Damos las gracias a Gillian Stanfield los comentarios sobre el manuscrito. TAJ con el apoyo de la Universidad de Utah Genética Formación subvención T32-GM007464 del NIH NIGMS.

1. Generación Mosaico <ol><li> Cruz genética w FRT 19A bañera: GAL80 FLP 122 / Y; BTL-GAL4, UAS-GFP (machos) * X FRT 19A / Bal (hembras), donde * representa el mutante a ser examinado. Nota: Configure cruzar por lo menos un día antes de experimentar, ya que esto permite a los animales se aparean correctamente. </li><li> Pre-lay: Centro de transferencia de viales volar de comida con una pequeña mancha de pasta de levadura fresca colocada en los medios de comunicación. Permitir a sentar durante 1 hora a 25 ° C. </li><li> Lay: Transferencia de animales de vial pre-sentar a un vial fresco con una pequeña mancha de pasta de levadura fresca. Permitir a sentar durante 6 horas a 25 ° C. </li><li> Transferencia de adultos de vuelta a vial pre-sentar para su almacenamiento y su uso en experimentos posteriores. Inmediatamente choque de calor el vial laico que contiene 0-6 hr embriones durante 45 min a 38 ° C, en un baño de agua circulante. Nota: La superficie de los alimentos debe estar por debajo del nivel del agua para verificar toda laembriones están debidamente choque térmico. </li><li> Incubar viales calor conmocionado a 25 ° C durante 4-5 días hasta que las larvas comienzan a divagar. </li></ol> 2. Pantalla de mosaico Animales <ol><li> Usando unas pinzas finas recoger suavemente errante larvas de tercer estadio de los lados del vial y colocarlos en refrigerada glicerol 100% en una pequeña placa de plástico. </li><li> Examine larvas utilizando un microscopio de disección alta magnificación-equipada con óptica fluorescentes. Identificar las larvas con la expresión mosaico de células traqueales marcados con fluorescencia. Típicamente, esto se puede hacer en 10-20X. </li></ol> 3. Fijación de calor <ol><li> Con unas pinzas finas recoger cuidadosamente animales mosaico del plato y coloque en una gota de agua dulce 100% de glicerol en mm blanco vidrio portaobjetos de 75x25x1. Nota: múltiples animales pueden ser colocados en la gota (Figura 1A). Los animales también se pueden colocar en una gota de glicerol directamente sobre un cubreobjetos,pero se debe tener cuidado durante la fijación (paso 3.2), ya que los animales se calientan muy rápidamente y pueden llegar a ser sobre-fija. </li><li> Colocar el portaobjetos de vidrio a 70 ° C del bloque de calor hasta que los animales sólo dejan de moverse, no más de 20 segundos para una diapositiva, y 10 seg para una hoja de cubierta (Figura 1B). Los animales se retuercen al principio, pero detenerse y volverse rígida y alargada, una vez muerto. Nota: La exposición demasiado larga al calor puede dañar ramas terminales y lúmenes, así como hacer la señal de GFP tenue y difusa. Para una eficacia óptima, se recomienda tener el bloque de calor en la habitación con los microscopios. </li><li> Usando unas pinzas finas orientar cuidadosamente todas las larvas del menú en una sola dirección, de tal manera que todas las larvas en la diapositiva son orientadas en paralelo el uno al otro (Figura 1C). </li><li> Coloque con cuidado la cubierta de vidrio micro 18x18mm en la parte superior de las larvas (o invertir el cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio) y evitar la formación de burbujas (Figura 1D). Nota: cubreobjetos no puede estar exactamenteplana sobre larvas, esto no es un problema. </li><li> Larvas de imagen dentro de 30 min. Células terminales fijos de calor se degradarán y la señal de GFP se convertirán en muy difusa. </li></ol> 4. Imágenes in vivo de las células traqueales de terminales <ol><li> Coloque la diapositiva en el escenario de un microscopio estereoscópico compuesto. El uso de un objetivo de 5X localizar los dos troncos de dorsales paralelas que van de anterior a posterior en la superficie dorsal del animal (Figura 1F). Localice las dos células terminales dorsal, directamente entre los dos troncos de dorsales. Esto ayuda a identificar el segmento apropiado para el análisis. </li><li> Una vez orientado, rotar a los animales para agrandar las células terminales deseados. Para hacer esto, empuje con cuidado el cubreobjetos en el borde con las pinzas perpendiculares al eje largo de las larvas, rodando lentamente las larvas debajo del cubreobjetos (Figuras 1E y 1G). </li><li> Selección de las células terminales apropiados es fundamental para obtener resultados consistentesy las comparaciones entre los mutantes. Células terminales La rama de grasa corporal (PC) se encuentran fácilmente al lado del tronco dorsal, lateral a la línea media. Las células terminales del grupo G laterales (LG) son fáciles de encontrar y están situadas justo lateral de la línea media ventral (Figura 1H). Nota: en los segmentos más anteriores (Tr1) y posterior (Tr10) la disposición de la célula terminal es divergente de otros segmentos. Nosotros sólo analizamos las células terminales en los segmentos Tr2-TR9. Células terminales dorsales tienen un patrón de ramificación más estereotipado que otras células traqueales de terminales. Esto puede depender de las señales autónomas adicionales, no celulares, y esto debe ser considerado al momento de decidir si se debe incluir en el análisis. </li><li> Una vez que una célula terminal del interés ha sido identificado, la captura de una imagen con el tamaño deseado, normalmente 10X o 20X es mejor (Figura 2A). Nota: debido a los patrones de ramificación variables, tratar de capturar imágenes que incluyan tantas ramas y puntas de las ramas como sea posible. </li><li> Sin mover el escenario, apagar la fluorescencia y encienda la luz transmitida para capturar una imagen de campo claro de la misma célula y el plano focal (Figura 2B). El lumen se puede visualizar como contrasta en color oscuro en el espacio celular terminal. Si planeas cuantificar ramas terminales celulares y lúmenes, recoge varias imágenes en múltiples planos focales de cada célula terminal. </li></ol> 5. Análisis y cuantificación de Morfología Celular Terminal Utilizando ImageJ <ol><li> Abra las imágenes fluorescentes y campo claro mediante el ImageJ ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ) plug-in NeuronJ ( <a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/" target="_blank">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</a> ). </li><li> Utilizando el &quot;Add trazados&quot; herramienta rastrear manualmente las ramas y el lumen de la célula entera terminal. </li><li> Con la herramienta &quot;trazados Label&quot;, cambiar el nombre y la reColor asignar cada línea de la traza de una denominación específica. </li><li> Con la herramienta &quot;parámetros de Set&quot;, ajustar el ancho de línea 6-10 512x512 píxeles (para imágenes obtenidas por la cámara digital conectada al microscopio compuesto. Para cámaras de mayor resolución o menor, el ancho de píxel debe escalarse apropiadamente), utilizando todos los otros valores predeterminados y seleccione &quot;OK&quot;. A continuación, utilice la función &quot;Hacer foto&quot; para tomar una imagen. Seleccione la opción &quot;Dibujar trace&quot; para obtener una instantánea de la traza que se puede mostrar de lado a lado con el original. </li><li> Seleccione la herramienta &quot;Medir trazados&quot; y seleccionar el tipo de trazado (es decir, que se ramifica a medida basada en las denominaciones específicas asignadas en el paso 5.3). A continuación, seleccione &quot;Mostrar las mediciones de rastreo&quot; y &quot;Borrar las mediciones anteriores&quot; y luego haga clic en &quot;Ejecutar&quot;. Esto producirá una hoja de cálculo que contiene el nombre, la etiqueta, la longitud (en píxeles), y otros datos para la imagen. Estos datos se pueden guardar como una hoja de cálculo Microsoft Excel para su posterior estadísticaanálisis. </li></ol>

<ol>
	<li>Manning, G., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+Tracheal+System.">Development of the Drosophila Tracheal System.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).</li><li>Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+regulation+of+airway+branching+in+Drosophila+is+mediated+by+branchless+FGF.">Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF.</a> Cell. 99 (2), 211-220 (1999).</li><li>Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+interactions+among+epithelial+cells+during+tracheal+branching+morphogenesis.">Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis.</a> Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).</li><li>Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Zpr1+(Zinc+Finger+Protein+1)+Is+Required+Downstream+of+Both+EGFR+And+FGFR+Signaling+in+Tracheal+Subcellular+Lumen+Formation.">Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation.</a> PLoS ONE. 7 (9), e45649 (2012).</li><li>Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+screen+for+tube+morphogenesis+and+branching+genes+in+the+Drosophila+tracheal+system.">A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system.</a> PLoS Genetics. 7 (7), e1002087 (2011).</li><li>Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonal+genetic+screen+for+mutants+causing+defects+in+larval+tracheal+morphogenesis+in+Drosophila.">A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila.</a> Genetics. 176 (4), 2279-2291 (2007).</li><li>Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whacked+and+Rab35+polarize+dynein-motor-complex-dependent+seamless+tube+growth.">Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth.</a> Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).</li><li>Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+talin+and+integrin+genes+are+required+for+maintenance+of+tracheal+terminal+branches+and+luminal+organization.">Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization.</a> Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).</li><li>Jones, T. A., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+for+the+PAR+complex+in+subcellular+morphogenesis+of+tracheal+terminal+cells+in+Drosophila+melanogaster.">A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 189 (1), 153-164 (2011).</li><li>Gervais, L., Casanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+coupling+of+cell+elongation+and+lumen+formation+in+a+single+cell.">In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell.</a> Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nuclear+GFP/&#223;-galactosidase+fusion+protein+as+a+marker+for+morphogenesis+in+living+Drosophila.">A nuclear GFP/&#223;-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila.</a> Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).</li><li>Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -. C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images.">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li><li>Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+autonomy+of+HIF+effects+in+Drosophila:+tracheal+cells+sense+hypoxia+and+induce+terminal+branch+sprouting.">Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting.</a> Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen ningún interés financiero en competencia.

La técnica de fijación por calor descrito aquí es una herramienta rápida y conveniente para las larvas células terminales traqueales imágenes Drosophila. Aquí, nosotros usamos esta técnica para examinar la ramificación y el patrón de luz de las células de tipo salvaje. Células traqueales que expresan GFP, dirigido por el promotor específico traqueal sin aliento, se pueden visualizar fácilmente a través de la cutícula larval después de la fijación de calor. Los patrones de ramificació...

La forma celular es crítica para la función de las células individuales dentro de un organismo, así como las células que funcionan como parte de un tejido u órgano. Utilizamos Drosophila células terminales traqueales, un componente del sistema respiratorio del insecto, para investigar los mecanismos moleculares que participan en el control de dos tipos conservadas de morfología celular: Bifurcaciones y formación del tubo (lumenogenesis). Células de terminales se encuentran en la punta de una red de tubos ramificados que funciona para suministrar oxígeno a los tejidos internos 1 y tienen una morfología ramificada elaborado que depende de una vía de señalización de FGF que es controlada por los niveles de oxígeno locales dentro de los tejidos de destino 2. Ramas de células de terminales son tubos delgados, con un llenas de gas lumen subcelulares se ejecutan a través de cada rama. Las arquitecturas celulares distintos de las células terminales, junto con la facilidad con la que el análisis genético puede llevarse a cabo en Drosophila, hacen que estas células un modelo excelente fo la investigación de los mecanismos de derivación celular, ramificación y formación del tubo intracelular. Células de terminales han demostrado ser un modelo útil para entender algunas de las vías de señalización que conducen a la diferenciación celular ramificado, carnosidad, y la maduración 2-4. El uso de este sistema imparcial, se han realizado las pantallas adelante genéticos para la morfogénesis de células mutantes, dando ideas sobre los mecanismos que controlan la forma celular 5,6. Por ejemplo, estas pantallas han puesto de manifiesto que es necesario un RabGAP específica para la polaridad del citoesqueleto y el tráfico de vesículas en la formación del lumen y de posicionamiento 7; que se requiere la adhesión mediada por la integrina para la estabilidad rama 8, y que las proteínas PAR-polaridad epiteliales regular el tráfico de membrana polarizada requerido tanto para la ramificación y la formación del lumen 9. Otros estudios realizados en células de terminales han demostrado que se requiere la acumulación de actina asimétrica y organización de los microtúbulos para la elongación celular y lumenogenesis <shasta&gt; 10. Por lo tanto, diversos mecanismos biológicos celulares conservadas, contribuyen a la morfogénesis celular terminal. A continuación, se describe un método para solucionar rápidamente intacta tercer estadio las larvas de Drosophila para el análisis de células ramificación terminal y la formación del lumen. Este protocolo también puede llevarse a cabo tanto en primero y segundo instar animales. La clave de esta técnica es la posibilidad de visualizar las células terminales que están etiquetados genéticamente mediante la expresión de la proteína fluorescente directamente a través de la cutícula larval de los animales intactos. Dado que este procedimiento no requiere ninguna manipulación posteriores a la fijación, tales como la tinción de anticuerpos, para observar las células, que es muy adecuado para análisis de alto rendimiento, incluyendo la investigación genética o drogas. Expresión de la proteína fluorescente revela la estructura de las ramas citoplásmicamente llenas. La formación de tubos se puede controlar en paralelo usando microscopía de campo claro para identificar el lumen lleno de gas, lo que contrasta con el entorno de fluido llenetejidos ed. Incluido en este protocolo es el método para la generación de mosaicos genéticos basados ​​en el sistema MARCM 11, para producir células mutantes homocigotos terminales marcadas con proteínas fluorescentes en animales no marcados de otro modo. Esto es necesario, ya que las células terminales sólo elaboran sus estructuras complejas relativamente tarde en el desarrollo; mosaicos genéticos permiten la derivación de los requisitos de genes en anteriores en el desarrollo de otros tejidos. . Para generar clones MARCM, la tráquea se etiquetan con el controlador específico de respiración traqueal (BTL) 12 describe aquí es el protocolo para el cromosoma X de Drosophila; para otros cromosomas, un procedimiento similar se puede utilizar, con reactivos genéticos apropiados para el cromosoma ser examinado. Aquí, la tráquea se etiquetan mediante la expresión de una GFP citoplasmática localizada, pero el procedimiento funciona igualmente bien con la expresión de otras proteínas fluorescentes, tales como DsRed. Además, hemos incluido un método para cuantificar los patrones de ramificación y la formación del lumen de las células terminales, con base en los métodos desarrollados para caracterizar los patrones de ramificación neuronal 13. Este tipo de datos cuantitativos puede ser crítico para discernir el papel preciso de los genes en el proceso de ramificación o lumenogenesis, así como para permitir comparaciones directas entre los diferentes mutantes 9.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioImager M1 compound microscope (or equivalent)</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Glycerol</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>M152-4L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stock</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stock</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Genotype: y w FRT19A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examination of drosophila larval tracheal terminal cells by light microscopy

La forma celular es crítica para la función celular. Sin embargo, a pesar de la importancia de la morfología de las células, se sabe poco sobre cómo las células individuales generan formas específicas. Células terminales traqueal de Drosophila se han convertido en un modelo genético de gran alcance para identificar y aclarar el papel de los genes necesarios para la generación de morfologías celulares. Células de terminales son un componente de una red tubular ramificada, el sistema traqueal que funciona para suministrar oxígeno a los tejidos internos. Células de terminales son un excelente modelo para la investigación de las cuestiones de forma de la célula, ya que poseen dos arquitecturas celulares distintos. En primer lugar, las células terminales tienen una morfología ramificada elaborada, similar a las neuronas complejas; segundo, ramas de células terminales se forman como tubos delgados y contienen un lumen intracelular unida a la membrana. El análisis cuantitativo del número de rama terminal de las células, la organización y la forma de rama rama individual, se puede utilizar para proporcionar información sobre el papel de los mecanismos genética específicamos en la fabricación de una célula ramificada. Análisis de la formación del tubo en estas células puede revelar los mecanismos conservadas de tubulogénesis comunes a otras redes tubulares, tales como la vasculatura del vertebrado. Aquí se describen las técnicas que se pueden utilizar para fijar rápidamente, imagen, y analizamos los dos patrones de ramificación y la formación del tubo en las células terminales dentro de las larvas de Drosophila. Estas técnicas se pueden utilizar para analizar las células terminales en los animales de tipo salvaje y mutante, o mosaicos genéticos. Debido a la alta eficiencia de este protocolo, también es muy adecuado para el genético, basado en RNAi, o pruebas de drogas en el sistema traqueal de Drosophila.

Los resultados se muestran en la Figura 2. Un grupo lateral única (LG) celular terminal muestra extensa ramificación subcelular (visualizado por las buenas prácticas agrarias, A) y un gas llenos de luz subcelulares que atraviesan cada una de las ramas (visualizaron por microscopía de campo claro, B). Estas imágenes se obtuvieron de un mosaico L3 larva, generado usando el sistema de MARCM descrito en las secciones 1 y 2, y el calor y la imagen fija, tal como se describe en las secciones 3 y 4. Los p...

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Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

A continuación, presentamos un método para el análisis de microscopía de luz de las células traqueales de terminales<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas. Este método permite el examen rápido de la rama y la morfología del lumen en los animales enteros y sería útil para el análisis de mutantes o pantallas para las mutaciones que afectan el desarrollo de células de terminales individuales.

El examen de<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas células traqueales de terminales por microscopía de luz

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

examination-drosophila-larval-tracheal-terminal-cells-light

Research

JoVE Journal

Biology

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

10.2K vistas.  University of Utah. A continuación, presentamos un método para el análisis de microscopía de luz de las células traqueales de terminales Drosophila Larvas. Este método permite el examen rápido de la rama y la morfología del lumen en los animales enteros y sería útil para el análisis de mutantes o pantallas para las mutaciones que afectan el desarrollo de células de terminales individuales.

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Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

La disección del sistema nervioso central de larvas de Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Investigación

Biología

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Drosophila larval NMJ Disección

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

Drosophila larval NMJ inmunohistoquímica

Presynaptically Silent Synapses Studied with Light Microscopy

Synaptic plasticity likely underlies the nervous system's ability to learn and remember and may also represent an adaptability that prevents otherwise damaging insults from becoming neurotoxic.  We have been studying a form of presynaptic plasticity that is interesting in part because it is expressed as a digital switching on and off of a presynaptic terminal s ability to release vesicles containing the neurotransmitter glutamate.  Here we demonstrate a protocol for visualizing the activity status of presynaptic terminals in dissociated cell cultures prepared from the rodent hippocampus.  The method relies on detecting active synapses using staining with a fixable form of the styryl dye FM1-43, commonly used to label synaptic vesicles.  This staining profile is compared with immunostaining of the same terminals with an antibody directed against the vesicular glutamate transporter 1 (vGluT-1), a stain designed to label all glutamate synapses regardless of activation status.   We find that depolarizing stimuli induce presynaptic silencing.  The population of synapses that is silent under baseline conditions can be activated by prolonged electrical silencing or by activation of cAMP signaling pathways.

Glutamatergic synapses can switch from an active mode to a silent mode. We demonstrate that presynaptic activity status in dissociated culture of rodent neurons is visualized using a fixable form of the FM1-43 dye to visualize active synapses and immunostaining with vGluT-1 antibody to visualize all glutamate synapses.

Las sinapsis silenciosa presináptico estudiado con microscopía de luz

Synaptic plasticity likely underlies the nervous system's ability to learn and remember and may also represent an adaptability that prevents otherwise ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

Preparación de Drosophila Células S2 para microscopía de luz

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

La disección y la tinción de Drosophila Larvas Ovarios

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

La medición de las larvas La actividad en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Monitor de Actividad

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Examen de la dinámica nuclear de levadura de ficción mitotica y meiótica por microscopía de células vivas de fluorescencia

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...