Este trabajo fue apoyado por una beca de MK y BKK de la Ellison Medical Foundation. MK es una Ellison Medical Foundation de Nueva Académico en el envejecimiento. Nos gustaría dar las gracias a Soumya Kotireddy de asistencia durante el rodaje.

Parte 1: Preparar las cepas y las placas para el análisis de la vida replicativa lapso En esta sección se describe la preparación de las placas de YEPD sólida para su uso en el experimento de replicación vida y la preparación de las células de levadura para el análisis de vida útil. <ol><li> Utilizando una técnica estéril su caso, preparar las placas de agar YEPD (1% extracto de levadura, 2% Bacto-peptona, 2% de agar, 2% de glucosa) que será utilizado para el cultivo de células de levadura y para el análisis abarcan replicativa vida. Usted debe preparar por lo menos dos placas por cada 4-5 cepas para ser analizados en el experimento de vida. Las placas deben estar preparados por lo menos 2 días antes del experimento esperanza de vida y se deja secar antes de comenzar el ensayo de vida útil. Si el experimento no se iniciará dentro de 4-5 días de verter las placas, deben ser colocados en una incubadora refrigerada y envuelto en parafina o plástico para evitar la desecación. </li><li> Eliminar las cepas de levadura de las existencias congeladas y racha de colonias aisladas en placas de agar YEPD. Hasta 6 cepas pueden ser sembradas en la placa de YEPD mismo mediante la separación de la placa de igual tamaño en forma de pastel cuñas. </li><li> Se incuban las células a 30 ° C durante 2 días. </li><li> Eliminar las células de la incubadora y las células de parches de una sola colonia en una placa de YEPD fresco. Dos parches de dos colonias diferentes se deben generar para cada cepa. En este momento, las cepas a analizar deben ser codificados para asegurar la vida replicativa experimento lapso se lleva a cabo &quot;a ciegas&quot;, donde los disectores no conocer la identidad de las distintas cepas. </li><li> Se incuban las células parcheado, codificado a 30 ° C hasta la noche siguiente. </li><li> Eliminar las células y las células de la ligera revisión de cada cepa codificados a nuevas placas de YEPD, que servirá como las placas experimentales utilizados para el análisis de ciclo de vida replicativa. Las células deben ser reparado a lo largo de una línea vertical en el lado izquierdo de la placa de YEPD (Figura 1). Aproximadamente 3-5 parches por placa es óptimo, asumiendo la vida replicativa análisis abarcan el 20 de células de cada parche. No es necesario (ni deseable) para transferir un gran número de células a la placa de YEPD fresco, ya que esto hará que las células crezcan densamente durante la incubación durante la noche, lo cual puede limitar su tiempo de vida posterior replicación. </li><li> Las placas se incuban durante la noche recién parcheado en la mesa de trabajo. </li></ol> Parte 2: Posición de las células para el análisis de intervalo de replicación vida. En esta sección se describe cómo la posición de las células de levadura en el plato y la forma de obtener células virgen hija de análisis abarcan replicativa vida. A partir de ahora, todas las placas deben ser parafilmed, excepto cuando se someten a la disección, con el fin de prevenir la desecación. <ol><li> El uso de un microscopio equipado con un aparato de microdisección adecuado para la levadura, la transferencia de aproximadamente 50 células de la cepa parche primero en una posición en la placa distal a las células del parche. Si la platina del microscopio se clasifica, estos matices se puede utilizar para asegurarse de que las células serán fáciles de encontrar en las siguientes iteraciones. En la Axioscope Zeiss de 40 años, las células de la cepa parche primero se puede colocar en las coordenadas 90 x 10 y dispuestos verticalmente desde allí. </li><li> Limpie la aguja de las células en varias ocasiones de tocar la superficie del agar, a continuación, crear un agujero en el agar al forzar la aguja a través de la superficie del agar. Este agujero servirá como un marcador para orientarse en el plato durante las siguientes iteraciones de la disección y la eliminación de células hija. Tenga cuidado de no obtener las células de levadura en el agujero, o que crecen y se forma una colonia. </li><li> Directamente sobre el agujero, alinear verticalmente células individuales de levadura en 20 puntos espaciados uniformemente, con un diámetro de aguja 1-3 (~ 100 M) entre cada posición de la célula (Figura 1). Cada pocas células, coloque dos células adyacentes en la misma posición en la línea en lugar de uno. Esto permite la redundancia en la selección virgen célula hija, si una de las células transferidas no para dividir. </li><li> Entre el 10 y 11 º puestos en la línea, crear una serie horizontal de 7-8 agujeros en el agar. Esto servirá como un marcador para orientarse en el plato durante las siguientes iteraciones de la disección y la eliminación de células hija. Tenga cuidado de no obtener células de levadura en los agujeros, o crecen y se forma una colonia. </li><li> Repita los pasos 2.1 a 2.4 por cada parche en el plato, sin dejar de celdas del arreglo verticalmente a lo largo del mismo eje. Para el paso 2.2, el número de agujeros creados deben corresponder a la cantidad de parches (un agujero para el primer parche, dos agujeros para el segundo, etc.) </li><li> Una vez que las células han sido dispuestos para cada parche, la placa de parafina y se incuba a 30 ° C durante aproximadamente 2 horas. </li><li> Repita los pasos 2.1-2.6 por cada placa en el experimento. </li></ol> Parte 3: Obtener células virgen hija para el análisis de vida útil En esta sección se iniciará el análisis de ciclo de vida, asegurando que cada célula se inicia como una hija virgencelular. <ol><li> Retire las placas de la incubadora y verificar que la mayoría de las células dispuestas han sido sometidos a una división celular. Si se necesita más tiempo para permitir que la división celular que se complete, la placa de retorno a la incubadora. </li><li> A partir de las células dispuestas en primer lugar, el uso de la aguja para separar las células hija de la célula madre colocando suavemente la aguja en la parte superior de las células unidas. A veces es útil para aprovechar el lado de la base del microscopio, mientras que la aguja está en reposo en las células. </li><li> Coloque la célula hija separada de la línea vertical, en sustitución de la célula madre y las células hijas más y moverlos de lado temporalmente. </li><li> Repita el paso 3.2 y 3.3 para cada una de las células dispuestas. Si una célula no puede dividirse, tomar una célula hija de una de las células redundantes posicionado en el paso 2.3. Cuando haya terminado, usted debe tener 20 células hijas de cada parche alineados verticalmente sobre la placa de vida. </li><li> Recoge todas las células madre y células adicionales hija en una pila y la transferencia de nuevo a una zona cercana a los parches (&quot;el cementerio&quot;). Es importante evitar que las células no deseadas lejos de las células en proceso de análisis vida útil para prevenir la formación de microcolonias y el agotamiento de los nutrientes local. </li><li> Parafilm la placa y se incuba a 30 ° C durante aproximadamente 2 horas. </li><li> Repita los pasos 3.2-3.6 por cada placa en el experimento. </li></ol> Parte 4: Medición de la capacidad replicativa de las células individuales <ol><li> Prepare la vida de los datos abarcan las hojas. Una esperanza de vida hoja de datos puede ser una simple rejilla donde cada fila corresponde a una célula madre individual y cada columna corresponde a una edad más puntos (Figura 2). La etiqueta de cada hoja de datos en función del número de cepas para ser analizados. </li><li> Retire las placas de la incubadora y verificar que la mayoría de las células dispuestas han sufrido al menos una división celular. Si se necesita más tiempo para permitir que la división celular que se complete, la placa de retorno a la incubadora. </li><li> A partir de la primera celda dispuestas en la primera placa, observe la célula madre y la hija (s) y determinar el número de divisiones celulares que han ocurrido. Por lo general, fácil de determinar el número de células de la hija de una madre ha producido, sobre la base de los patrones característicos de los acuerdos de la célula. Anote el número de células hijas producidas por la célula madre en la casilla correspondiente en la hoja de vida cuenta tramo. </li><li> Utilice la aguja para separar las células hijas de la célula madre como se describe en el paso 3.2. </li><li> Conservar las células madre en su posición en la línea vertical y mover la célula hija (s) a un lado temporalmente. </li><li> Repita los pasos 4.3-4.5 para cada una de las células dispuestas. </li><li> Recoge todas las células hijas descartados y pasar a la &quot;cementerio&quot;, situado cerca de los parches originales. </li><li> Parafilm la placa y se incuba a 30 ° C durante 2-3 horas. </li><li> Repita los pasos 4.3-4.8 por cada placa en el experimento. </li><li> Repita los pasos 4.2 a 4.9 hasta que todas las células madre han dejado de dividirse. A medida que la edad de la madre las células, la progresión del ciclo celular se vuelve más lento y sería deseable que se incuba la placa durante períodos más largos de tiempo entre la edad de los puntos. Las placas se pueden colocar a 4 ° C durante la noche. </li></ol> Parte 5: Los resultados representativos. Los datos en bruto producido por un experimento de replicación vida es una lista de números correspondientes a las células hijas producidas por cada célula madre en cada etapa de punto (Figura 2). Por la suma de cada fila de la hoja de puntuación, la duración de la vida replicativa de cada célula madre se obtiene. Los datos de las células madre del grupo experimental misma pueden ponerse en común para generar una curva de supervivencia (Figura 3) y para realizar cálculos estadísticos, tales como vida media, tiempo de vida media y la desviación estándar. Una prueba no paramétrica, como el Wilcoxon test, se puede realizar para determinar si las diferencias significativas en la duración de la vida se han detectado entre los grupos experimentales. Cuando el experimento funciona correctamente, la curva de supervivencia debe ser más o menos consistente con Gompertz-Makeham cinética sigmoidal mostrando un shap con la mortalidad temprana baja siguió un descenso relativamente rápido de la supervivencia y un aplanamiento de la curva de la edad de la tarde. La mayoría de las cepas salvajes han replicativa valores de esperanza de vida en el rango de la generación 20-30, aunque fuera de la variación de esta gama ha sido reportado. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig1.jpg" alt="la figura 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1209/fig1.2.jpg" alt="Figura 1.5" /> Figura 1. Diagrama de una placa lapso replicativa típica vida. La noche antes de comenzar la microdisección de células de levadura, 3-5 cepas son ligeramente parcheado en la superficie de una placa de YEPD (cajas de color rojo) en una línea vertical a lo largo de un lado de la placa. Después de un crecimiento durante la noche, aproximadamente 30 celdas individuales de cada cepa se ordenan verticalmente en una línea que contiene 20 posiciones. Esperanza de vida analysis se llevará a cabo en las células v hija virgen obtenido de estas células iniciales. Las células adicionales que se obtienen a partir de microdisección durante el experimento (por ejemplo, las células hijas no deseados) son colocados en &quot;el cementerio&quot; (óvalo gris), que se encuentra lejos de las células experimentales con el fin de evitar el agotamiento local de nutrientes, como las colonias se forman. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig3.jpg" alt="la figura 2" /> Figura 2. Una vida replicativa lapso hoja de registro. Los datos brutos de un experimento de vida replicativa se muestra. Cada fila corresponde a una célula de levadura madre soltera y cada columna corresponde a una edad más puntos. El número de inscritos en cada casilla es el número de células hijas producidas por que la célula madre a esa edad-punto. Cada cepa se etiqueta con un número codificado de tal manera que el individuo la disección de las células de levadura no tiene conocimiento de la identidad de las cepas que se analiza. Veinte células se analizan para cada cepa. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig2.jpg" alt="la figura 3" /> Figura 3. Representante de la supervivencia y las curvas de crecimiento de un experimento de vida replicativa. (A) Las curvas de supervivencia se obtienen mediante el trazado de la fracción de células madre aún vive en función de la edad de replicación (número de divisiones celulares. (B) Las curvas de crecimiento se obtienen mediante el trazado de la número medio de células hijas producidas por una cepa determinada en función de la edad de punto. En este ejemplo, la cepa n º 2 es de mayor duración, pero es más lento crecimiento, como lo demuestra la reducción de la pendiente inicial de la parcela de crecimiento.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Agar</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems)</td>
<td>DF0145-17-0 (214530)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bacto-Peptone</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems)</td>
<td>DF0118-17-0 (211677)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast Extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems)</td>
<td>DF0886-17-0 (288620)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

measuring replicative life span in the budding yeast

El envejecimiento es un proceso degenerativo caracterizado por un deterioro progresivo de los componentes celulares y orgánulos que resulta en la mortalidad. La levadura en ciernes<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Se ha utilizado ampliamente para estudiar la biología del envejecimiento, y hay varios factores determinantes de la longevidad de la levadura se ha demostrado que se conserva en eucariotas multicelulares, incluyendo gusanos, moscas y ratones<sup&gt; 1</sup&gt;. Debido a la falta de cuantificar fácilmente fenotipos asociados con la edad, el envejecimiento en la levadura se ha ensayado casi exclusivamente por la medición de la vida de las células en diferentes contextos, con dos diferentes paradigmas vida útil de uso común<sup&gt; 2</sup&gt;. Tiempo de vida cronológico se refiere a la cantidad de tiempo que una célula madre puede sobrevivir en una que no se dividen, la quietud, como estado, y se propone servir de modelo para el envejecimiento de las células post-mitóticas en las células eucariotas multicelulares. Lapso de la vida replicativa, por el contrario, se refiere al número de células hijas producidas por una célula madre antes de la senescencia, y se cree que ofrecen un modelo de envejecimiento de las células activas mitóticamente. Aquí se presenta un protocolo generalizado para medir la duración de la vida replicativa de las células de levadura en ciernes madre. El objetivo del ensayo de replicación vida es determinar cuántas veces los brotes de células madre. Las células madre y la hija se pueden distinguir fácilmente por un investigador experimentado con un microscopio óptico estándar (un aumento total de 160X), como el Zeiss Axioscope 40 u otro modelo similar. La separación física de las células hijas a partir de células madre se realiza mediante un micromanipulador manuales equipado con una aguja de fibra óptica. Típico de las cepas de levadura de laboratorio produce 20 a 30 células hijas por madre y un experimento de vida requiere de 2-3 semanas.

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Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

En este artículo presentamos un protocolo general para la medición de la duración de la vida replicativa de las células madre de la levadura.

Medición de Span replicativa vida en la levadura en ciernes

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

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Research

JoVE Journal

Biology

20.5K vistas.  University of Washington. En este artículo presentamos un protocolo general para la medición de la duración de la vida replicativa de las células madre de la levadura.

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Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en el medio sólido

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Investigación

Biología

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and chronological life spans are two established paradigms used to study aging in yeast. Replicative aging is defined as the number of daughter cells a single yeast mother cell produces before senescence; chronological aging is defined by the length of time cells can survive in a non-dividing, quiescence-like state 2. We have developed a high-throughput method for quantitative measurement of chronological life span. This method involves aging the cells in a defined medium under agitation and at constant temperature. At each age-point, a sub-population of cells is removed from the aging culture and inoculated into rich growth medium. A high-resolution growth curve is then obtained for this sub-population of aged cells using a Bioscreen C MBR machine. An algorithm is then applied to determine the relative proportion of viable cells in each sub-population based on the growth kinetics at each age-point. This method requires substantially less time and resources compared to other chronological lifespan assays while maintaining reproducibility and precision. The high-throughput nature of this assay should allow for large-scale genetic and chemical screens to identify novel longevity modifiers for further testing in more complex organisms.

Chronological aging in yeast refers to the loss of cell viability associated with time in stationary phase. Here we describe a high-throughput method for quantitatively determining yeast chronological life span.

Cuantificar cronológico levadura Duración de la vida por consecuencia de células envejecidas

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

La purificación de la M. magneticum Tensión AMB-1 magnetosomas proteína asociada MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Análisis de la elaboración de un fenotipo morfológico en función de la concentración de proteínas en la levadura en ciernes

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en 96 placas de microtitulación Bueno

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

La medición de la cinética de la transcripción de ARNm en las células vivas solo

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

La adquisición de fluorescencia Time-lapse películas de levadura en ciernes y el análisis de la dinámica de una sola célula con injertos

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Florecimiento extracción de proteínas de levadura y purificación para el Estudio de la función, las interacciones y modificaciones post-traduccionales

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Medición de la osmótica de agua Coeficiente de Permeabilidad (P<sub&gt; F</sub&gt;) De células esféricas: protoplastos de plantas aisladas como ejemplo

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.