point bending tests on the skeletal elements of the marine sponge Euplectella aspergillum. The skeletal elements&#8212;known as spicules&#8212;are silica fibers that are approximately 50 &#181;m in diameter. We describe the procedures for calibrating the mechanical testing device, mounting the spicules on a three-point bending fixture with a &#8776;1.3 mm span, and performing a bending test. The force applied to the spicule and its deflection at the location of the applied force are measured.

We present a protocol for performing three-point bending tests on sub-millimeter scale fibers using a custom-built mechanical testing device. The device can measure forces ranging from 20 &#181;N up to 10 N and can therefore accommodate a variety of fiber sizes.

نظام ملليمتر اختبار العاطفة مقياس لقياس الخواص الميكانيكية للاسفنج البحري سبيكوليس

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.