Agradecemos al Dr. Toshio Terashima de la Universidad de Kobe, Japón, para la enseñanza de la técnica de la cirugía laríngea, y el Dr. Lynn Enquist de la Universidad de Princeton para el suministro de PRV-Bartha. La investigación fue apoyada por Pioneer Award NIH DP1 OD000448 a Erich D. Jarvis y un premio NSF Graduate Research Fellowship a Gustavo Arriaga. Las cifras del anterior trabajo debidamente acreditado se utilizan bajo la PLoS ONE acceso abierto licencias Creative Commons (CC-BY), de conformidad con las políticas editoriales de la revista.

NOTA: Todos los procedimientos con animales han sido revisados ​​y aprobados por el Comité Institucional Animal Care &amp; Use la Universidad de Duke. 1. Almacenamiento Pseudorrabia Virus <ol><li> Obtenemos virus vivo (PRV152) desde el laboratorio del Dr. Lynn Enquist en la Universidad de Princeton en un título de 1 x 10 9 pfu / m. El protocolo para generar el virus ha sido publicada 2. </li><li> Alícuota el virus en 20 l por tubo dentro de un gabinete de bioseguridad BSL-2 y se almacena a -80 ° C bajo condiciones de bioseguridad apropiadas. </li><li> Descongelar una alícuota del PRV inmediatamente antes de la inyección. </li></ol> 2. Preparación quirúrgica para inyección en el músculo <ol><li> Inducir la anestesia general mediante inyección intramuscular de ketamina-xilazina (100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina) y mantener un plano anestésico apropiado utilizando isofluorano. </li><li> Proteja las córneas con una pomada oftálmica. </li><li> Preparar tél sitio quirúrgico de acuerdo con una técnica aséptica por el recorte de pelo y la desinfección de la zona quirúrgica con alternancia de matorrales de Betadine y alcohol al 70% (mínimo de 3 ciclos). Asegúrese de utilizar paños estériles para cubrir las áreas quirúrgicas. Asegúrese de que se adhieran a las técnicas estériles durante todo el procedimiento. </li><li> Hacer una incisión en la piel y revelar el músculo de su interés. Por ejemplo, para acceder al músculo de laringe cricotiroidea es necesario quitar primero la porción suprayacente del músculo esternohioideo. </li><li> Selle cualquier músculos seccionados con Vetbond adhesivo tisular. </li></ol> 3. La inyección de PRV en el músculo <ol><li> Cargar el sistema de 10 l microjeringa nanofil con solución PRV recién descongelado, adjunte una aguja de acero inoxidable 34 G, y cuidadosamente montarlo en el dispositivo estereotáxico. </li><li> Lentamente despejar el espacio muerto y verificar que la solución sale de la punta microjeringa. Deseche el fluido como residuos bioharzard. </li><li> El uso de un microP estereotáxicodispositivo ositioning coloque cuidadosamente la punta microjeringa en el músculo de interés y llenar lentamente el músculo hasta hinchazón leve es visible. La velocidad de inyección variará dependiendo del tamaño del músculo y el volumen a inyectar. Por ejemplo, cinco inyecciones de 200 nl (1 l total) a una velocidad de 4 nl / seg deben hacerse 1 min aparte en el mismo sitio para llenar el músculo cricotiroideo. Mover la jeringa a la siguiente músculo de interés (la cricoaritenoideo lateral en este caso) y repetir el procedimiento de inyección. Sólo perforar cada músculo una vez. </li><li> Retraer la microjeringa después de cinco minutos. </li><li> Selle la rotura en la fascia usando Vetbond adhesivo tisular. </li><li> Después de todas las inyecciones se han completado, cierre la herida utilizando Vetbond adhesivo tisular. Dependiendo de sus directrices locales institional uso de animales, suturas o grapas de la herida puede ser utilizado. </li><li> Supervisar el animal hasta decúbito esternal y proporcionar analgesia, la comida, el agua y los cuidados requeridos por ynuestras pautas de uso de los animales institucionales. </li><li> Después de que el tiempo de supervivencia determinada experimentalmente (en este caso, 90 hr para etiquetar 2 nd orden neuronas corticales), sacrifica el animal por sobredosis de pentobarbital y perfundir transcardially con 0,9% de solución salina seguido por 4% de formaldehído 0,1 M en PBS. </li><li> Retire y posterior a solucionar el cerebro en formaldehído al 4% durante 24 horas. </li><li> Cryoprotect el cerebro en tampón fosfato que contiene 30% de sacarosa durante al menos 48 h. </li></ol> 4. Detección inmunoquímica de eGFP <ol><li> Cortar secciones a 40 micras en un micrótomo de deslizamiento y guardar secciones flotantes en 0,1 M PBS. Secciones más delgadas, por ejemplo 30 m, se pueden usar cuando la tinción de secciones montadas. </li><li> Saciar secciones durante 30 minutos en 0,3% de H 2 O 2 en PBS protegidas de la luz. </li><li> Bloquear antígenos no específicos en las secciones durante 30 min en PBS que contenía 0,3% de Tween 20 con suero de cabra normal desde el Kit VECTASTAIN Elite (VE kit). </li><li&gt; Incubar bloqueado secciones de 3,5 horas en conejo anti-eGFP (1: 1000) a TA. </li><li> Lavar las secciones tres veces en PBS durante 5 min, luego incubarlos durante 1 h en cabra anti-conejo anticuerpo secundario del kit VE a TA. </li><li> Preparar la solución de ABC de la VE kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Lavar las secciones tres veces en PBS durante 5 min, luego reaccionar durante 1 hora en una solución de ABC de la VE kit a TA. </li><li> Lavar las secciones tres veces en tampón de fosfato durante 10 min, y desarrollar durante 8 min en tampón de fosfato, pH 7,4, que contiene 0,05% DAB (3, 3&#39;-diaminobencidina) y 0,015% de H 2 O 2. </li><li> Mount secciones sobre portaobjetos SuperFrost Plus y deshidratar a través de una serie graduada de alcohol (70%, 95%, 100% y 100% durante 5 minutos cada uno). </li><li> Desactive las secciones a través de dos lavados de xileno (5 min cada uno) y el cubreobjetos los portaobjetos con medio de montaje Permount. </li><li> Imagen de las secciones montadas en un microscopio. El producto de reacción DAB inside las células deben aparecer marrón. Las imágenes digitalizadas pueden ser de color invertido para poner de relieve los procesos finos. </li></ol> 5. Preparación quirúrgica para inyección de trazadores en regiones del cerebro descubiertas por PRV Tracing <ol><li> Inducir la anestesia general mediante inyección intramuscular de ketamina-xilazina (100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina) y mantener un plano anestésico apropiado utilizando isofluorano. </li><li> Proteja las córneas con una pomada oftálmica. </li><li> Fijar la cabeza en un marco estereotáxico apropiado. </li><li> Preparar el sitio quirúrgico de acuerdo con una técnica aséptica por el recorte de pelo y desinfectar el sitio con alternancia de matorrales de Betadine y alcohol al 70% (mínimo de 3 ciclos). </li><li> Haga una incisión del cuero cabelludo y retraer la piel sobre la región del cerebro de interés. </li><li> Realizar una pequeña craneotomía en las coordenadas estereotáxicas apropiados. Por ejemplo, las coordenadas de la corteza motor conectado laryngeally identificado por el rastreo en un PRVn ratón adulto son 1,2 mm lateral y de 0,2 mm rostral a Bregma. </li></ol> 6. La inyección de dextrano biotinilados aminas en el cerebro <ol><li> Preparar 7,5% Aminas dextrano biotina (BDA) por disolución de 25 mg de BDA (10.000 MW) en 333 l de solución salina estéril. </li><li> Cargue el sistema de micropipeta Nanoject II con suficiente solución BDA para las inyecciones previstas. </li><li> Lentamente despejar el espacio muerto y verificar que la solución está saliendo de la punta de la micropipeta. </li><li> El uso de un dispositivo de microposicionamiento estereotáxica bajar con cuidado la punta de la micropipeta en la región del cerebro de interés y lentamente inyecte BDA. Ajustar la velocidad de inyección en función del tamaño de la región a ser etiquetado. Por ejemplo, 12 inyecciones de 4,6 nl deben ser hechas en cuatro lugares diferentes de 0,2 mm de distancia (dirección rostro-caudal) para cubrir el córtex motor conectado laryngeally en ratones adultos. El volumen de inyección final debe ser ajustado de acuerdo con el tamaño de la región del cerebro de interés, Teniendo en cuenta que la etiqueta puede extenderse desde el núcleo de inyección por difusión a través tejido cerebral y a lo largo de los procesos de neuronas marcadas. </li><li> Selle la craneotomía con cemento dental, y cerrar la herida del cuero cabelludo utilizando Vetbond adhesivo tisular. </li><li> Supervisar el animal hasta decúbito esternal y proporcionar analgesia, la comida, el agua y los cuidados requeridos por sus directrices institucionales de uso animal. </li></ol> 7. La inyección de la toxina del cólera subunidad b en el músculo <ol><li> Preparar 1% cólera subunidad B de la toxina (CTB) disolviendo 1 mg de CTb en 100 l de solución salina estéril. </li><li> Seis días después de la inyección de BDA en el cerebro, realizar la preparación quirúrgica como se describió anteriormente para las inyecciones de PRV en el músculo. </li><li> Cargar el sistema de 10 l microjeringa nanofil con solución CTB, adjuntar una aguja de acero inoxidable 34 G, y cuidadosamente montarlo en el dispositivo estereotáxico. </li><li> Realizar las microinyecciones en el músculo (s) de interés como anteriormente desdescrito por PRV. </li><li> Supervisar el animal hasta decúbito esternal y proporcionar analgesia, la comida, el agua y los cuidados requeridos por sus directrices institucionales de uso animal. </li><li> Tres días después de la inyección CTB, sacrificar al animal por sobredosis de pentobarbital y perfundir transcardially con 0,9% de solución salina seguido por 4% de formaldehído 0,1 M en PBS. </li><li> Retire y posterior a solucionar el cerebro en formaldehído al 4% durante 24 horas. </li><li> Cryoprotect el cerebro en tampón fosfato que contiene 30% de sacarosa durante al menos 48 h. </li></ol> 8. Detección de BDA y CTb en las mismas secciones <ol><li> Cortar secciones a 40 micras en un micrótomo y guardar secciones flotantes en 0,1 M PBS. </li><li> Saciar secciones durante 30 minutos en 0,3% de H 2 O 2 en PBS protegidas de la luz. </li><li> Preparar la solución de ABC de la VE kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Lavar las secciones tres veces en PBS durante 5 min, luego reaccionar durante 1 hora en una solución de ABC a TA. </li&gt; <li> Lavar las secciones tres veces en tampón de fosfato durante 10 min, y desarrollar durante 8 min en tampón de fosfato, pH 7,4, que contiene 0,05% DAB (3, 3&#39;-diaminobencidina), 0,015% de H 2 O 2, y 0,05% de cloruro de níquel. El producto de reacción DAB dentro de las células debería aparecer negro. </li><li> Secciones de bloque de 30 min en PBS que contenía 0,3% de Tween 20 con suero de conejo normal desde el Kit VECTASTAIN Elite. </li><li> Incubar bloqueado secciones durante 2 horas en cabra anti-CTB (1: 10.000) a TA. </li><li> Lavar las secciones tres veces en PBS durante 5 min, luego incubarlos durante 1 h en conejo anti-cabra de anticuerpo secundario de la VE kit a TA. </li><li> Preparar la solución de ABC de la VE kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Lavar las secciones tres veces en PBS durante 5 min, luego reaccionar durante 30 min en una solución de ABC a TA. </li><li> Lavar las secciones tres veces en tampón de fosfato durante 10 min, y desarrollar para un máximo de 8 min en tampón de fosfato, pH 7,4, que contiene 0,05% DAB (3, 3&#39;diaminobenzidine) y 0,015% de H 2 O 2. El producto de reacción DAB dentro de las células debería aparecer marrón. </li><li> Mount secciones sobre portaobjetos SuperFrost Plus y deshidratar a través de una serie graduada de alcohol (70%, 95%, 100% y 100% durante 5 minutos cada uno). </li><li> Desactive las secciones a través de dos lavados de xileno (5 min cada uno) y el cubreobjetos los portaobjetos con medio de montaje Permount. </li><li> Imagen de las secciones montadas en un microscopio. </li></ol>

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No conflicts of interest declared.

Hay una serie de cuestiones que deben tenerse en cuenta al planificar un experimento utilizando PRV152 4,21. Lo más importante, virus de la pseudorrabia es letal. Como se mencionó anteriormente, los grandes simios, incluidos los seres humanos no son susceptibles a la infección, pero la atención adecuada deben ejercerse para proteger a otros animales. Los ratones adultos normalmente sobreviven cinco a siete días después de la inoculación con la cepa atenuada PRV152. Por lo tanto, PRV152 no es apropiado ...

Trazado transináptico se ha convertido en una poderosa herramienta utilizada para analizar eferentes centrales que regulan los objetivos periféricos a través de los circuitos multi-sinápticas. Este enfoque se ha utilizado más ampliamente en el cerebro de roedores utilizando el virus de la pseudorrabia patógenos porcina (PRV), especialmente la cepa atenuada PRV-Bartha describió por primera vez en 1961 12. A continuación, presentamos un protocolo para la identificación de la representación cortical motora de los músculos específicos o grupos musculares utilizando una cepa del virus de la pseudorrabia recombinantes (PRV152) que expresa el aumento de proteína verde fluorescente (EGFP) gen informador 2. El método descrito explota el comportamiento de los virus neurotróficos, que producen progenie infecciosa que las sinapsis transversales para infectar otras neuronas dentro de un circuito funcional 3,4,13. PRV152, que es isogénica con PRV-Bartha, solamente cruza la sinapsis retrógrada a través de la secuencia jerárquica de las conexiones sinápticas de distancia del sitio de la infección 3,5 &lt;/ sup&gt;. Al controlar con precisión el sitio periférico de la infección es posible limitar la entrada del virus en el cerebro a través de un subconjunto específico de las neuronas motoras. A medida que el virus infecta secuencialmente cadenas de neuronas conectadas, el patrón resultante de la señal de eGFP en todo el cerebro entonces resolver la red de neuronas que están conectados a las células infectadas inicialmente. Una ventaja adicional del uso de virus para el rastreo neural es la amplificación de la proteína indicadora (eGFP en este caso) dentro de las células infectadas. Esta amplificación de la señal proporciona un nivel de sensibilidad que permite la detección de proyecciones incluso dispersos. Por ejemplo, una proyección de escasa corteza motora Vibrisas a las neuronas motoras faciales que controlan los bigotes se encontró en ratas utilizando la proteína fluorescente verde de forma viral expresado 14; estudios previos no lograron encontrar esta proyección utilizando trazadores clásicos sin amplificación del gen reportero 11,15. Desafortunadamente, Muchos vectores virales de rastreo, como el usado en el estudio citado, no se cruzan las sinapsis, lo que limita su uso para el rastreo de circuitos multi-sinápticas. Al presentar distintas ventajas para la identificación de la red de las células que participan en un circuito del motor, la naturaleza distribuida de transináptico rastreo con PRV-152 hace que la interpretación de conexiones específicas dentro del circuito difícil. Por lo tanto, se presenta un método simple para la validación de las conexiones específicas dentro de los circuitos identificados con PRV-152 haciendo doble etiquetado utilizando aminas biotina dextrano (BDA) y la subunidad toxina del cólera b (CTB). El uso combinado de BDA y CTb es un enfoque bien establecido para el rastreo de conexiones entre conjuntos específicos de neuronas 6-8,11. Cuando se usan juntos, estos dos marcadores se pueden visualizar en la misma sección usando un DAB de dos colores (3, 3 &#39;-Diaminobencidina) Procedimiento 16. De alto peso molecular BDA (BDA10kDa) fue seleccionado para este protocolo, ya que yields etiquetado detallado de los procesos neuronales 6,7,9. Las ventajas adicionales de BDA10kDa incluyen los siguientes: se transporta preferentemente en la dirección anterógrada 6-8; puede ser entregado por iontoforesis o la inyección de presión 6-8; se puede visualizar con un simple HRP avidina-biotina (ABC) procedimiento 17; y puede ser fotografiado por la luz o microscopía electrónica 6,7,18. Detección inmunoquímica de CTb con peroxidasa y DAB fue elegido para el etiquetado retrógrado de las neuronas motoras, ya que es eficaz en revelar los procesos celulares incluyendo dendritas distales 10,19. Recientemente hemos utilizado este enfoque para identificar la vía motora vocal en ratones y revelar una conexión escasa de la corteza motora primaria de las neuronas motoras de la laringe, que fue asumido previamente a estar ausente 20.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoFil Microinjection System</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>IO-Kit</td>
			<td>34 gauge option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II Auto-Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sliding microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SM2010 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VetBond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane (Forane)</td>
			<td>Baxter&#160;</td>
			<td>1001936060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine Swab Stick</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>2130-01</td>
			<td>200 count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated dextran amines</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D-1956</td>
			<td>10,000 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudorabies virus</td>
			<td>Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University)</td>
			<td>PRV152</td>
			<td>Titer &#62; 1 x 107</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat)</td>
			<td>List Biological Laboratories</td>
			<td>703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin B Subunit</td>
			<td>List Biological Laboratories</td>
			<td>103B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-eGFP</td>
			<td>Open Biosystems</td>
			<td>ABS4528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3, 3&#39;-diaminobenzidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5905</td>
			<td>10 mg tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>Dilute to 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3410</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl &#38; Xylazine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K4138</td>
			<td>80 mg/mL &#38; 6 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3619</td>
			<td>1.0 M; pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>10X; pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pentobarbital</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3761</td>
			<td>50 mg/mL dose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td>Histological grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN Elite ABC Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optixcare opthalmic ointment</td>
			<td>Vet Depot</td>
			<td>1017992</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transsynaptic tracing from peripheral targets with pseudorabies virus followed by cholera toxin and biotinylated dextran amines double labeling

Trazado transináptico se ha convertido en una poderosa herramienta utilizada para analizar eferentes centrales que regulan los objetivos periféricos a través de los circuitos multi-sinápticas. Este enfoque ha sido utilizado más extensivamente en el cerebro mediante la utilización del virus de la pseudorrabia porcina patógenos (PRV) 1. PRV no infecta a los grandes simios, incluidos los humanos, por lo que es más comúnmente utilizado en estudios de pequeños mamíferos, especialmente roedores. El PRV152 seudorrabia cepa expresa la proteína fluorescente (EGFP) gen indicador verde mejorado y sólo cruza la sinapsis funcionales retrógrada a través de la secuencia jerárquica de las conexiones sinápticas de distancia desde el sitio de la infección 2,3. Otras cepas PRV tienen propiedades microbiológicas distintos y pueden ser transportados en ambas direcciones (PRV-Becker y PRV-Kaplan) 4,5. Este protocolo se ocupará exclusivamente de PRV152. Al entregar el virus en un lugar periférico, tales como el músculo, es posible limitar la entrada del virus en tque el cerebro a través de un conjunto específico de neuronas. El patrón resultante de la señal de eGFP en todo el cerebro a continuación, resuelve las neuronas que están conectados a las células infectadas inicialmente. Como la naturaleza distribuida de rastreo transináptico con el virus de la pseudorrabia hace interpretar conexiones específicas dentro de una red identificada difícil, presentamos un método sensible y fiable empleando aminas biotina dextrano (BDA) y la toxina del cólera subunidad B (CTB) para confirmar las conexiones entre las células identificadas utilizando PRV152. Detección inmunoquímica de BDA y CTb con peroxidasa y DAB (3, 3&#39;-diaminobencidina) fue elegido porque son eficaces a revelar los procesos celulares incluyendo dendritas distales 6-11.

La tinción para eGFP debería comenzar a mostrar señales débiles en las neuronas motoras primarias, aproximadamente 72 horas después de la inyección de PRV152 en el músculo. La replicación y transporte transináptico del virus son titer- y dependiente del tiempo 4. Aproximadamente 90 horas después de la inyección, la tinción eGFP revelará potente señal en las células infectadas de orden 2 nd. Tiempos de supervivencia más largos revelarán 3º y células de orden superior, p...

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Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling

Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.

Transináptico Seguimiento de Metas periféricos con Pseudorrabia Virus Seguido de la toxina del cólera y Biotinylated dextrano Aminas doble etiquetado

Transsynaptic tracing has become a powerful tool used to analyze central efferents that regulate peripheral targets through multi-synaptic circuits. This ...

transsynaptic-tracing-from-peripheral-targets-with-pseudorabies-virus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.6K vistas.  Duke University Medical Center. Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.

Video: Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

En el útero de electroporación seguido por cultivos neuronales primarias para estudiar la función génica en el subconjunto de neuronas corticales

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Investigación

Neurociencias

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Etiquetado retrógrada de células ganglionares retinianas en adultos de pez cebra con tintes fluorescentes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge in the field of virology; in particular for nuclear-replicating persistent DNA viruses that involve animal models for their study. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. Latent virus serves as reservoir, from which it reactivates and induces a new herpetic episode. The cell biology of HSV-1 latency remains poorly understood, in part due to the lack of methods to detect HSV-1 genomes in situ in animal models. We describe a DNA-fluorescent in situ hybridization (FISH) approach efficiently detecting low-copy viral genomes within sections of neuronal tissues from infected animal models. The method relies on heat-based antigen unmasking, and directly labeled home-made DNA probes, or commercially available probes. We developed a triple staining approach, combining DNA-FISH with RNA-FISH&#160;and immunofluorescence, using peroxidase based signal amplification to accommodate each staining requirement. A major improvement is the ability to obtain, within 10 &#181;m tissue sections, low-background signals that can be imaged at high resolution by confocal microscopy and wide-field conventional epifluorescence. Additionally, the triple staining worked with a wide range of antibodies directed against cellular and viral proteins. The complete protocol takes 2.5 days to accommodate antibody and probe penetration within the tissue.

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

We established a fluorescent in situ hybridization protocol for the detection of a persistent DNA virus genome within tissue sections of animal models. This protocol enables studying infection process by codetection of the viral genome, its RNA products, and viral or cellular proteins within single cells.

Detección del genoma y transcripciones de un virus ADN persistente en los tejidos neuronales por Fluorescente In situ La hibridación Combinado con inmunotinción

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis of primary cultures of neurons. We describe a set of procedures for: labeling newborn mice to be genotyped, rapid genotyping, and establishing low-density cultures of brain neurons from these mice. Individual mice are labeled by tattooing, which allows for long-term identification lasting into adulthood. Genotyping by the described protocol is fast and efficient, and allows for automated extraction of nucleic acid with good reliability. This is useful under circumstances where sufficient time for conventional genotyping is not available, e.g., in mice that suffer from neonatal lethality. Primary neuronal cultures are generated at low density, which enables imaging experiments at high spatial resolution. This culture method requires the preparation of glial feeder layers prior to neuronal plating. The protocol is applied in its entirety to a mouse model of the movement disorder DYT1 dystonia (&#916;E-torsinA knock-in mice), and neuronal cultures are prepared from the hippocampus, cerebral cortex and striatum of these mice. This protocol can be applied to mice with other genetic mutations, as well as to animals of other species. Furthermore, individual components of the protocol can be used for isolated sub-projects. Thus this protocol will have wide applications, not only in neuroscience but also in other fields of biological and medical sciences.

We describe procedures for labeling and genotyping newborn mice and generating primary neuronal cultures from them. The genotyping is rapid, efficient and reliable, and allows for automated nucleic-acid extraction. This is especially useful for neonatally lethal mice and their cultures that require prior completion of genotyping.

Rápido Genotipado de animales seguidas del establecimiento de cultivos primarios de neuronas cerebrales

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

Condicional transsynaptic genética Seguimiento en el cerebro de embriones de ratón

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly committed intermediate progenitor subtypes. Each of these subtypes expresses a set of specific molecular markers that, together with specific morphological criteria, can be used for their identification. Typically, immunofluorescent techniques are applied involving subtype-specific antibodies in combination with exo- or endogenous proliferation markers. We herein describe immunolabeling methods for the detection and quantification of all stages of adult hippocampal neurogenesis. These comprise the application of thymidine analogs, transcardial perfusion, tissue processing, heat-induced epitope retrieval, ABC immunohistochemistry, multiple indirect immunofluorescence, confocal microscopy and cell quantification. Furthermore we present&#160;a sequential multiple immunofluorescence protocol which circumvents problems usually arising from the need of using primary antibodies raised in the same host species. It allows an accurate identification of all hippocampal progenitor subtypes together with a proliferation marker within a single section. These techniques are a powerful tool to study the regulation of different progenitor subtypes in parallel, their involvement in brain pathologies and their role in specific brain functions.

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

La inmunohistoquímica y Etiquetado múltiple con anticuerpos de la misma especie anfitrión para adultos estudio del hipocampo neurogénesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

Neuronal Tracing en explantes cerebrales guiadas por láser

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Improving the Application of High Molecular Weight Biotinylated Dextran Amine for Thalamocortical Projection Tracing in the Rat

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of its labeling was affected by various factors, here, we provide a refined protocol for the application of high molecular weight BDA for studying optimal neural labeling in the central nervous system. After stereotactic injection of BDA into the ventral posteromedial nucleus (VPM) of the thalamus in the rat through a delicate glass pipette, BDA was stained with fluorescent streptavidin-Alexa (AF) 594 and counterstained with fluorescent Nissl stain AF500/525. On the background of green Nissl staining, the red BDA labeling, including neuronal cell bodies and axonal terminals, was more distinctly demonstrated in the somatosensory cortex. Furthermore, double fluorescent staining for BDA and the calcium-binding protein parvalbumin (PV) was carried out to observe the correlation of BDA labeling and PV-positive interneurons in the cortical target, providing the opportunity to study the local neural circuits and their chemical characteristics. Thus, this refined method is not only suitable for visualizing high quality neural labeling with the high molecular weight BDA through reciprocal neural pathways between the thalamus and cerebral cortex, but also will permit the simultaneous demonstration of other neural markers with fluorescent histochemistry or immunochemistry.

Here, we present a refined protocol to effectively reveal biotinylated dextran amine (BDA) labeling with a fluorescent staining method through a reciprocal neural pathway. It is suitable for analyzing the fine structure of BDA labeling and distinguishing it from other neural elements under a confocal laser scanning microscope.

Mejorar la aplicación de la amina de biotinilado dextrano de alto peso Molecular para la proyección de talamocorticales remontar en la rata

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of ...

Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate decisions, will be crucial to design therapeutic strategies for many diseases affecting the nervous system. Current methods to track cell populations rely on their final outcomes in still images and they generally fail to provide sufficient temporal resolution to identify behavioral features in single cells. Moreover, variations in cell death, behavioral heterogeneity within a cell population, dilution, spreading, or the low efficiency of the markers used to analyze cells are all important handicaps that will lead to incomplete or incorrect read-outs of the results. Conversely, performing live imaging and single cell tracking under appropriate conditions represents a powerful tool to monitor each of these events. Here, a time-lapse video-microscopy protocol, followed by post-processing, is described to track neural populations with single cell resolution, employing specific software. The methods described enable researchers to address essential questions regarding the cell biology and lineage progression of distinct neural populations.

A robust protocol to monitor neural populations by time-lapse video-microscopy followed by software-based post-processing is described. This method represents a powerful tool to identify biological events in a selected population during live imaging experiments.

La proyección de imagen seguida de la célula de seguimiento para la biología de la célula de Monitor y la progresión de linaje de poblaciones neuronales múltiples en vivo

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate ...

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. Additionally, epigenetic chromatin modifications, like histone methylation, have an important role for establishing and maintaining specific cell fates within this process. The vast majority of histone methylation occurs on the flexible histone tail, which is accessible to histone modifiers, erasers, and histone reader proteins. In contrast, H3K79 methylation is located in the globular domain of histone 3 and is implicated in different developmental functions. H3K79 methylation is evolutionarily conserved and can be found in a wide range of species from Homo sapiens to Saccharomyces cerevisiae. The modification occurs in different cell populations within organisms, including neural progenitors. The location of H3K79 methylation in the globular domain of histone 3 makes it difficult to assess. Here, we present methods to isolate and culture cortical progenitor cells (CPCs) from embryonic cortical brain tissue (E11.5-E14.5) or cerebellar granular neuron progenitors (CGNPs) from postnatal tissue (P5-P7), and to efficiently immunoprecipitate H3K79me2 for quantitative PCR (qPCR) and genome-wide sequencing.

We present an effective and reproducible method to isolate and culture neural progenitor cells from embryonic and postnatal brain tissue for chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - a histone mark located within the globular domain of histone 3.

Aislamiento y cultivo de progenitores neuronales seguido por inmunoprecipitación de cromatina de histona 3 lisina 79 dimetilación marca

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...