Imperial College in vivo görüntüleme tesiste MRC tarafından finanse edildi.

1. Fare Hazırlık <ol><li> Çalışma için gerekli 18-20 g C57BL/6J fareler satın ya da yeterince cins. </li><li> Fareler harici bir tedarikçiden satın varsa, tesise ulaşım ardından, gut Mikrobiyota stabilize etmek için otoklava gıda ve su 1 hafta fareler alıştırmak. </li><li> , Kulak çentik tartılır ve kafes başına farelerin gerekli sayıda ayırın. </li><li> Enfeksiyona önce gün, herhangi bir anestezi yapmadan önce, prosedürün süresi için yeterli oksijen ve izofluran olup olmadığını kontrol edin. Gerekirse, daha fazla isofluorane eklemek veya oksijen tüpü değiştirin. Daha sonra, onların ilk kullanımdan bu yana 50&#39;den fazla g kazanmış ise, anestezi temizleyiciler ağırlığını kontrol atın ve taze temizleyiciler ile değiştirin. </li><li> 7 dakika boyunca VEET kullanılarak XGI-8 Anestezi Sistemi ve tüylerini içinde% 3 Isofluorane kullanılarak Anaesthetise farenin. </li><li> Notlar: <ul><li> Kapsamlı epilasyon, özellikle de önemlidirkürk melanin olarak siyah fareler önemli ölçüde bioluminescent sinyal 3,15 azaltır. </li><li> Kürk regrow başlamadan önce farelerin epilasyon genellikle 8-10 gün sürer. Ilgi alanı görüntüleme oturumları için çıplak böylece gerektiğinde daha uzun süreler boyunca 4D Multimodalite görüntüleme gerçekleştirmek için, fareler tüylerini. </li><li> Fare bir Biyogüvenlik Seviyesi 2 (BSL-2) muhafaza tesisinde yerleştirilmiştir. </li></ul></li></ol> 2. Bakteriyel hücre hazırlanması <ol><li> Yeterli Kanamisin [50 mg ml -1] ile takviye Luria Burtani suyu ve agar plakaları gerekli ° C kadar 4 de çalışma ve mağaza için gerekli hazırlayın. </li><li> Enfeksiyon öncesi gün ° C arasında bir dondurarak saklamaya uygun vialler çözülme rodentium gerginlik ICC180 ve hemen Kanamisin [50 mg ml -1] 220 rpm gecelik ve kültür, 37 ° C ile desteklenmiş bir cryobead için 15 ml LB suyu ekleyin Orta kirlenme için bir kontrol olarak, ek bir hazırlamakKanamisin [50 mg ml -1] 220 rpm, 37 ve kültür ° C ile desteklenmiş aşılanmamış 15 ml LB suyu </li><li> Ertesi sabah (~ 16 saat), bakteriyel büyüme işareti olarak bulanıklık için orta kontrol edin. Kontrol açık ise, bir şahin tüp ICC180 kültür transferi ve 4,000 devirde santrifüj. Daha sonra, PBS içinde bakteryel tanelerin yıkayın. Daha sonra 1.5 ml PBS (Kanamisin ile desteklenmiş LB, orijinal hacminin 1/10) içinde tekrar süspansiyon ve bakteriyel inokulum oluşturmak için iyice karıştırın. </li><li> ICC180 düzgün kültür ve görüntü daha önce 1 açıklandığı gibi Yaşam Resim 4.3.1 sihirbaz BLI ve otomatik ayarını kullanarak IVIS Spektrum CT aşı, önce farelerin enfeksiyona biyolüminesans değil doğrulamak için. Not: <ul><li> Gerilme ICC180 vahşi tip C bir biyolüminesans türevidir rodentium ICC169 2. Bu bakteri suşu, K dahil olmak üzere, lux CDABE operon&#39;u varanamycin direnç geni kromozom 2 xylE bir sözde eklenir. </li><li> Standart aseptik teknikler kullanılarak tüm bakteriyel kültür yürütmek ve gerekirse ya steril sarf / reaktif satın almak veya kullanmadan önce otoklav. </li><li> Adım 2.4 &#39;de, biyolüminesans süresi (P / S / cm 2 / sr) farelerin enfeksiyon öncesi bakteri sayısı tahmin etmek için de kullanılabilir. </li></ul></li></ol> 3. Bioluminescent C ile farelerin enfeksiyonu rodentium ve Bakteriyel Kolonizasyon Değerlendirilmesi <ol><li> Enfeksiyon öncesinde, prosedürün süresi için yeterli oksijen ve izofluran olduğunu gösterir. Gerekirse, daha fazla isofluorane eklemek veya oksijen tüpü değiştirin. Daha sonra, onların ilk kullanımdan bu yana 50&#39;den fazla g kazanmış ise, anestezi temizleyiciler ağırlığını kontrol atın ve taze temizleyiciler ile değiştirin. </li><li> Bir XGI-8 anestezi kullanılarak% 3 Isofluorane ile Anaesthetise fareninsia Sistem insani kısıtlama sağlamak. </li><li> Iyice bakteriyel inokulum karıştırın ve şırıngaya 0.2 ml (yaklaşık 5 x 10 9 kob ICC180) çizin. </li><li> Sıkıca başparmak ve işaret parmağı ile boyun arkasındaki cilt tutarak bir zaman ve ense onlara anestezi sistemi birinden fareler çıkarın. </li><li> Dil üzerinde, ve yemek borusu aşağı, ağız çatı doğru sonda iğne itin ve mideye bakteri inokulum enjekte. </li><li> Farelerin ağızdan sonda ardından, bakteriyel inokulum akciğerlere teslim edildiğini bir işareti olabilir sıkıntı belirtileri için onların yürüme ve nefes izlemek. Akciğerlerde aşılanmış olan herhangi bir fare Euthanize. </li><li> Bir vasıta kontrolü olarak 200 ul PBS ile sonda enfekte farenin, Adım 3.1-3.6 tanımlanmıştır. </li><li> Ağızdan sonda doğru olarak yapıldığını onaylamak için, IVIS Spektrum CT görüntü enfekte ve sahte enfekte olmuş fareler Yaşam BLI ve otomatik ayarını kullanarakResim 4.3.1 sihirbaz olarak daha önce 1 nitelendirdi. </li><li> PBS içinde seri seyreltme ile inokulum içinde canlı bakteri sayısını belirlemek ve Kanamisin ile desteklenmiş LB agar üzerine üç nüsha olarak tespit [50 mg ml -1]. </li><li> Orada yaklaşık 5-50 koloni olduğunu ve seyreltme her noktadan kolonilerin sayısını ve koloniler sayılır olduğunu seyreltme kayıt bir seyreltme bularak ICC180 hücre / ml sayısını hesaplayın. Daha sonra, cfu ortalaması (üç noktalar) hesaplamak ve seyreltme faktörü 50 (her nokta orijinal 1 ml numune 20 ul) ve koloniler kob / ml vererek, üzerinde sayıldı seyreltme ile bu değeri çarpın. </li><li> Önceden tartılmış bir Eppendorf tüpü (iyi bir denge ağırlığında) her bir fareden alınan dışkı toplayarak günlük farenin kolonizasyonu izlenmesi ve numunenin ağırlığı (0.1 g ml-1) göre PBS içinde 1/10 seyreltilmiş. </li><li> Içinde canlı bakteri sayıları belirleyinPBS içinde seri seyreltme ile ve LB agar üzerine üç kopya olarak tespit dışkı kanamisin ile takviye [50 ug ml-1]. </li><li> Adım 3.9 izleyerek dışkı gramı başına canlı bakteri sayısını hesaplayın, o cfu / g ila 0.1 ug ml-1 PBS içinde fekal seyreltme faktörü (adım 3.10) ile cfu / ml sayısının çarpın. </li><li> Farenin saf ICC180 kültürü ile aşılandı ve olduğunu belirlemek için kolonilerin biyolüminesans vardır. Adım 3,8 agar plakaları almak, gözle ya da bakteri koloni morfolojisi değerlendirmek ya da plaka bir temsilci koloni almak ve ışık mikroskobu ile analiz. Gerekirse, bakteri tanımlama Kültür saflığını değerlendirmek üzere gerginlik spesifik koloni PCR ile gerçekleştirilebilir. Daha sonra, görüntü BLI kullanarak IVIS Spektrum CT tabak gibi adım 3.7 &#39;de açıklanan ve plaka üzerinde kolonilerin% 100 biyolüminesens olup olmadığını kontrol edin. Notlar: <ul><li> Sonda iğne takmadan adım 3.4, in, Bu akciğerlere gitmek için inokulum neden olarak direnç, sonda iğne zorlamayın hissediyorum. Bunun yerine, iğne yeniden takın ve yavaşça tekrar deneyin. </li><li> Adım 3.1 isteğe bağlıdır ve fareler anestezi enstitüleri hayvan refahı politikasına bağlı olmadan zorla ağız yolundan verilmiştir sözlü olabilir. </li><li> Dışkı tahsil edildikleri o gün kaplama olmalıdır. C rodentium 4 PBS ° C gecede yaptı ve yanlış kob / g dışkı miktarının neden olsa bile büyüyecek. </li></ul></li></ol> 4. Enfekte Farelerin μCT Görüntüleme günlük Kompozit 3D Yaygın Işık Görüntüleme Tomografi (DLIT-μCT) Hayvan refahı hususlar: DLIT-μCT bir hareketsiz hayvan, hızlı, düşük radyasyon dozu μCT tarama (iki fare tarama için ~ 23 mGy, ~ tek bir fare tarama için 53 mGy) ile entegre DLIT optik görüntüleme içerir. Bu doz her bir görüntüleme oturumu ile birikir, bu nedenle amacı doz lo olarak tutmakmümkün w (ve her zaman iyi LD 50/30 altında) hala çalışma yerine ise. Farelerin geleneksel BLI tarama enfeksiyon belirtisi varsa Bazı durumlarda, μCT tarama daha dozu en aza indirmek için önlenebilir. Radyasyona maruz kalma ile ilgili herhangi bir endişe varsa doz uzun süreli çalışmalarda, mümkün olduğu kadar düşük tutulur olsa da, fare zararlı belirtilerin ilk işareti veya μCT görüntüleme süresi sonunda itlaf edilecektir. <ol><li> Önce görüntüleme için, IVIS Spektrum BT başlatmak ve X-ray güvenlik kilitleri çalışma ve ısıtmalı sahne görüntüleme için doğru sıcaklığı (37 ° C) olduğunu kontrol edin. Daha sonra, anestezi sistemi ve anestezi sürükleyiciler ağırlığını içinde isoflourane seviyesini gösterir. Gerekirse, daha isofluorane ekleyebilir ve çöpçüler ilk kullanımdan bu yana 50&#39;den fazla g kazanmıştır varsa, atın ve taze temizleyiciler ile değiştirin. </li><li> Spektrum CT kurmak böylece görüntüleme parametreleri oYaşam Resim 4.3.1 &#39;de otomatik pozlama özelliği görüntüleme bakteriyel lusiferaz için optimize edilmiştir çalıştırın. Düzenle seçeneğini seçin&gt; Tercihler&gt; Toplama ve Otomatik Pozlama Pencere. Sonra&gt; Aralık Değerler&gt; Uzm seçin. Zaman (saniye) ve&gt; Max ayarlayın. 300s için. Son olarak,&gt; Hedef Sayısı (en az)&gt; Işıklı seçin ve 10.000 sayıları ayarlanır. </li><li> Spektrum BT içine bir fare görüntüleme platformu takın ve çekül bu anestezi içine. </li><li> X-ray güvenlik kilidi açın ve IVIS başlatmak. </li><li> IVIS Spektrum CT başlatıldı sonra, insani kısıtlama sağlamak için XGI-8 Anestezi Sistemi kullanılarak% 3 isofluorane ile fareler anaesthetise. </li><li> Bir DLIT-μCT tarama, BLI kullanarak fare gibi tek bir fare görüntüleme platformda, daha önce 1 açıklanan öncesi görüntü gerçekleştirmek için gerekli olup olmadığını belirlemek için. Güçlü bir sinyal elde edilir, fare DLIT görüntüleme için uygundur. Bir fare görüntüleme platfor olarak anestezi fare bırakınDLIT-μCT için BLI taramadan sonra hazırım. </li><li> Için set-up DLIT-μCT tarama Yaşayan Image yazılımı 4.3.1 &#39;de Görüntü Sihirbazı kullanın. Görüntü Sihirbazı otomatik olarak FOV, gürültü oranı en iyi sinyal vermek için μCT görüntüleme için DLIT ve FOV, maruz kalma süresi, filtre setleri ve binning için maruz kalma süresi, F-stop ve binning belirler. Görüntü Sihirbazı tarafından istendiğinde, sadece 560, 580, 600, ve 620 nm emisyon filtreleri içerir ve tek bir fare μCT tarama seçin. Ardından&gt; görüntüleme başlatmak için edinin. </li><li> Görüntüleme sonra kafesine anestezi fare dönmek, Spektrum CT bir fare görüntüleme platformu çıkarın ve 1% Tri-gen kullanarak dezenfekte edin. Gerekirse, fare fareler arasında çapraz kontaminasyon riskini en aza indirmek için konumlandırılmış olduğu köpük yastık değiştirin. </li><li> Kadar bir 4D mo yapmak için gerekli boyuna görüntüleme verileri oluşturmak için adımlar olarak 4,1-4,8 açıklandığı DLIT-μCT, kullanarak gün 8 yazılan enfeksiyon (PI) günlük Resim farelerenfeksiyon vie. Not: <ul><li> Adım 4.7 olarak, görüntü bakteriyel biyolüminesans için 560-620 nm emisyon filtre kullanımını tavsiye ederiz. Bakteriyel biyolüminesans zirvesine doku optik (fare doku ile yeşil / mavi fotonların önemli zayıflama) nedeniyle 485 nm, yaklaşık olmasına rağmen, onlar sinyal derinlik hesaplama kolaylaştırmak olarak 3D rekonstrüksiyon için turuncu / kırmızı fotonlar kullanmak önemlidir . </li><li> DLIT için Yaşam Resim 4.3.1 &#39;de&#39; otomatik &#39;pozlama ayarları yakalanan fotonların miktarı ve her filtre seti için kullanılan maksimum görüntüleme zaman optimize etmek için ayarlanması gerekebilir. </li><li> Bu, örneğin bir tespit bioluminescent sinyal, varsa araştırmacı emin değilken yeni bir enfeksiyon modeli kullanırken BLI öncesi görüntüleme adım 4,6 tarif gerçekleştirmek için gereklidir. </li></ul></li></ol> 5. DLIT-μCT Görüntüleme Veri 3D İmar <ol><li> Açık Yaşam Image yazılımı 4.3.1 ve seçin&gt;, DLIT-μCT dosyaları içeren klasörü bulun ve açın. </li><li> Örneğin C. için, Yaşayan Image Browser en DLIT-μCT dosyasını açın Yük tıklayarak rodentium Gün 1 PI. </li><li> Aracı Palet seçin&gt; Yüzey Topoloji&gt; Çıplak fare, tıklatın eşik ayarlayın ve&gt; Yüzey oluşturun. Yüzey yeniden başarılı olursa bir yüzey anahat 3D görünüm penceresinde görüntülenir. </li><li> 3D görünüm penceresinde işlenen μCT tarama görüntülemek için, (&gt; 3D optik araçlar ve unselect&gt; Teşhir Alanı Nesne tıklayın) yüzey çizgiyi gizlemek veya (&gt; 3D optik araçları tıklayın ve&gt; donukluk kaydırma çubuğunu ayarlayın) yüzey donukluk azaltmak. </li><li> 3D DLIT yeniden detaylı anatomik lokalizasyonu bu işlemleri sadece fare iskeleti görünür olduğunu ve optimum kontrast sahip olduğu 3D hacimsel veri (μCT tarama) değiştirmek için gereklidir sağlamak. &gt; 3D modelli araçları ve seçin&gt; Logaritmik Histogram, G tıklayınradient Aydınlatma, Kalite ve Denoise. Son olarak, sağa Histogram sürgüsünü ayarlayın ve 3D hacimsel veri değişim kontrast izleyin. Sadece kemikleri net bir şekilde görülebiliyor kadar veri ayarlama tutun. İsterseniz, histogramı transfer fonksiyonu puan için rengini değiştirmek. </li><li> Sonraki seçin&gt; DLIT 3D Aracı Palet İmar ve sadece 560, 580, 600, ve 620 nm in vivo görüntüleme bakteriyel lusiferaz için gerekli filtre setleri, seçilmiştir emin olun. Tıklayın Başlat&gt;. Veri Önizleme Penceresi menüsü 2D görüntülendi fare spektral filtre BL sinyaller görünür. Bu sinyaller otomatik olarak yazılım tarafından eşiklenir, ancak menünün altındaki sekmeleri kullanarak gerekirse manuel olarak ayarlanabilir. Eşik yeniden veri olarak dahil edilecek minimum veri yoğunluğu (resimde maksimum sinyal yüzdesi olarak temsil) belirler. </li><li> Sonraki seçin&gt; DLIT 3D Aracı Palet İmar ve DLIT yeniden inşası için kullanılan optik özellikleri doğru olup olmadığını kontrol edin. &gt; Özellikler sekmesini seçin ve Doku Özellikleri ayarlarını fare doku olarak ayarlanmış olduğundan emin olun, Kaynak Spektrum Bakteri ayarlanır. </li><li> Tıklayın&gt; DLIT yeniden gerçekleştirmek için Yeniden İnşa. </li><li> DLIT-μCT 3D film tıklama oluşturmak için&gt; Araçlar&gt; 3D animasyon ve seçin&gt; Önceden Animasyonlar&gt; sola Y ekseni ve&gt; Toplam Süre&gt; 10 sn (saniyede 25 kare). 3D animasyon için ayarları doğru basın&gt; Kayıt ve gibi DLIT-μCT 3D rekonstrüksiyon kaydetmek kez. Ayrı bir klasörde deney, grup ve zaman noktası ile etiketli avi dosyaları. Not: <ul><li> Yaşam Resim 4.3.1 ve yüklü bir hizmet paketi 1 ile ve PC Multi-modalite görüntüleme yazılımı çalıştırmak için uygun bir grafik kartı olan bir PC kullanmak DLIT-μCT veri 3D rekonstrüksiyon yaparken önemlidir. Thyazılım indirilebilir olduğunu ve GPU özellikleri sürüm notları (içerdiği <a href="http://www.caliperls.com/support/software-downloads.htm" target="_blank">http://www.caliperls.com/support/software-downloads.htm</a> ). </li><li> DLIT-μCT 3D rekonstrüksiyon kaydedilir sonra geriye doğru görünüyorsa, bilgisayarınıza grafik sürücüsünün eski bir sürümünü çalıştıran ve bu üreticilerin web sitesinden bir güncelleştirme indirerek düzeltilmesi olabilir. </li><li> Adım 5&#39;te, 3D DLIT-μCT rekonstrüksiyon üretmek için tercih edilen ayarları mevcut. Ancak, bu protokolde ele değildir parametreler değiştirilebilir 3D rekonstrüksiyon sırasında birden fazla nokta vardır. Oturma Resim 4.3.1 kullanarak 3D rekonstrüksiyon için kapsamlı bir rehber için üreticilerin kullanım kılavuzuna bakınız. </li><li> Onlar karşılaştırılabilir böylece çok yöntemi görüntüleme aracında aynı ayarları kullanarak 3D rekonstrüksiyon oluşturmak için önemlidir. Ek olarakBu, DLIT-μCT 3D rekonstrüksiyon oluştururken, bu ikinci ve toplam süresi kare aynı sayıda (uzunluk), aksi takdirde 4D video zamanlaması homojen değildir kullanarak video yapmak önemlidir. </li></ul></li></ol> 6. C. bir 4D Film Üretimi rodentium Enfeksiyon <ol><li> Açıkçası kolay erişilebilir bir klasöre doğru deneme, zaman noktasında ve grubu ile DLIT-μCT 3D rekonstrüksiyon her etiket. </li><li> Windows Live Movie Maker yeni bir dosya oluşturun ve adım 6.1 hazırlanan klasöründen araçları sekmesini kullanarak gün 1 PI kronolojik sırayla DLIT-μCT rekonstrüksiyon takın. </li><li> Uygun DLIT-μCT Video seçip Ana seçerek örnek Gün 1 PI için, zaman noktasında anlatan her videonun başlangıç ​​için başlık ekleme&gt; Başlık Ekle. Bir metin kutusu uygun efsane eklenir ekranda, görünür. Des olarak yazı tipi boyutu, stil, renk, ve gerekçe ayarlayınyazılım araç çubuğundaki Microsoft Word ile aynı sekmeleri kullanarak IRED. Son olarak, videonun sol üst köşesine başlık hareket ettirin. </li><li> DLIT-μCT tüm videoları için adım 7.3 tekrarlayın. </li><li> Bir başlık sayfası ekleme, örneğin C. Ana Sayfa tıklayarak 1-8 rodentium enfeksiyonu gün&gt; Başlık. Bir metin kutusu uygun başlık boş bir slayt eklenir ekranda görüntülenir. Yazı tipi boyutu, stil, renk, ve yazılım araç çubuğundaki Microsoft Word ile aynı sekmeleri kullanarak istediğiniz gibi gerekçe ayarlayın. </li><li> Bir Movie Maker proje filmin başlığı ile uygun bir klasörde * mmp olarak proje kaydedin. Eğer film değişiklik istiyorsanız bu adım önemlidir. </li><li> A. Wmv dosyası olarak film kaydedin. Movie Maker menüsü&gt; bilgisayar için film&gt; kaydedin. </li><li> . Avi veya bilgisayarınızla uyumlu başka bir uygun dosya türü için bir dosya dönüştürücü kullanarak film yapımcısı dosyası dönüştürme. Notlar: <ul><li> Bu tavsiye edilir 4D filmWindows&#39;un yüklü Live Movie Maker (bir PC üzerinde oluşturulan <a href="http://windows.microsoft.com/en-GB/windows7/products/features/movie-maker" target="_blank">http://windows.microsoft.com/en-GB/windows7/products/features/movie-maker</a> ) ve. wmv çalabilen iyi bir multi-medya programı veya. avi dosya türlerini. </li></ul></li></ol>

<ol>
	<li>Chang, M. H., Cirillo, S. L., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Luciferase+to+Image+Bacterial+Infections+in+Mice.">Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice.</a> J. Vis. Exp. (48), e2547 (2011).</li><li>Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+of+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium.">In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infect Immun. 74, 5391-5396 (2006).</li><li>Wiles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+specificity,+colonization+and+clearance+dynamics+in+vivo+following+oral+challenges+with+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium.">Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Cell Microbiol. 6, 963-972 (2004).</li><li>Wiles, S., Dougan, G., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+a+'hyperinfectious'+bacterial+state+after+passage+of+Citrobacter+rodentium+through+the+host+gastrointestinal+tract.">Emergence of a 'hyperinfectious' bacterial state after passage of Citrobacter rodentium through the host gastrointestinal tract.</a> Cell Microbiol. 7, 1163-1172 (2005).</li><li>Fanning, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifidobacterial+surface-exopolysaccharide+facilitates+commensal-host+interaction+through+immune+modulation+and+pathogen+protection.">Bifidobacterial surface-exopolysaccharide facilitates commensal-host interaction through immune modulation and pathogen protection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2108-2113 (2012).</li><li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection.">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).</li><li>Collins, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-treatment+with+Bifidobacterium+breve+UCC2003+modulates+Citrobacter+rodentium-induced+colonic+inflammation+and+organ+specificity+of+infection.">Pre-treatment with Bifidobacterium breve UCC2003 modulates Citrobacter rodentium-induced colonic inflammation and organ specificity of infection.</a> Microbiology. , 10-1099 (2012).</li><li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts.">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Mol. Microbiol. 18, 593-603 (1995).</li><li>Hardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+replication+of+Listeria+monocytogenes+in+the+murine+gall+bladder.">Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder.</a> Science. 303, 851-853 (2004).</li><li>Szittner, R., Meighen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence,+expression,+and+properties+of+luciferase+coded+by+lux+genes+from+a+terrestrial+bacterium.">Nucleotide sequence, expression, and properties of luciferase coded by lux genes from a terrestrial bacterium.</a> J. Biol. Chem. 265, 16581-16587 (1990).</li><li>Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+measurement+of+antituberculosis+drug+activity+in+vitro+and+in+macrophages+using+bioluminescence.">Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence.</a> J. Antimicrob. Chemother. 67, 404-414 (2012).</li><li>Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+in+vivo+bioluminescent+sources+based+on+multispectral+imaging.">Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging.</a> J. Biomed. Opt. 12, 024007 (2007).</li><li>Cronin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+in+vivo+bioluminescent+imaging+for+the+study+of+bacterial+tumour+targeting.">High resolution in vivo bioluminescent imaging for the study of bacterial tumour targeting.</a> PLoS One. 7, e30940 (2012).</li><li>Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrobacter+rodentium+of+mice+and+man.">Citrobacter rodentium of mice and man.</a> Cell Microbiol. 7, 1697-1706 (2005).</li><li>Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+variations+of+skin+pigmentation+in+C57BL/6+mice+affect+optical+bioluminescence+quantitation.">Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation.</a> Mol. Imaging Biol. 13, 1114-1123 (2011).</li><li>Wiles, S., Crepin, V. F., Childs, G., Frankel, G., Kerton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+biophotonic+imaging+as+a+training+aid+for+administration+of+substances+in+laboratory+rodents.">Use of biophotonic imaging as a training aid for administration of substances in laboratory rodents.</a> Lab Anim. 41, 321-328 (2007).</li><li>Crepin, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+role+of+the+Tir:Nck+and+Tir:IRTKS/IRSp53+signalling+pathways+in+vivo.">Dissecting the role of the Tir:Nck and Tir:IRTKS/IRSp53 signalling pathways in vivo.</a> Mol. Microbiol. 75, 308-323 (2010).</li><li>Willekens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+radiation+dose+in+micro-CT+with+optimization+of+the+scan+protocol.">Evaluation of the radiation dose in micro-CT with optimization of the scan protocol.</a> ContrastMedia Mol. Imaging. 5, 201-207 (2010).</li><li>Boone, J. M., Velazquez, O., Cherry, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-animal+X-ray+dose+from+micro-CT.">Small-animal X-ray dose from micro-CT.</a> Mol Imaging. 3, 149-158 (2004).</li><li>Sato, F., Sasaki, S., Kawashima, N., Chino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+effects+of+whole+or+partial+body+x-irradiation+on+mice:+life+shortening.">Late effects of whole or partial body x-irradiation on mice: life shortening.</a> Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med. 39, 607-615 (1981).</li><li>Kohn, H. I., Kallman, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+strain+on+acute+x-ray+lethality+in+the+mouse.+II.+Recovery+rate+studies.">The influence of strain on acute x-ray lethality in the mouse. II. Recovery rate studies.</a> Radiat. Res. 6, 329-338 (1957).</li></ol>

Bu makalenin Üretim ve Serbest Giriş Perkin Elmer tarafından desteklenmektedir. Yazarlar Kevin P, Francis, Jeff Meganck ve Chaincy Kuo Kaliper-A Perkin Elmer Şirket çalışanları. Tüm hayvan deneyleri Hayvanlar Bilimsel Usul Kanunu 1986 uygun olarak yapıldı ve yerel Etik Değerlendirme Komitesi tarafından kabul edildi.

Bakteriyel enfeksiyon 4D film çok yöntemi görüntüleme büyük miktarda veri hızlı ve kolay görselleştirmek ve yorumlamak için bir araç sağlar. Bu teknik bir enfeksiyon tek bir fare aracılığıyla yayılır nasıl detaylı analiz kolaylaştırır ve araştırmak için kullanılabilir nasıl ev sahibi ya da bakteri genleri veya uzunlamasına çalışma 7 sırasında özellikle müdahale stratejilerinin etkisi bakteri yükü, dağıtım, ve yerelleştirme silinmesi. Bu videolar da yararlı öğretim yardımcıları ve kamuoyuna bilgi yaymak için bir araç sağlar. DLIT-μCT görüntüleme ve enfeksiyon 4D Video derlemek yeteneği elde edilen verilerin kalitesini etkileyebilecek bu protokolde pek çok kritik adım vardır. Bu protokolün en önemli parçası C ile farelerin başarılı ve homojen bir enfeksiyondur rodentium. Bu çalışma için kullanılan fareler 18-20 g arasında ve esastır bakteriyelarteriyel mikroorganizma taze hazırlanmış ve yaklaşık 5 x 10 9 CFU, daha önce 2,3 açıklanmıştır. Önce farelerin enfeksiyona bu inokulum Spektrum BT kullanarak ve bir kez aşı hazırlanmıştır biyolüminesens olup olmadığını kontrol etmek önemlidir her fare fareler benzer bulaşıcı dozlarda aldığınızdan emin olmak için zorla ağız yolundan verilmiştir önce, sürekli homojenize edilmelidir. Farelerin DLIT-μCT görüntüleme Yaşam Resim 4.3.1 yazılımında otomatik pozlama fonksiyonu otomatik olarak iyi gürültü üzerinde olması sinyal için optimize edilmiş görüntüleme parametreleri belirler, böylece optimize edilmiştir. Ancak, otomatik pozlama fonksiyonu yordamda açıklandığı gibi değiştirilmesi gerekir kullanıcı tanımlı ayarları ve parametreleri dayanır. Bu takdirde seçerler için Spectrum CT fabrika ayarlarını görüntüleme tümör ifade etmek için programlanmış gibi, enfeksiyon belirgin bir ilerleme neden olmadığını toplanan fotonların az sayıda yoksul görüntüleri neden olacaktırateşböceği lusiferaz. Rekonstrüksiyon 560-620 nm, bu nedenle yeniden dahil etmek daha güvenilir veriler, simüle ve ölçülen veri arasındaki en iyi anlaşma vermek ve kullanıldı. DLIT-μCT kullanımına ilişkin bir sınırlama μCT tarama gelen bu iyonize radyasyon uzunlamasına bir çalışma 18 kümülatif bir alt ölümcül radyasyon hasarı neden olur. Alt öldürücü radyasyona maruz kalma DNA hasarı ve iç organlarda 19 apoptozise yol, bağışıklık yanıtı zayıflatabilir. Iyonize radyasyon için LD 50/30 farelerin fare gerginlik ve yaşa bağlı olarak 5 ila 7 Gy arasında 18,20,21 kullanıldığı, aşılırsa Sonuçta, kümülatif alt ölümcül radyasyon hasarı ölüme neden olabilir. Kapsayıcı ilke konservatif doz tahmin etmek olduğu iyonize radyasyondan moleküler hasar bazı, iyileşmek de, bu genellikle çalışma planlama muhasebeleştirilir değildir. Bunun yerine, amacı çok bel olarak kalmaktırmümkün olduğunca ow bu sınırları hala çalışma hedeflerine ulaşma süre. Bunun nedeni, enfeksiyon için normal bir bağışıklık tepkisinin Bu çalışmada özellikle önemlidir, görüntüleme ve transgenik hayvanlarda bağışıklık gibidir, ya da ağır enfekte olmasından sıklığı iyonlaştırıcı radyasyona karşı daha duyarlı olabilir. Enfeksiyon 4D film oluşturmak için deney planlama, bu deney uzunluğu dikkate alınması önemlidir, μCT sayısı kullanılan fare suşu için iyonizan radyasyon için bu süre sırasında gerekli tarar ve LD 50/30. Bu bakteri tespit sınırları ve görüntüleme kez etkileyecek gibi DLIT-μCT bir başka potansiyel sınırlama, kullanılan bakteri suşu içinde muhabir ifade gücüdür. BLI için daha önce gösterdiği gibi son derece, araştırmacılar tamamen kışkırtıcı bakteri türleri geçerli kullanmanız önerilir, ama maksimum lux operon&#39;u ifade için optimize edilmiştir2,3. 4D görüntüleme mevcut tasarım için bir uyarı her film farklı foton ölçekleme sahip bireysel DLIT-μCT taramalar oluşur olmasıdır. BL odaklar lokalizasyonu, ya da yoğunluğu değişiklikleri ince ise bu yorumlamak görüntüleri zorlaştırabilir veya birden fazla zayıf odaklar çevrili bir yoğun BL odak varsa. Bu nedenle, boyuna görsel için, bu zaman noktalarında renk çubukları tutarlı tutmak için önemlidir. Enfeksiyon 4D film kavramı her bir uygun şekilde etiketlenmiş bakteriyel bir patojene karşı uygulanabilir. Bu tekniğin gelecekteki gelişimi enfeksiyon ev sahipliği yanıtları incelemektir kızılötesi prob yakın floresan biyolüminesens bakteriyel patojenler ve enjektabl bir arada kullanarak enfeksiyonu ev sahipliği yanıtların soruşturma kolaylaştırmak için floresan görüntüleme tomografi (dolaşmak) yanı sıra DLIT kullanmak hedefleyecektir. Buna ek olarak bu, bu protokolde sadeceenfeksiyon 4D filmleri oluşturmak için biyolüminesans bakterilerin kullanımını tarif eder. Bununla birlikte, bazı durumlarda, biyolüminesans muhabir enfeksiyon sırasında ana genetik araştırmak için de kullanılabilir, böylece iRFP ile etiketlendi örneğin, floresan etiketli bakteriler kullanmak gerekli olabilir. Önemlisi, DLIT / Flit-μCT birleştirerek çok yöntemi görüntüleme kullanımı bize non-invaziv azaltılması, arıtma, ve bilimsel araştırmalarda hayvanların kullanımı yerine önemli ölçüde katkı sağlayacak olan bir bakteriyel enfeksiyon sırasında birden çok parametre araştırmak sağlayacak olarak NC3R girişimi (özetlenen <a href="http://www.nc3rs.org.uk/" target="_blank">http://www.nc3rs.org.uk/</a> ).

Küçük hayvan modellerinde, özellikle bu kullanarak farelerde, rutin bakteriyel patogenezi araştırılması veya antibiyotikler, probiyotikler, prebiyotikler ve aşılar 1-7 gibi enfeksiyonlar, için müdahale stratejileri test etmek için kullanılır. Küçük hayvan enfeksiyonlarından ana deneysel okuma. Patojen yük, enfeksiyon mekansal ve zamansal lokalizasyonu ve enfekte organizmanın immün yanıt değişiklikler in vivo optik görüntülemede bulaşıcı hastalık araştırmaları için değerli bir araçtır ve birden fazla izlemek için kullanılabilir haberci genlerin kullanımı (lusiferaz, floresan proteinler, beta-laktamaz, vb) aracılığı ile deneysel okuma, floresan boyalar, nanopartiküller ya da kemiluminesan probları, bir protein, biyolojik bir süreci veya mikroorganizma 6&#39;ya hedeflemiştir. Biyoparlaklık görüntüleme (BLI) patojenik bakterileri tarafından, örneğin, fare ve sıçan gibi küçük hayvanlar, bir kolonizasyon izlemek için kullanılan optik bir görüntüleme yöntemidirria 3,6,8,9. Fareler böyle Photorhabdus luminescens lüks CDABE operonunun olarak, lusiferaz. Bu bakteriler daha sonra in vivo görüntüleme sistemi 3,6,9 merkezli bir CCD kullanarak hafif üretim yoluyla tespit edilebilir ifade rekombinant bakteri bulaşmış. Önemlisi, sadece metabolik olarak aktif mikro-organizmaların tek uygun bakteri hücrelerinin bu yöntem 10,11 ile tespit edilir, yani biyolüminesens (BL) bulunmaktadır. 2B, BLI BL kaynağının konumunu kullanarak sinyali 8 yayılan hayvanın yüzey anlaşılmaktadır. In vivo BL odaklar kesin anatomik lokalizasyon aksine organların 3,6,9 ve ex vivo analizi ile belirlenmelidir, kompozit 3D dağınık ışık görüntüleme tomografi (DLIT) BL bir nicel 3D rekonstrüksiyon derlemek için kullanılabilir kaynak 12. DLIT alınan BL görüntüleri toplayarak gerçekleştirilir tanımlanan dar bant-geçiş optik filtreleri kullanarak vedaha sonra bir yaygın optik tomografi 3 boyutlu rekonstrüksiyon algoritması 1,7,12,13 içine giren. Şu anda, çok modalite görüntüleme ex vivo analizi için gerek kalmadan in vivo bioluminescent odaklarının gerçek non-invaziv anatomik lokalizasyon almak için kullanılabilen tek yöntemdir. Son zamanlarda, DLIT bir arada bir probiyotik bakteri 7 ile koruyucu tedavi sonrasında Citrobacter rodentium (C. rodentium) kolonizasyon dinamikleri değerlendirmek için μCT görüntüleme ile birlikte kayıtlı kullanılır. C rodentium enteropatojenik E. coli ve enterhemorrhagic 14 model insan enfeksiyonu için kullanılan bir sıçangil özel enterik patojendir. ° C. rodentium enfeksiyon genellikle hafif kilo kaybı, ishal, polarize Th1 immün yanıt ve kolon kript hiperplazisi de dahil olmak üzere ve bağlama farklı patolojik değişiklikler ve silen lezyon Formatı ile ilişkili kolit, neden14. Bu, ek olarak, C. rodentium patogenezi iyice Bu bakteri çok yöntem görüntüleme 3,4,7 ile kullanım için ideal bir model mikroorganizma yapma, iyi belgelenmiştir C57BL/6J farelerde BLI ve kolonizasyon dinamikleri kullanılarak incelenmiştir. Bu protokol tek bir multimodalite görüntüleme platformu, IVIS Spektrum BT ve non-invaziv bu enfeksiyonun gerçek dinamiklerini gösteren bir 4D filmin nesil kullanarak bir bakteriyel enfeksiyon entegre DLIT-μCT görüntüleme için bir metodoloji anahat ilk.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioluminescent C. rodentium</td>
			<td>Frankel lab</td>
			<td>ICC180</td>
			<td>Wiles et al., 2004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veet</td>
			<td>Boots</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane (100% v/v)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Oxygen</td>
			<td>BOC Medical</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.10285.0500</td>
			<td>25 g in 1L Demineralised water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.10283.0500</td>
			<td>37 g in 1L Demineralised water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate</td>
			<td>Sigma (Fluka)</td>
			<td>60615</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical Falcon tubes</td>
			<td>BD (Falcon)</td>
			<td>352070</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universals</td>
			<td>Corning (Gosselin)</td>
			<td>E5633-063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD (Plastipak)</td>
			<td>300013</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved</td>
			<td>Vet Tech</td>
			<td>DE005</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbanks (Cryovial)</td>
			<td>Pro-Lab Diagnostics</td>
			<td>PL.170/Y</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum CT</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>133577 Rev A/ Spectrum CT</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6kVA UPS</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI-8 anesthesia system</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>118918</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAF-8 Anaesthesia filter charcoal</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>118999/00</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image v4.3.1 SP1</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop shaking incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 44</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d multimodality imaging of citrobacter rodentium infections in mice

Bu protokol boyuna enfeksiyon döngüsünün dört boyutlu (4D) film oluşturmak için entegre μCT (DLIT-μCT) ile kompozit 3D dağınık ışık görüntüleme tomografi ve bu verilerin sonraki kullanım kullanarak biyolüminesens bakteriyel enfeksiyon izlemek için gereken adımları açıklar. 4D enfeksiyon film geliştirmek ve bir IVIS Spectrum CT kullanarak bakteriyel enfeksiyon çalışmaları için DLIT-μCT görüntüleme doğrulamak için, biz bioluminescent C ile enfeksiyon kullanılan Farelerde kendini sınırlayan kolit neden rodentium. Bu protokol, biyolüminesans C ile farelerin enfeksiyon anahat rodentium ve günlük DLIT-μCT görüntüleme ve 8 gün boyunca dışkı bakteriyel numaralandırma tarafından kolonizasyon non-invazif izleme. IVIS Spectrum BT kullanımı tek bir görüntüleme platformu kullanarak optik ve μCT taramaları kesintisiz ortak kayıt kolaylaştırır. Düşük doz μCT yöntemi farelerin görüntüleme sağlarkümülatif radyasyon eserler neden olmadan 3 boyutlu olarak bioluminescent bakteri odaklarının ayrıntılı anatomik lokalizasyonu sağlayan enfeksiyon sırasında birden fazla zaman noktalarında. Önemlisi, enfekte farelerin 4D film in vivo bakteriyel kolonizasyon dinamikleri izlemek için güçlü bir analitik araç sağlar.

5 x 10 9 cfu C ile C57BL/6J farelerin Enfeksiyon rodentium iyi tarif bakteriyel enfeksiyon modeli ve kendi kendini sınırlayan gastrointestinal enfeksiyon neden olduğu gün 6-8 sonrası enfeksiyon ve 3 ila 4 hafta 2,14 arasında sürer zirveleri. Enfeksiyonun fare bağışıklık sistemi tarafından barsak lümeni ile sınırlıdır ve bunun sonucu olarak, bakteri sürekli dışkı dökülür. C. tarafından farelerin Kolonizasyon rodentium dışkı veya biyoparlaklık görüntüleme 2,3 doğrudan bakteriyel numaralandırma tarafından non-invaziv izlenebilir. Bu el yazması 3D ve C maddeleri 4D Multimodalite görüntüleme gerçekleştirmek için optimize edilmiş bir protokol özetliyor enfeksiyon sırasında bakteri yükü ve yerelleştirme izlemek için fareler içinde rodentium. Şekil 1&#39;de sunulan sonuçlar, başarılı 4D görüntüleme için gerekli kontrolleri göstermektedir. Önceki farelerin enfeksiyon caydırmak için gereklidirkullanılan bakteriyel inokulum biyolüminesans (Şekil 1A) olduğunu benim ve bu bioluminescent C ile bir fare ağızdan sonda takip Sinyal hayvanın mide değildir akciğer (Şekil 1B) 16 gözlenen olabilir rodentium. Biyoparlaklık görüntüleme kullanarak bakteri kolonizasyonu izlemenin yanı sıra, bu dışkı bakteri sayıları ölçmek için iyi bir uygulama, gastrointestinal mukoza bakteri kolonizasyonu dolaylı bir ölçümü olarak kullanıldığı Şekil 2 C57BL6 / J 8 alınan dışkı tipik bakteri yükü göstermektedir. ~ 5 x 10 9 cfu ICC180 ile enfekte ve gündüz 6-7 kadar gün 2 PI 8 gün PI Kolonizasyon artar izlenmektedir fareler nerede ~ 5 de enfeksiyon tepe x 10 10 kob / g, önceki raporlar 2,3,17 doğrultusunda hangi. Değerlendirmenin önemini vurgulamak içinting tek bir fare, Şekil 1b ve 3 yanı sıra Video 1 enfeksiyon yayılmasını C. ardından aynı fare elde edilmiştir yukarıda tarif edildiği gibi rodentium enfeksiyonu. Günlük DLIT-μCT anatomik bir referans olarak iskelet kullanarak, bu fare içinde bioluminescent bakteri mekansal dağılımını değerlendirmek için kullanılmıştır. Şekil 3 az 3 anahtar zaman noktalarında PI ICC180 ile enfekte bir C57BL/6J fare DLIT-μCT yeniden gösteriyor gün 3 PI küçük biyolüminesens odaklar mekansal dağılımı çok az değişiklik ile gün 5 PI tarafından biyolüminesans yoğunluğu ılımlı bir artış gösteren, hangi kolonda görülebilir. Gün 7 PI anda biyolüminesans önemli bir artış ve tüm kolon boyunca bioluminescent odaklar yayılmasını görülmektedir. Video 1 ICC180 ile gün 1-8 PI 3D DLIT-μCT rekonstrüksiyon bir derleme ve C göstermektedirgün kolon günlerinden itibaren kolonda 4-6 PI bakteri sayısı gün bakteriyel odaklar tüm kolon kapsayan 7 PI zirve kadar genişletmek 3 PI yayılır gün 1-2 PI arasındaki proksimal gastrointestinal sistem içinde rodentium. Gün 8 PI sadece iki ayrı bakteri odakları proksimal ve distal kolonda mevcuttur. Kronolojik sıraya göre her zaman noktasında tam 3 boyutlu rekonstrüksiyon görüntüleme olanağı konak patojen ilişkileri analiz etmek için güçlü bir araç temsil eder ve aynı veri kümesi hala bir 3D daha yorumlamak daha kolaydır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig1.jpg" /> Şekil 1.. A 2B biyoparlaklık görüntüleme) Bioluminescent C. inokulum 200 ul ile ağızdan sonda takip rodentium ICC180 inokulum ve B) bir fare. Ok (&gt;) bioluminescent C. göstermektedir rodentium </<html> em&gt; midede. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/50450/50450fig2.jpg" /> Şekil 2,. ° C. rodentium kolonizasyon dinamikleri. C. miktarının rodentium koloni 8 gün PI dışkılarından birimleri oluşturan <img alt="Şekil 3," fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50450/50450fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig3.jpg" /> Şekil 3,. Bioluminescent C. dağınık ışık görüntüleme tomografi-μCT tarama gün 3, 5 ve 7 PI Arrowhead (&gt;) ve kontrol bir fare rodentium enfeksiyon kolon kolonizasyon göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50450/50450fig3large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . Video 1.p :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50450/LAB_MEDIA_50450_Frankel_Video1.wmv &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Videoyu izlemek için burayı tıklayın. bir fare C. rodentium enfeksiyon 4D film gün 1-8 PI izlenebilir

Watch this Scientific Journal Video about 4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice at JoVE.com

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Çok yöntemi görüntüleme küçük hayvan modellerinde bakteri kolonizasyonu eğitim için değerli bir yaklaşımdır. Bu protokol bioluminescent ile farelerin enfeksiyonu özetliyor<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Ve bakteriyel kolonizasyonu boyuna izlenmesi bir 4D film oluşturmak için μCT görüntüleme ile kompozit 3D dağınık ışık görüntüleme tomografi<em&gt; C. rodentium</em&gt; Enfeksiyon.

4D modelli Görüntüleme<em&gt; Citrobacter rodentium</emFarelerde&gt; Enfeksiyonlar

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

4d-multimodality-imaging-of-citrobacter-rodentium-infections-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

12.9K Görüntüleme.  Imperial College London. Çok yöntemi görüntüleme küçük hayvan modellerinde bakteri kolonizasyonu eğitim için değerli bir yaklaşımdır. Bu protokol bioluminescent ile farelerin enfeksiyonu özetliyor Citrobacter rodentium Ve bakteriyel kolonizasyonu boyuna izlenmesi bir 4D film oluşturmak için μCT görüntüleme ile kompozit 3D dağınık ışık görüntüleme tomografi C. rodentium Enfeksiyon.

Video: 4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

Farelerde Görüntü Bakteriyel Enfeksiyonlar Lusiferaz Kullanımı

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

This protocol outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and colitis, as well as the methods used to characterize Citrobacter rodentium infection in mice. C. rodentium is a gram negative, murine specific bacterial pathogen that is closely related to the clinically important human pathogens enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli. Upon infection with C. rodentium, immunocompetent mice suffer from modest and transient weight loss and diarrhea. Histologically, intestinal crypt elongation, immune cell infiltration, and goblet cell depletion are observed. Clearance of infection is achieved after 3 to 4 weeks. Measurement of intestinal epithelial barrier integrity, bacterial load, and histological damage at different time points after infection, allow the characterization of mouse strains susceptible to infection.
The virulence mechanisms by which bacterial pathogens colonize the intestinal tract of their hosts, as well as specific host responses that defend against such infections are poorly understood. Therefore the C. rodentium model of enteric bacterial infection serves as a valuable tool to aid in our understanding of these processes. Enteric bacteria have also been linked to Inflammatory Bowel Diseases (IBDs). It has been hypothesized that the maladaptive chronic inflammatory responses seen in IBD patients develop in genetically susceptible individuals following abnormal exposure of the intestinal mucosal immune system to enteric bacteria. Therefore, the study of models of infectious colitis offers significant potential for defining potentially pathogenic host responses to enteric bacteria. C. rodentium induced colitis is one such rare model that allows for the analysis of host responses to enteric bacteria, furthering our understanding of potential mechanisms of IBD pathogenesis; essential in the development of novel preventative and therapeutic treatments.

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Citrobacter rodentium infection provides a valuable model to study enteric bacterial infections as well as host immune responses and colitis in mice. This protocol outlines the measurement of barrier integrity, pathogen load and histological damage allowing for the thorough characterization of pathogen and host contributions to murine infectious colitis.

<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Model: Bulaşıcı Kolit için çalışılması Patojen ve Host Katılımlar

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Uzun Vadeli Kronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</emFarelerde&gt; Havayolu Enfeksiyon

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutantlar

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

İnsan Plasental ve Desidual Organ Kültürleri Maternal-Fetal Arayüz de Enfeksiyonlar Eğitim için

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to the frequent failure of traditional antibiotic treatments. Alternative therapeutics are urgently needed to tackle MDR bacteria.
An innovative non-antibiotic approach, antimicrobial blue light (aBL), has shown promising effectiveness against MDR infections. The mechanism of action of aBL is not yet well understood. It is commonly hypothesized that naturally occurring endogenous photosensitizing chromophores in bacteria (e.g., iron-free porphyrins, flavins, etc.) are excited by aBL, which in turn produces cytotoxic reactive oxygen species (ROS) through a photochemical process.
Unlike another light-based antimicrobial approach, antimicrobial photodynamic therapy (aPDT), aBL therapy does not require the involvement of an exogenous photosensitizer. All it needs to take effect is the irradiation of blue light; therefore, it is simple and inexpensive. The aBL receptors are the endogenous cellular photosensitizers in bacteria, rather than the DNA. Thus, aBL is believed to be much less genotoxic to host cells than ultraviolet-C (UVC) irradiation, which directly causes DNA damage in host cells.
In this paper, we present a protocol to assess the effectiveness of aBL therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in a mouse model of burn injury. By using an engineered bioluminescent strain, we were able to noninvasively monitor the extent of infection in real time in living animals. This technique is also an effective tool for monitoring the spatial distribution of infections in animals.

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacterial strains have emerged as a serious threat to public health, necessitating the development of alternative therapeutics. We present a protocol to evaluate the effectiveness of antimicrobial blue light (aBL) therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in mouse burns by using bioluminescence imaging.

Çok ilaca dirençli için Antimikrobiyal Mavi Işık Tedavisinin Vivo İncelenmesinin Acinetobacter baumannii Biyoparlaklık ımaging&#39;i kullanarak Enfeksiyonlar Yanık

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

Mycobacterium tüberküloz ile muhabir enzim Floresans farelerde görüntüleme

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ cytosolic concentrations, linked to release from internal stores or an influx through plasma membrane channels, regulate cortical cell processes. Pathogens that adhere to or invade host cells trigger a reorganization of the actin cytoskeleton underlying the host plasma membrane, which likely affects both global and local Ca2+ signaling. Because these events may occur at low frequencies in a pseudo-stochastic manner over extended kinetics, the analysis of Ca2+ signals induced by pathogens raises major technical challenges that need to be addressed.
Here, we report protocols for the detection of global and local Ca2+ signals upon a Shigella infection of epithelial cells. In these protocols, artefacts linked to a prolonged exposure and photodamage associated with the excitation of Ca2+ fluorescent probes are troubleshot by stringently controlling the acquisition parameters over defined time periods during a Shigella invasion. Procedures are implemented to rigorously analyze the amplitude and frequency of global cytosolic Ca2+ signals during extended infection kinetics using the chemical probe Fluo-4.

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Here, we present protocols to visualize calcium (Ca2+) responses elicited by HeLa cells infected by Shigella. By optimizing the parameters of bacterial infection and imaging with Ca2+ fluorescent probes, atypical global and local Ca2+ signals induced by bacteria over a large range of infection kinetics are characterized.

Epitel hücrelerinin Shigella enfeksiyon sırasında CA2 + yanıtları görüntüleme

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

Çift iplikçikli RNA ve desen tanıma reseptörleri negatif anlamda RNA virüsü enfeksiyonu confocal görüntüleme

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Bir yüksek-den geçerek Shigella-belirli bakterisidal tahlil

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...