L&#39;installation dans d&#39;imagerie in vivo à l&#39;Imperial College a été financé par la MRC.

<ol>
	<li>Chang, M. H., Cirillo, S. L., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Luciferase+to+Image+Bacterial+Infections+in+Mice.">Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice.</a> J. Vis. Exp. (48), e2547 (2011).</li><li>Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+of+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium.">In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infect Immun. 74, 5391-5396 (2006).</li><li>Wiles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+specificity,+colonization+and+clearance+dynamics+in+vivo+following+oral+challenges+with+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium.">Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Cell Microbiol. 6, 963-972 (2004).</li><li>Wiles, S., Dougan, G., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+a+'hyperinfectious'+bacterial+state+after+passage+of+Citrobacter+rodentium+through+the+host+gastrointestinal+tract.">Emergence of a 'hyperinfectious' bacterial state after passage of Citrobacter rodentium through the host gastrointestinal tract.</a> Cell Microbiol. 7, 1163-1172 (2005).</li><li>Fanning, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifidobacterial+surface-exopolysaccharide+facilitates+commensal-host+interaction+through+immune+modulation+and+pathogen+protection.">Bifidobacterial surface-exopolysaccharide facilitates commensal-host interaction through immune modulation and pathogen protection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2108-2113 (2012).</li><li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection.">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).</li><li>Collins, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-treatment+with+Bifidobacterium+breve+UCC2003+modulates+Citrobacter+rodentium-induced+colonic+inflammation+and+organ+specificity+of+infection.">Pre-treatment with Bifidobacterium breve UCC2003 modulates Citrobacter rodentium-induced colonic inflammation and organ specificity of infection.</a> Microbiology. , 10-1099 (2012).</li><li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts.">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Mol. Microbiol. 18, 593-603 (1995).</li><li>Hardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+replication+of+Listeria+monocytogenes+in+the+murine+gall+bladder.">Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder.</a> Science. 303, 851-853 (2004).</li><li>Szittner, R., Meighen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence,+expression,+and+properties+of+luciferase+coded+by+lux+genes+from+a+terrestrial+bacterium.">Nucleotide sequence, expression, and properties of luciferase coded by lux genes from a terrestrial bacterium.</a> J. Biol. Chem. 265, 16581-16587 (1990).</li><li>Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+measurement+of+antituberculosis+drug+activity+in+vitro+and+in+macrophages+using+bioluminescence.">Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence.</a> J. Antimicrob. Chemother. 67, 404-414 (2012).</li><li>Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+in+vivo+bioluminescent+sources+based+on+multispectral+imaging.">Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging.</a> J. Biomed. Opt. 12, 024007 (2007).</li><li>Cronin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+in+vivo+bioluminescent+imaging+for+the+study+of+bacterial+tumour+targeting.">High resolution in vivo bioluminescent imaging for the study of bacterial tumour targeting.</a> PLoS One. 7, e30940 (2012).</li><li>Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrobacter+rodentium+of+mice+and+man.">Citrobacter rodentium of mice and man.</a> Cell Microbiol. 7, 1697-1706 (2005).</li><li>Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+variations+of+skin+pigmentation+in+C57BL/6+mice+affect+optical+bioluminescence+quantitation.">Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation.</a> Mol. Imaging Biol. 13, 1114-1123 (2011).</li><li>Wiles, S., Crepin, V. F., Childs, G., Frankel, G., Kerton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+biophotonic+imaging+as+a+training+aid+for+administration+of+substances+in+laboratory+rodents.">Use of biophotonic imaging as a training aid for administration of substances in laboratory rodents.</a> Lab Anim. 41, 321-328 (2007).</li><li>Crepin, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+role+of+the+Tir:Nck+and+Tir:IRTKS/IRSp53+signalling+pathways+in+vivo.">Dissecting the role of the Tir:Nck and Tir:IRTKS/IRSp53 signalling pathways in vivo.</a> Mol. Microbiol. 75, 308-323 (2010).</li><li>Willekens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+radiation+dose+in+micro-CT+with+optimization+of+the+scan+protocol.">Evaluation of the radiation dose in micro-CT with optimization of the scan protocol.</a> ContrastMedia Mol. Imaging. 5, 201-207 (2010).</li><li>Boone, J. M., Velazquez, O., Cherry, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-animal+X-ray+dose+from+micro-CT.">Small-animal X-ray dose from micro-CT.</a> Mol Imaging. 3, 149-158 (2004).</li><li>Sato, F., Sasaki, S., Kawashima, N., Chino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+effects+of+whole+or+partial+body+x-irradiation+on+mice:+life+shortening.">Late effects of whole or partial body x-irradiation on mice: life shortening.</a> Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med. 39, 607-615 (1981).</li><li>Kohn, H. I., Kallman, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+strain+on+acute+x-ray+lethality+in+the+mouse.+II.+Recovery+rate+studies.">The influence of strain on acute x-ray lethality in the mouse. II. Recovery rate studies.</a> Radiat. Res. 6, 329-338 (1957).</li></ol>

Production et le libre accès à cet article est parrainé par PerkinElmer. Les auteurs Kevin P, Francis, Jeff Meganck et Chaincy Kuo sont des employés de Caliper-Une société PerkinElmer. Tous les expérimentations animales ont été effectuées en conformité avec la loi de 1986 animaux de procédures scientifiques et ont été approuvés par le comité d&#39;éthique local.

Le film 4D d&#39;une infection bactérienne constitue un outil utile pour visualiser et interpréter de grandes quantités de données d&#39;imagerie multi-modalité rapidement et facilement. Cette technique facilite l&#39;analyse détaillée de la façon dont l&#39;infection se propage par une souris individuelle et peut être utilisée pour étudier comment la suppression de l&#39;hôte ou des gènes bactériens ou particulier stratégies d&#39;intervention effet de la charge bactérienne, la distribution et la localisation au cours d&#39;une étude longitudinale 7. Ces vidéos fournissent également des outils pédagogiques utiles et un moyen de diffuser l&#39;information au public. Il ya plusieurs étapes critiques dans ce protocole qui pourraient affecter la qualité des données obtenues par imagerie DLIT-μCT et la possibilité de compiler une vidéo 4D d&#39;infection. La partie la plus importante de ce protocole est l&#39;infection réussie et homogène de souris avec C. rodentium. Il est essentiel que les souris utilisées pour l&#39;étude sont entre 18-20 g et que la bactéinoculums rial sont fraîchement préparés et environ 5 x 10 9 UFC, comme décrit précédemment 2,3. Avant d&#39;infection des souris, il est important de vérifier que l&#39;inoculum est bioluminescence utilisant le spectre CT et une fois l&#39;inoculum a été préparé, il doit sans cesse être homogénéisé avant chaque souris est par gavage afin de s&#39;assurer que les souris reçoivent des doses infectieuses similaires. L&#39;imagerie DLIT-μCT de souris a été optimisé de sorte que la fonction d&#39;exposition automatique dans le logiciel 4.3.1 image vivante détermine automatiquement les paramètres d&#39;imagerie optimisés pour que le signal soit bien au-dessus du bruit. Cependant, la fonction d&#39;exposition automatique s&#39;appuie sur les paramètres et les paramètres définis par l&#39;utilisateur qui doivent être modifiés comme décrit dans la procédure. Sinon, cela se traduira par des images pauvres avec un faible nombre de photons collectés qui ne donne pas lieu à une progression évidente dans l&#39;infection, comme les réglages d&#39;usine du spectre CT pour l&#39;exposition automatique sont programmés pour l&#39;imagerie des tumeurs exprimantluciférase de luciole. Reconstructions effectuées à l&#39;aide de 560 à 620 nm donnent le meilleur accord entre les données simulées et mesurées et, par conséquent, les données plus fiables à inclure dans la reconstruction. Une limitation de l&#39;utilisation de DLIT-μCT est que le rayonnement ionisant à partir de l&#39;analyse μCT provoque des dégâts d&#39;irradiation sublétale qui est cumulative au cours d&#39;une étude longitudinale 18. L&#39;exposition aux radiations sub-létaux peut affaiblir la réponse immunitaire, provoquer des lésions de l&#39;ADN et l&#39;apoptose dans les organes internes 19. En fin de compte, dégâts d&#39;irradiation sub-létale cumulatif peut entraîner la mort si le LD 50/30 pour les rayonnements ionisants est dépassé, ce qui est entre 5 et 7 Gy en fonction de la souche de souris et de l&#39;âge des souris utilisé 18,20,21. Bien que certains des dommages moléculaires des rayonnements ionisants peut guérir, puisque le principe fondamental est d&#39;estimer la dose prudente, ce n&#39;est généralement pas pris en compte dans la planification de l&#39;étude. Au lieu de cela, l&#39;objectif est de rester le plus belux de ces limites que possible tout en réalisant les objectifs de l&#39;étude. Ceci est particulièrement important dans cette étude en raison de la réponse immunitaire normale à l&#39;infection, la fréquence de l&#39;imagerie, et le fait que transgénique, immuno-composé, ou fortement animaux infectés peuvent être plus sensibles aux rayonnements ionisants. Lors de la planification de l&#39;expérience pour produire un film 4D d&#39;infection, il est important de considérer la durée de l&#39;expérience, le nombre de μCT analyse requis au cours de cette période et la LD 50/30 pour les rayonnements ionisants pour la souche de souris utilisée. Une autre limite potentielle à DLIT-μCT est la force de l&#39;expression de journaliste au sein de la souche bactérienne utilisée, car cela aura une incidence sur les limites de détection bactérienne et heures d&#39;imagerie. Il est fortement recommandé que les chercheurs utilisent validés souches bactériennes qui sont très virulents, mais optimisée pour lux expression de l&#39;opéron maximal, comme l&#39;a montré précédemment pour BLI2,3. Une mise en garde à la conception actuelle de l&#39;imagerie 4D est que chaque film est composé de scans DLIT-μCT individuels qui ont différente échelle photon. Cela peut rendre les images difficiles à interpréter si les modifications apportées à la localisation de la BL foyers, ou son intensité sont subtiles, ou si il ya un accent BL intense entouré de multiples foyers faible. Par conséquent, pour les visualisations longitudinales, il est important de garder les barres de couleur uniforme dans les points dans le temps. Le concept d&#39;un film 4D d&#39;infection peut être appliquée à n&#39;importe quel agent pathogène bactérien convenablement étiqueté. Le développement futur de cette technique vise à utiliser l&#39;imagerie par fluorescence tomography (EIPC) ainsi que DLIT pour faciliter l&#39;enquête de réponses de l&#39;hôte à l&#39;infection en utilisant une combinaison d&#39;agents pathogènes bactériens bioluminescentes et injectables fluorescentes près de sondes infrarouges pour enquêter sur les réponses de l&#39;hôte à l&#39;infection. En plus de cela, dans ce protocole, nous nedécrire l&#39;utilisation de bactéries bioluminescentes pour créer des films 4D d&#39;infection. Toutefois, dans certains cas, il peut être nécessaire d&#39;utiliser des bactéries marquées par fluorescence, par exemple étiquetés avec IRFP, de sorte que le journaliste de bioluminescence peut être utilisé pour l&#39;étude génétique de l&#39;hôte lors de l&#39;infection. Surtout, l&#39;utilisation de l&#39;imagerie multi-modalité combinant DLIT / FLIT-μCT va nous permettre d&#39;enquêter de manière non invasive des paramètres multiples au cours d&#39;une infection bactérienne, ce qui contribuera de manière significative à la réduction, raffinement, et le remplacement de l&#39;utilisation des animaux dans la recherche scientifique comme indiqué dans l&#39;initiative de la NC3R ( <a href="http://www.nc3rs.org.uk/" target="_blank">http://www.nc3rs.org.uk/</a> ).

Les petits modèles animaux, en particulier ceux des souris en utilisant, sont couramment utilisées pour étudier la pathogenèse bactérienne ou pour tester des stratégies d&#39;intervention pour les infections, comme les antibiotiques, les probiotiques, les prébiotiques et les vaccins 1-7. Les principales lectures expérimentales de petites infections d&#39;origine animale sont la charge de pathogènes, la localisation spatiale et temporelle de l&#39;infection, et les changements de la réponse immunitaire de l&#39;organisme infecté. Imagerie optique in vivo est un outil précieux pour la recherche sur les maladies infectieuses et peuvent être utilisés pour surveiller multiple lectures expérimentales grâce à l&#39;utilisation de gènes rapporteurs (protéines fluorescentes, la luciférase, la bêta-lactamase, etc), des colorants fluorescents, des nanoparticules ou des sondes chimiluminescentes cible à une protéine, un processus biologique, ou d&#39;un microorganisme 6. l&#39;imagerie par bioluminescence (BLI) est une modalité d&#39;imagerie optique utilisé pour surveiller la colonisation de petits animaux comme les souris et les rats, par les bac pathogèneria 3,6,8,9. Les souris sont infectées par des bactéries recombinantes exprimant une luciférase, comme l&#39;opéron lux CDABE de Photorhabdus luminescens. Ces bactéries peuvent alors être détectés par leur production de lumière à l&#39;aide d&#39;un capteur CCD sur la base dans le système d&#39;imagerie in vivo 3,6,9. Surtout, seuls les micro-organismes sont métaboliquement actifs bioluminescence (BL), ce qui signifie que des cellules bactériennes viables sont détectés par cette méthode 10,11. Utilisation 2D BLI, l&#39;emplacement de la source BL est déduit à partir de la surface de l&#39;animal, où le signal est émis 8. La localisation anatomique exacte de la BL foyers in vivo doit être déterminée par l&#39;analyse ex vivo des organes 3,6,9 En revanche, composite 3D diffuse la lumière d&#39;imagerie de tomographie (DLIT) peut être utilisée pour compiler une reconstruction 3D quantitative de la BL source 12. DLIT est effectuée par la collecte des images prises à l&#39;aide BL-filtres optiques passe-bande étroits définis etensuite les entrer dans une tomographie optique 3D algorithme de reconstruction diffuse 1,7,12,13. Actuellement, l&#39;imagerie multi-modalité est la seule méthode disponible pour obtenir la vraie localisation anatomique non-invasive de foyers bioluminescence in vivo sans la nécessité d&#39;une analyse ex vivo. Récemment, nous avons utilisé une combinaison de DLIT co-enregistré avec l&#39;imagerie μCT pour évaluer Citrobacter rodentium (C. rodentium) Les dynamique de colonisation après le traitement prophylactique par une bactérie probiotique 7. C. rodentium est un agent pathogène entérique spécifique murin utilisé pour modéliser l&#39;infection humaine par entéropathogènes et enterhemorrhagic Escherichia coli 14. C. infection rodentium provoque la colite, généralement associée à une légère perte de poids, diarrhée, polarisée réponse immunitaire Th1 et les altérations pathologiques distincts, y compris l&#39;hyperplasie des cryptes du côlon et attachant et effaçant lésion formatile 14. En plus de cela, C. pathogenèse de rodentium a été soigneusement étudiée par BLI et de sa dynamique de colonisation chez les souris C57BL/6J sont bien documentés, faisant de cette bactérie un modèle de micro-organisme idéal pour une utilisation avec la multi-modalité d&#39;imagerie 3,4,7. Ce protocole est le premier à décrire une méthodologie pour l&#39;imagerie DLIT-μCT intégrée d&#39;une infection bactérienne à l&#39;aide d&#39;une seule plate-forme multimodale d&#39;imagerie, le SIIV Spectrum CT, et la génération d&#39;un film 4D montrant la véritable dynamique de cette infection non invasive.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioluminescent C. rodentium</td>
			<td>Frankel lab</td>
			<td>ICC180</td>
			<td>Wiles et al., 2004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veet</td>
			<td>Boots</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane (100% v/v)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Oxygen</td>
			<td>BOC Medical</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.10285.0500</td>
			<td>25 g in 1L Demineralised water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.10283.0500</td>
			<td>37 g in 1L Demineralised water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate</td>
			<td>Sigma (Fluka)</td>
			<td>60615</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical Falcon tubes</td>
			<td>BD (Falcon)</td>
			<td>352070</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universals</td>
			<td>Corning (Gosselin)</td>
			<td>E5633-063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD (Plastipak)</td>
			<td>300013</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved</td>
			<td>Vet Tech</td>
			<td>DE005</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbanks (Cryovial)</td>
			<td>Pro-Lab Diagnostics</td>
			<td>PL.170/Y</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum CT</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>133577 Rev A/ Spectrum CT</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6kVA UPS</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI-8 anesthesia system</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>118918</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAF-8 Anaesthesia filter charcoal</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>118999/00</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image v4.3.1 SP1</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop shaking incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 44</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d multimodality imaging of citrobacter rodentium infections in mice

Ce protocole décrit les étapes nécessaires à suivre longitudinalement une infection bactérienne bioluminescence utilisant la lumière composite tomographie d&#39;imagerie diffuse 3D avec μCT intégré (DLIT-μCT) et l&#39;utilisation ultérieure de ces données pour générer une dimensions (4D) film du cycle d&#39;infection quatre. Pour développer les films d&#39;infection 4D et de valider l&#39;imagerie DLIT-μCT pour des études d&#39;infection bactérienne à l&#39;aide d&#39;un spectre CT SIIV, nous avons utilisé l&#39;infection par bioluminescence C. rodentium, ce qui provoque l&#39;auto-limitation de la colite chez la souris. Dans ce protocole, nous décrivons l&#39;infection de souris avec bioluminescente C. rodentium et la surveillance non invasive de la colonisation par le quotidien imagerie DLIT-μCT et le dénombrement des bactéries dans les excréments pendant 8 jours. L&#39;utilisation du spectre SIIV CT facilite la co-registration transparente des balayages optiques et μCT en utilisant une seule plate-forme d&#39;imagerie. Le μCT modalité à faible dose permet l&#39;imagerie de sourisà plusieurs moments au cours de l&#39;infection, en fournissant la localisation anatomique détaillée de foyers bactérien de bioluminescence en 3D sans causer d&#39;effets secondaires du rayonnement cumulatif. Surtout, les films 4D de souris infectées constituent un outil analytique puissant pour surveiller la dynamique de colonisation bactérienne in vivo.

L&#39;infection des souris C57BL/6J avec 5 x 10 9 UFC C. rodentium est un modèle d&#39;infection bactérienne bien décrit et se traduit par une infection auto-limitation gastro qui culmine entre 6-8 jours après l&#39;infection et dure entre 3 à 4 semaines 2,14. L&#39;infection est confinée à la lumière intestinale par le système immunitaire murin et en conséquence, les bactéries sont continuellement versé dans les fèces. La colonisation de la souris par C. rodentium peut être contrôlée de manière non invasive par énumération bactérienne directe à partir des fèces, ou l&#39;imagerie par bioluminescence 2,3. Ce manuscrit décrit un protocole optimisé pour effectuer 3D et 4D multimodalité imagerie C. rodentium au sein souris pour contrôler la charge bactérienne et la localisation au cours de l&#39;infection. Les résultats présentés dans la figure 1 montrent les contrôles qui sont nécessaires pour l&#39;imagerie 4D succès. Avant l&#39;infection des souris, il est essentiel pour dissuadermine qui l&#39;inoculum bactérien est utilisé bioluminescente (figure 1A) et que, suite à l&#39;gavage d&#39;une souris avec bioluminescente C. rodentium, que le signal peut être observé dans l&#39;estomac de l&#39;animal, et non pas dans les poumons (figure 1B) 16. En plus de surveiller la colonisation bactérienne utilisant l&#39;imagerie par bioluminescence, c&#39;est une bonne pratique de quantifier le nombre de bactéries dans les selles, qui est utilisé comme une mesure indirecte de la colonisation bactérienne de la muqueuse gastro-intestinale La figure 2 montre la charge bactérienne typique dans les selles prélevé sur 8 C57BL6 / J. souris qui ont été infectées par le ~ 5 x 10 9 UFC ICC180 et suivies pendant 8 jours pi colonisation augmente de jour 2 PI jusqu&#39;au jour 6-7 où les pics d&#39;infection à ~ 5 x 10 10 UFC / g, qui est en ligne avec les rapports précédents 2,3,17. Pour souligner l&#39;importance de l&#39;évaluationTing la propagation de l&#39;infection en une seule souris, les figures 1b et 3 ainsi que la vidéo 1 a été généré à partir de la même souris après C. infection rodentium, comme décrit ci-dessus. Daily DLIT-μCT a été utilisé pour évaluer la répartition spatiale des bactéries bioluminescentes dans ce souris, en utilisant le squelette comme une référence anatomique. Figure 3 montre la reconstruction DLIT-μCT d&#39;une souris C57BL/6J infectés par ICC180 à 3 fois les points clé PI A Jour 3 PI petite bioluminescente foyers peut être observée dans le côlon, qui présentent une augmentation modérée de l&#39;intensité de la bioluminescence par jour 5 PI avec peu de changement dans la distribution spatiale. Au jour 7 PI, nous avons observé une augmentation significative de la bioluminescence et la bioluminescence foyers propagation à travers l&#39;ensemble du côlon. Vidéo 1 est une compilation des reconstructions 3D DLIT-μCT de jours 1-8 PI avec ICC180 et illustre C.rodentium dans le tractus gastro-intestinal proximal entre les jours 1-2 PI qui se répand dans le côlon au jour 3 PI De 4-6 jours PI le nombre de bactéries dans le côlon étendre jusqu&#39;à un pic au jour 7 PI où les foyers bactérienne couvre la totalité du côlon. Au jour 8 PI que deux foyers bactériens distinctes sont présentes dans le côlon proximal et distal. La possibilité de consulter la reconstruction 3D complète à chaque point de temps dans l&#39;ordre chronologique représente un outil puissant pour analyser les interactions pathogènes de l&#39;hôte et est plus facile à interpréter que d&#39;une 3D toujours du même ensemble de données. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig1.jpg" /> Figure 1. D&#39;imagerie par bioluminescence 2D A) bioluminescentes C. rodentium ICC180 inoculum et B) d&#39;une souris après gavage avec 200 pi de l&#39;inoculum. Arrowhead (&gt;) illustre bioluminescente C. rodentium </<html> em&gt; dans l&#39;estomac. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig2.jpg" /> Figure 2. C. rodentium dynamique de colonisation. Quantification de C. colonie de rodentium unités formant des selles pendant 8 jours PI <img alt="Figure 3" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50450/50450fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig3.jpg" /> Figure 3. Diffuse la lumière imagerie tomographique μCT scan de bioluminescence C. infection rodentium d&#39;une souris contrôlée au jour 3, 5 et 7 PI Arrowhead (&gt;) illustre la colonisation du côlon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50450/50450fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . Vidéo 1.p :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50450/LAB_MEDIA_50450_Frankel_Video1.wmv &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Cliquez ici pour voir la vidéo. film 4D de l&#39;infection à C. rodentium d&#39;une souris contrôlée à partir de 1-8 jours PI

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4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Imagerie multi-modalité est une approche intéressante pour l&#39;étude de la colonisation bactérienne dans les petits modèles animaux. Ce protocole décrit l&#39;infection de souris avec bioluminescentes<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Et le suivi longitudinal de la colonisation bactérienne en utilisant composite diffuse la lumière tomographie d&#39;imagerie 3D avec l&#39;imagerie μCT pour créer un film 4D<em&gt; C. rodentium</em&gt; Infection.

4D imagerie multimodalité des<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infections chez les souris

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

12.9K vues.  Imperial College London. Imagerie multi-modalité est une approche intéressante pour l'étude de la colonisation bactérienne dans les petits modèles animaux. Ce protocole décrit l'infection de souris avec bioluminescentes Citrobacter rodentium Et le suivi longitudinal de la colonisation bactérienne en utilisant composite diffuse la lumière tomographie d'imagerie 3D avec l'imagerie μCT pour créer un film 4D C. rodentium Infection.

Vidéo: 4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

En utilisant la luciférase aux infections bactériennes chez les souris image

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Recherche

Immunologie et infection

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

This protocol outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and colitis, as well as the methods used to characterize Citrobacter rodentium infection in mice. C. rodentium is a gram negative, murine specific bacterial pathogen that is closely related to the clinically important human pathogens enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli. Upon infection with C. rodentium, immunocompetent mice suffer from modest and transient weight loss and diarrhea. Histologically, intestinal crypt elongation, immune cell infiltration, and goblet cell depletion are observed. Clearance of infection is achieved after 3 to 4 weeks. Measurement of intestinal epithelial barrier integrity, bacterial load, and histological damage at different time points after infection, allow the characterization of mouse strains susceptible to infection.
The virulence mechanisms by which bacterial pathogens colonize the intestinal tract of their hosts, as well as specific host responses that defend against such infections are poorly understood. Therefore the C. rodentium model of enteric bacterial infection serves as a valuable tool to aid in our understanding of these processes. Enteric bacteria have also been linked to Inflammatory Bowel Diseases (IBDs). It has been hypothesized that the maladaptive chronic inflammatory responses seen in IBD patients develop in genetically susceptible individuals following abnormal exposure of the intestinal mucosal immune system to enteric bacteria. Therefore, the study of models of infectious colitis offers significant potential for defining potentially pathogenic host responses to enteric bacteria. C. rodentium induced colitis is one such rare model that allows for the analysis of host responses to enteric bacteria, furthering our understanding of potential mechanisms of IBD pathogenesis; essential in the development of novel preventative and therapeutic treatments.

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Citrobacter rodentium infection provides a valuable model to study enteric bacterial infections as well as host immune responses and colitis in mice. This protocol outlines the measurement of barrier integrity, pathogen load and histological damage allowing for the thorough characterization of pathogen and host contributions to murine infectious colitis.

La<em&gt; Citrobacter rodentium</emModèle de souris&gt;: Étudier Contributions des agents pathogènes et l&#39;hôte de la colite infectieuse

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Chronique à long terme<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infection des voies respiratoires chez les souris

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Génération et multi-phénotypique criblage à haut contenu de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Mutants de transposon

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Cultures placentaire et déciduale organe humain pour l&#39;étude des infections à l&#39;interface materno-fœtale

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to the frequent failure of traditional antibiotic treatments. Alternative therapeutics are urgently needed to tackle MDR bacteria.
An innovative non-antibiotic approach, antimicrobial blue light (aBL), has shown promising effectiveness against MDR infections. The mechanism of action of aBL is not yet well understood. It is commonly hypothesized that naturally occurring endogenous photosensitizing chromophores in bacteria (e.g., iron-free porphyrins, flavins, etc.) are excited by aBL, which in turn produces cytotoxic reactive oxygen species (ROS) through a photochemical process.
Unlike another light-based antimicrobial approach, antimicrobial photodynamic therapy (aPDT), aBL therapy does not require the involvement of an exogenous photosensitizer. All it needs to take effect is the irradiation of blue light; therefore, it is simple and inexpensive. The aBL receptors are the endogenous cellular photosensitizers in bacteria, rather than the DNA. Thus, aBL is believed to be much less genotoxic to host cells than ultraviolet-C (UVC) irradiation, which directly causes DNA damage in host cells.
In this paper, we present a protocol to assess the effectiveness of aBL therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in a mouse model of burn injury. By using an engineered bioluminescent strain, we were able to noninvasively monitor the extent of infection in real time in living animals. This technique is also an effective tool for monitoring the spatial distribution of infections in animals.

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacterial strains have emerged as a serious threat to public health, necessitating the development of alternative therapeutics. We present a protocol to evaluate the effectiveness of antimicrobial blue light (aBL) therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in mouse burns by using bioluminescence imaging.

In vivo Investigation of Antimicrobial Therapy Blue Light pour multirésistante Acinetobacter baumannii Gravez Infections En utilisant l&#39; imagerie par bioluminescence

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

Imagerie de Mycobacterium tuberculosis chez la souris avec la journaliste Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ cytosolic concentrations, linked to release from internal stores or an influx through plasma membrane channels, regulate cortical cell processes. Pathogens that adhere to or invade host cells trigger a reorganization of the actin cytoskeleton underlying the host plasma membrane, which likely affects both global and local Ca2+ signaling. Because these events may occur at low frequencies in a pseudo-stochastic manner over extended kinetics, the analysis of Ca2+ signals induced by pathogens raises major technical challenges that need to be addressed.
Here, we report protocols for the detection of global and local Ca2+ signals upon a Shigella infection of epithelial cells. In these protocols, artefacts linked to a prolonged exposure and photodamage associated with the excitation of Ca2+ fluorescent probes are troubleshot by stringently controlling the acquisition parameters over defined time periods during a Shigella invasion. Procedures are implemented to rigorously analyze the amplitude and frequency of global cytosolic Ca2+ signals during extended infection kinetics using the chemical probe Fluo-4.

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Here, we present protocols to visualize calcium (Ca2+) responses elicited by HeLa cells infected by Shigella. By optimizing the parameters of bacterial infection and imaging with Ca2+ fluorescent probes, atypical global and local Ca2+ signals induced by bacteria over a large range of infection kinetics are characterized.

Imagerie de Ca2 + réponses au cours de l’Infection des cellules épithéliales de Shigella

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

Imagerie confocale d’ARN bicaténaire et récepteurs de reconnaissance de modèle dans l’infection par le Virus ARN de polarité négative

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Un haut débit de Shigella-test bactéricide spécifique

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...