저자는 플라스미드 KanR-IntRBS-NpuNC - CFN (11)의 자신의 종류의 선물을 플라스미드의 자신의 유일한 선물 pQE9 AC 10 ATRP 12, 박사 톰 뮤어 (프린스턴 대학) 박사 데이비드 Tirrell (칼텍)을 인정하고 싶습니다 플라스미드의 자신의 유일한 선물 pJD757 13 플라스미드 pET30-CUTA-TIP1 10, 박사 제이 D. Keasling (UC 버클리)의 자신의 종류의 선물 박사 다케 히사 마츠다 (기술, 하쿠산, 이시카와 현, 일본의 가나자와 연구원) . 이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 경력, 미국 공군 YIP 노르만 핫쿠 고급 연구 프로그램에 의해 부분적으로 지원되었다.

1. 플라스미드 건설 참고 : 모든 유전자가 제조업체의 사양에 따라 Phusion 하이 피델리티 DNA 중합 효소를 사용하여 표준 PCR 반응에서 증폭되었다. 클로닝을 위해 사용 된 프라이머는 앞서 설명되었다 (9). 모든 구조는 표 1에 나타내었다. <ol><li> CUTA-NpuN (N, 표 1)를 생성하려면 : <ol><li> PCR은 적절한 프라이머를 사용하여, 각각 플라스미드 pET30-CUTA-TIP1 10 KanR-IntRBS-NpuNC CFN-11에서와 CUTA NpuN 유전자를 증폭한다. </li><li> 적절한 제한 효소로이 조각을 소화하고 순차적으로 T7 프로모터와 N (그림 2A)를 생성 할 수있는 C-말단 6xHistidine 태그 사이의 pET26b 벡터에이 조각을 삽입합니다. </li></ol></li><li> NpuC-S-CUTA (C, 표 1)를 생성하려면 : <ol><li> PCR 증폭 NpuC, CUTA 및 S fragmen적절한 프라이머를 사용하여 플라스미드 KanR-IntRBS-NpuNC - CFN 11 pET30-CUTA-TIP1 10 pQE9 AC 10 각각 ATRP 12 일부터 T [AG 3 (PEG)] 10. </li><li> 적절한 제한 효소로이 조각을 소화하고 순차적으로 T7 프로모터와 C (그림 2B)를 생성 할 수있는 C-말단 6xHistidine의 pET26b 벡터에이 조각을 삽입합니다. </li></ol></li><li> : NpuC-S-SH3 LIG-CUTA (C-SH3 LIG 손해, 표 1)를 생성하려면 <ol><li> PCR 증폭 CUTA SH3 LIG 손해 (PPPALPPKRRR) 및 조각 SH3 LIG-CUTA을 생성하는 유연한 링커 (GGGGS) 2를 포함하는 프라이머를 사용하여. </li><li> 조각 SH3 LIG-CUTA와 C에서 CUTA 유전자를 교체합니다. </li></ol></li><li> SH3-GFP (표 1)를 생성하려면 : <ol><li> 사용하여 플라스미드 pJD757 13에서 SH3 유전자를 증폭적합한 프라이머. </li><li> GFP 유전자에이 조각을 융합하고 T7 프로모터 (그림 2C)과 C-말단 6xHistidine 태그 사이의 pET26b 벡터에 삽입합니다. </li></ol></li></ol> 2. 단백질 발현 <ol><li> 적절한 발현 플라스미드와 화학적 유능한 대장균 BL21 (DE3)의 50 μL를 변형. </li><li> 변환 후, 순차적으로 이들 세포를 희석하고, 루리아 - 베르 타니 (LB)에 그들을 접시 / 50 ㎍ / ㎖의 카나마이신을 포함하는 한천 플레이트. </li><li> ~ 15 시간 동안 37 ° C에서 형질 전환 된 세포를 포함하는 번호판을 품어. </li><li> 배양 후, 50 ~ 100 식민지를 포함하는 판을 선택하고 LB의 국물 5 ㎖의 모든 식민지를 재현 탁. </li><li> 전송 1 L LB의 국물 포함 카나마이신 (50 ㎍ / ㎖)에 서스펜션과 250 rpm에서 진탕 37 ° C에서 세포를 성장. 600 nm의 (OD 600)에서 흡광도를 모니터링합니다. OD 600 ~ 0.8까지의 문화를 성장. <ol><li> C 및 C-SH3 LIG 손해 보험의 경우, 문화 (1 mM의 최종 농도)에 이소 프로필 β-D-1-티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하고 250 rpm에서 진탕하면서 4 시간 동안 37 ° C에서 문화를 품어. </li><li> N 및 SH3-GFP를 들어, 문화를 냉각 ~ ~ 5 분 동안 얼음 수조에서 배양 플라스크를 침지하여 18 ° C에서. 문화 (1mM의 최종 농도)에 IPTG를 첨가하여 단​​백질 발현을 유도하고 250 rpm에서 진탕하면서 14 ~ 18 시간 동안 18 ° C에서 문화를 배양한다. </li></ol></li><li> 단백질 발현 후, 펠렛을 수집하기 위해 4 ° C에서 20 분 동안 6,000 XG에 문화를 원심 분리기. -80 ° C까지 사용에 보관 세포 펠렛. </li></ol> 3. 단백질 정제 <ol><li> N의 정제 (변성 조건) <ol><li> 10 젖은 펠렛 ㎖ / g에서 버퍼 A (표 2)에 재현 탁 세포 펠렛. </li><li> Immers빙수 욕에서 펠릿 서스펜션 및 전자 (1 초 펄스 및 1 분 10 초의 일시 정지와 앰프 10) 초음파 처리에 의해 세포를 방해. </li><li> 4 ℃에서 20 분 동안 16,000 XG에서 해물을 원심 분리기 </li><li> 상층 액을 버린다. (8 M 요소를 포함하는) 버퍼 DA의 펠렛을 재현 탁하고 4 ℃에서 20 분 동안 16,000 XG에서 현탁액을 원심 분리 </li><li> 이전에 버퍼 DA와 평형을 5 ㎖ 니켈 니트릴 로트리 아세트산 (NTA) 칼럼을 통해 뜨는을 전달합니다. </li><li> 45 mM의 이미 다졸 보충 버퍼 DA 30 ㎖로 컬럼을 씻으십시오. 150 mM의 이미 다졸과 보충 버퍼 DA 20 ㎖를 사용하여 정제 된 단백질을 용출. </li><li> 3.1.7.1 또는 3.1.7.2에 주어진 다음 방법 중 하나가 &lt;1 mm로 단백질 샘플의 요소 농도를 감소 : <ol><li> &lt;20 kDa의 차단과 함께 튜브를 사용하여 4 ° C에서 하룻밤에 DPBS 버퍼 (표 2)에서 단백질을 Dialyze. </li><li> 원심 분리기는 30 &amp; # 단백질을 정제160, 2,800 XG에 kDa의 초 여과 스핀 열, 4 ° C 볼륨까지보다 1 ㎖이다. 단백질 시료를 희석하기 위해 열을 14 ML의 DPBS 버퍼를 추가합니다. 원심 분리 / 희석 세 번 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 버퍼 교환 한 후, 정제 된 단백질 (최종 2 ㎜)에 디티 오 트레이 톨 (DTT)를 추가하고 2,800 XG에 30 kDa의 초 여과 스핀 열, 4 ° C.를 원심 분리하여 ~ 100 ㎎ / ㎖로 단백질을 집중 </li><li> 사용할 때까지 -80 ° C에서 농축 된 단백질과 상점을 나누어지는. </li></ol></li><li> C 및 C-SH3 LIG의 정화 (기본 조건) <ol><li> 버퍼 B (10) 습식 펠렛 ㎖ / g에서 1X 프로테아제 억제제 칵테일 보충 (산도 6.0) (표 2)에 재현 탁 세포 펠렛. 표적 단백질의 단백질 가수 분해를 최소화하기 위해 산성 완충액을 사용한다. </li><li> 3.1.2에 설명 된대로 초음파 처리하여 세포 현탁액을 방해. 리스를 원심 분리기4 ° C에서 20 분 동안 16,000 XG에서 먹고 뜨는을 유지합니다. </li><li> 이전에 버퍼 B.와 평형을 5 ㎖의 니켈 - NTA 칼럼을 통해 가용성 해물 합격 </li><li> 버퍼 B와 세척 컬럼 45 mM의 이미 다졸로 보충하고, 150 mM의 이미 다졸 완충액 B로 보충 된 20 ml의 표적 단백질을 용출. </li><li> C의 경우, 3.2.6 단계로 이동합니다. C-SH3의 LIG 들어 단계에 따른다 부분적 분해 단백질을 제거하기 위해 추가로 이온 교환 정제 단계 3.2.5.3에 3.2.5.1을 수행 <ol><li> 3.1.7에 설명 된 절차에 따라 &lt;1 mm로 C-SH3 LIG 손해에 염화나트륨의 농도를 줄일 수 있습니다. </li><li> 이전 인산 나트륨 완충액 (50 mM의, 산도 7.0)으로 평형을 5 ㎖의 이온 교환 구슬로 장식 된 아가 로스 매트릭스 칼럼에 목적 단백질을로드합니다. </li><li> 10 mM 트리스 - 염산 pH를 8.0 buffe 함유 용액으로부터 구배를 실행하여 칼럼으로부터 용출 표적 단백질1 M NaCl로 보충 된 동일한 완충액을 함유하는 용액에 R. 도데 실 황산나트륨 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에 기초하여 높은 순도의 단백질 용출 및 풀 샘플 중에 샘플을 채취. </li></ol></li><li> 3.1.7에 설명 된대로, DPBS 버퍼로 정제 된 단백질을 교환 버퍼입니다. </li><li> 정제 된 단백질 (최종 농도 2 ㎜)에 DTT를 추가하고 3.1.8에 설명 된대로 ~ 100 ㎎ / ㎖ 30 kDa의 초 여과 스핀 컬럼을 사용하여 단백질을 집중한다. 나누어지는 및 저장은 -80 ° C까지 사용에서 단백질을 집중했다. </li></ol></li><li> SH3-GFP의 정화 <ol><li> 10 젖은 펠렛 ㎖ / g에서 버퍼를 사용을 Resuspend 세포 펠렛. </li><li> 3.1.2에 설명 된 초음파에 의해 펠릿 현탁액을 방해. </li><li> 4 ° C에서 20 분 동안 16,000 XG에서 해물을 원심 분리기 및 뜨는을 수집합니다. </li><li> 이전에 평형을 5 ㎖의 니켈 - NTA 칼럼을 통해 상층 액 (수용성 해물을) 통과버퍼 A. </li><li> 버퍼 30 ㎖로 컬럼을 씻어 45 mM의 이미 다졸 보충. 버퍼 20 ㎖의 150 mM의 이미 다졸을 사용하여 보충 된 정제 된 단백질을 용출. </li><li> 버퍼 3.1.7에 기술 된 것과 유사한 방법을 사용 DPBS 완충액에 정제 된 단백질을 교환하고 단백질을 농축 ~ 150 ㎎ / 3.1.8에서 설명한 바와 같이 30 kDa의 울트라 여과 스핀 컬럼을 사용하여 ML. </li><li> 나누어지는 및 저장은 -80 ° C까지 사용에서 단백질을 정제. </li></ol></li><li> CUTA을 함유하는 정제 된 샘플의 SDS-PAGE 분석 <ol><li> 염화나트륨 ~ 1 mm까지의 농도를 줄이기 위해 두 번 증류수에 각각의 정제 된 단백질을 희석. 이 염화나트륨 농도에서 CUTA 량체 단백질의 대부분은 SDS-PAGE 겔에 단량체로서 실행. </li><li> 2X SDS 샘플 버퍼 (0.5 M 트리스 - 염산, 산도 6.8, 글리세롤, 10 % w SDS V / 0.1 % V의 브로 모 페놀 블루, 2 %의 β-머 캅토 에탄올 승 / 20 %), 95 ° C에서 배양과 샘플을 혼합 5 분. </li><li> 샘에게로드PLES 12 % SDS-PAGE 젤 상. 50 분 ~ 200 V의 일정한 전압에서 전기 영동을 수행하십시오. </li><li> 표준 프로토콜 (그림 1C) 다음 쿠마 화려한 푸른 R250로 염색하여 젤의 단백질을 관찰한다. </li></ol></li></ol> 4. 하이드로 겔 형성 참고 : 별도로 언급하지 않는 한이 연구에서 만든 샘플 하이드로 겔 각 하이드로 겔 빌딩 블록 1.6 밀리미터가 포함되어 있습니다. 이 단백질의 농도는 부드럽고 안정된 겔을 얻을 수 있습니다. 주의 : 아 지드 화 나트륨 (NaN이 3) 박테리아 오염을 방지하기 위해 V / w 0.5 %의 최종 농도로 하이드로 겔에 첨가된다. NaN의 3은 매우 독성 및 물질 안전 보건 자료 (MSDS)에 표시된 극단주의하여 취급해야합니다. <ol><li> 100 μL 샘플 하이드로 겔에서 1.6 ㎜의 최종 농도를 달성하기 위해 필요한 농축 단백질의 각각의 볼륨을 산출한다. 예를 들면 : N의 농도 :100 ㎎ / ㎖ N의 분자량 26.3 kDa의 (표 1 참조) 원하는 양 : 100 ㎕를 원하는 농도 : 1.6 mM의 <img alt="" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/51202/book.JPG" src="/files/ftp_upload/51202/book.JPG" width="600" /></li><li> 100 ㎕의 히드로 겔 (1.6 mm)를 만들려면 C를 혼합 (X μL, 볼륨 4.1에 따라 계산) 5 % NaN의 3 (10 μL)로, 100 mM의 DTT (5 μL)와 N (Y μL, 양에 따라 계산 4.1) 2 ㎖ 유리 병 내부. </li><li> 100 μL의 최종 볼륨을 달성하기 위해 유리 병에 (Y) μL - X - (85), 수동 피펫 팁을 사용하여 소용돌이 치는 움직임을 통해 모든 구성 요소를 혼합 DPBS 버퍼를 추가합니다. 참고 :이 솔루션은 혼합시 점성이됩니다. </li><li> 기포를 제거하기 위해 8,000 XG에서 2 분 동안 상기 혼합물을 원심 분리기. </li><li> 방에서 혼합물을 품어테인 트랜스 - 스 플라이 싱 반응이 완성에 도달 할 수 있도록 밤새 온도. 거꾸로 튜브를 돌려 하이드로 겔 형성을 확인합니다. 하이드로 겔이 형성되는 경우에 단백질은 흐르지 않는다. </li><li> 3.4 (그림 1C)에 설명 된대로, 4.2 단계 전에 SDS-PAGE 젤에 4.5 단계 이후에 수집 된 시료 (0.5 ㎕의 각)을 확인하여 테인 트랜스 - 스 플라이 싱의 수익률을 예상하고있다. </li></ol> 5. 도킹 단백질 (DP)와 도킹 스테이션을 통한 GFP의 고정 펩타이드 (DSP)의 상호 작용 <ol><li> 50 μL의 GFP 기능화 된 하이드로 겔 (1.2 mm)를 만들기 위해 1.7 1:1 몰비 (4.1에 따라 계산, X μL) C-SH3 LIG 손해를 결합 SH3-GFP (Y μL, 4.1에 따라 계산) 밀리리터 microcentrifuge 관 및 실온에서 30 분 동안 혼합물을 배양한다. </li><li> X - - ​​&lt;5 % NaN의 3 (5 μL), 100 mM의 DTT (2.5 μL), (42.5 추가같은 관에 EM&gt; Y) μL의 DPBS. N 및 C-SH3 LIG의 1:1 몰비를 달성하기 위해 N (Y μL, 4.1에 따라 계산)을 추가한다. 소용돌이 운동에 의해 피펫 팁을 사용하여 샘​​플을 섞는다. </li><li> 2 분 동안 8,000 XG에서 상기 혼합물을 원심 분리에 어두운 혼합물을 실온에서 밤새 배양한다. 배양 중에 SH3-GFP 양식을 캡슐화하는 하이드로 겔. </li></ol> 6. 유기 용매에서 효소 반응에 대한 고정화 발판 1.6 mM의 히드로 겔의 사용 <ol><li> 모델 효소로 HRP를 사용합니다. DPBS에 HRP (28 ㎎ / ㎖ 또는 0.63 ㎜)의 주식 솔루션을 준비합니다. </li><li> HRP 포획 30 ㎕의 히드로 겔 (1.6 mm)를 만들려면 C 내부 HRP (2 μL), 5 % NaN의 3 (3 μL) 및 DTT (100 mm의 1.5 μL)과 (X μL, 4.1에 따라 계산) 겸용 1.7 ML의 원심 분리기 튜브. </li><li> N (Y 추가 &lt;/ EM&gt; 4.1에 따라 계산 μL) 및 DPBS (23.5 - X - Y) μL. 소용돌이 모션 피펫 팁과 섞는다. </li><li> 2 분 동안 8,000 XG에서 혼합물을 원심 분리하고, 실온에서 밤새 배양한다. 주의 : 다음 활동 분석에 사용되는 섭정은 매우 독성이 있습니다. 해당 물질 안전 보건 자료 (MSDS)에 의해 특정 안전 권고를 사용합니다. </li><li> 효소 반응을 위해, n-헵탄 (14)의 N, N-디메틸-p-페닐 렌 디아민 (5.8 ㎜), 페놀 (5.8 ㎜) 및 tert-부틸 하이드 로퍼 옥사이드 (2.9 mm)를 함유하는 반응 칵테일 1 ㎖의 하이드로 겔을 물속. 수동 하이드로 겔과 용매의 접촉 면적을 증가시키기 위해 피펫 팁을 사용하여 겔을 방해. </li><li> 플레이트 리더 (그림 5)에서 546 nm에서 다른 시간에 촬영 한 샘플의 흡광도를 측정하여, HRP 제품, 인도 페놀 형 염료를 감지합니다. </li> &lt;/ OL&gt;

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더 경쟁하는 금융 이익은 존재하지 않습니다.

이 작품에서 우리는 매우 안정적인 테인 매개 단백질 하이드로 겔의 합성을 보여 주었다. 분할의 사용은 테인 조건부이 액상 성분의 혼합에 대응하여 형성되는 히드로 겔을 가능하게한다. 구체적으로는, 분할 테인 공유 차례로 자기 하이드로 겔로 조립하는 것이 단위 가교 어귀 폴리펩티드 유닛을 수득 트랜스 - 스 플라이 싱 반응을 통해이 액상 빌딩 블록을 연결한다. 하이드로 겔의 혼합?...

단백질 완전히 만든 하이드로 겔은 크게 조직 공학, 약물 전달 및 biofabrication 1 등 다양한 분야를 발전 할 수있는 잠재력을 가지고 다니십시오. 그들은 생체 적합성 및 비 침습적 생체 활성 구형 단백질의 결합을 지원하는 가능성을 포함하여 기존의 합성 고분자 하이드로 젤에 이점을 제공합니다. 이 작품에서 우리는 단백질 고정화 발판으로 분할 테인 매개 단백질 트랜스 - 스 플라이 싱 반응과 그 응용 (그림 1)를 통해 형성되는 새로운 단백질 하이드로 겔의 개발을 설명합니다. 이러한 하이드로 겔을위한 빌딩 블록은 각각 (IN 및 IC)를 테인 분할 및 가교제 다중 체 단백질의 서브 유닛의 N-또는 C-말단 단편을 포함 두 단백질 블록 공중 합체이다. 테인 Nostoc의 punctiforme (NPU)에서 DnaE 2,3 테인 분할 및 작은 삼량 단백질 피로 코커스 (12 kDa의) CUTA 리코 쉬이 &lt;로 사용되었다/ EM은&gt; 가교제 단백질 4,5로서 사용 하였다. 다른 가교 결합제는 고도로 가교 결합 된 단백질 네트워크 (하이드로 겔)의 형성으로 이어지는 테인 촉매 된 트랜스 - 스 플라이 싱 반응을 통해 결합된다. NPU의 테인이 때문에 빠른 반응 속도 (t 1 / 2 = 63 초)과 높은 트랜스 - 스 플라이 싱 수익률 (에 가까운 80 %), 3의 선택되었다. CUTA 단백질은 높은 안정성으로 인해 가교제로 선정되었습니다. CUTA 트리머 근처 150 ° C의 변성 온도를 가지고 많은 M 5로 구아니딘 염산염 4,6를 포함하는 솔루션 삼량 차 구조를 유지합니다. 다른 가교제 사이의 서브 유닛 교환이 물리적 하이드로 겔 표면 침식 7의 주요 원인이기 때문에, CUTA에서 매우 강한 서브 유닛 간 상호 작용은보다 안정적인 하이드로 겔로 이어지는, 그런 서브 유닛 교환을 억제해야한다. 이러한 빌딩 블록 중 하나는 물을 용이하게하기 위해 중간 블록으로 친수성이 높은 펩티드 S-단편을 포함보존 8. 하이드로 겔이 빌딩 블록의 혼합 양 말단에 가교제와 더 긴 폴리펩티드 사슬을 생성 단편 테인 IN과 IC 사이의 트랜스 - 스 플라이 싱 반응을 개시한다. 여러 그러한 분자 단위에서 가교제는 고도로 가교 하이드로 겔 네트워크 (도 1a)을 형성하는, 서로 상호 작용. 구체적인 &quot;도킹 스테이션 펩티드&quot;(DSP)는 &quot;도킹 단백질&quot;(DP) - 태그 된 하이드로 겔로 표적 단백질을 안정적으로 고정화를 용이하게 하이드로 겔 빌딩 블록 중 하나에 포함된다. 하이드로 겔 어셈블리를 중재하는 테인 분할의 사용은 표적 단백질이 종래의 하이드로 겔 형성에 로딩 될 때, 단백질의 겔 합성에 추가적인 유연성을 제공하지만, 또한 전체 하이드로 걸쳐 표적 단백질의 고밀도, 균일 한 하중을 가능 아닙니다. 테인 매개 단백질 하이드로 겔이 높은 역입니다과 수용액에 적합한 용 작은 - 투 - 더 실온에서 3 개월 만에 검출 침식. 안정성은 pH 값 (6-10)과 온도 (4-50 ℃)의 넓은 범위에서 유지하고, 하이드로 겔은 유기 용매와 호환된다. 녹색 형광 단백질 (GFP)와 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)이 하이드로 겔은 두 개의 공 모양 단백질의 고정화에 사용됩니다. 후자 단백질을 포획 하이드로 겔은, 유기 용매 중에서 생물 촉매를 수행하는데 사용된다.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:541px;" width="541">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Name 
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Company
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			Catalog Number
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Comments
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:23px;">
			Phusion High Fidelity DNA polymerase
			</td>
			<td style="width:111px;height:23px;">
			New England BioLabs
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:23px;">
			M0530S
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:23px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Competent Escherichia coli BL21 (DE3)
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			New England BioLabs
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			C2527I
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Luria Bertani
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			90003-350
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Bacto Agar Media
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			<a href="https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=90000-760">90000-760</a>
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			kanamycin sulfate
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			<a href="https://www.vwrsp.com/catalog/product/index.cgi?catalog_number=97061-602">97061-602</a>
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			IPTG
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			EM-5820
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			Imidazole
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			EM-5720
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			Urea
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			EM-9510
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			Dithiothreitol (DTT)
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			BP172-5
			</td>
			<td style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Protease Inhibitor cocktail
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Roche Applied Science
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			11836153001
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			DPBS
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			82020-066
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Brilliant Blue R
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Acros Organics
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			A0297990
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Sodium Azide
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			AC190380050
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Caution, highly toxic
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Horseradish peroxidase
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			P8125-5KU
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			N,N-dimethyl-p-phenylene diamine
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			AC408460250
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Caution, highly toxic
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			phenol
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			AC149340500
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Caution, highly toxic
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			tert-butyl hydroperoxide
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			AC180340050
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Caution, highly toxic
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			n-heptane
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Acros Organics
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			120340010
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;"></td>
			<td style="width:111px;height:21px;"></td>
			<td style="width:118px;height:21px;"></td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Shaker/Incubator
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			Max Q 6000
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Centrifuge
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Sorvall
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			RC 6
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Sonicator
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			QSonica
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			Misonix 200
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Ultrafiltration Tubes
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Amicon Ultra
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			UFC903024
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			&#160;Ni Sepharose High Performance HisTrap column
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			GE Healthcare Life Sciences
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			17-5248-01
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			GE Healthcare Life Sciences
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			17-5156-01
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Plate reader
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Molecular Devices
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			SpectraMax Gemini EM
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of an intein-mediated artificial protein hydrogel

우리는 분할 테인-촉매 단백질 트랜스 - 스 플라이 싱 반응에 의해 매개되는 매우 안정한 단백질 겔의 합성을 제시한다. 이러한 하이드로 겔의 빌딩 블록은 각각 분할 테인의 가교제 및 ​​반 역할 삼량 단백질의 서브 유닛을 포함하는 단백질이 블록 공중 합체이다. 친수성이 높은 임의의 코일은 물 보존을위한 블록 공중 합체 중 하나에 삽입된다. 두 단백질의 블록 공중 합체의 혼합은 한쪽 끝에서 가교제와 폴리 펩타이드 단위를 산출 테인 트랜스 - 스 플라이 싱 반응을 유발하는 하이드로 겔에 신속하게 자기 조립. 하이드로 겔은 50 ° C까지, 및 유기 용매에 온도에서 모두 산성과 염기성 조건에서 매우 안정적입니다. 전단에 의한 파열 후 하이드로 겔은 빠른 속도로 개혁. 하이드로 겔 빌딩 블록에 &quot;도킹 스테이션 펩티드&quot;의 설립은 &quot;도킹 단백질&quot;- 태그 표적 단백질을 편리하게 결합 할 수 있습니다.히드로 겔은 조직 배양 성장 배지와 호환되는 20 kDa의 분자 확산을 지원하고, 생리 활성 단백질의 구형 고정화를 가능하게한다. 유기 용제 대응의 생체 촉매로서 테인 - 매개 단백질 겔의 적용은 고추 냉이 퍼 옥시 다제 효소를 캡슐화하고 그 활성을 확증에 의해 입증되었다.

테인 매개 단백질 하이드로 겔 형성을위한 회로도는 그림 1A에 제시되어있다. 하이드로 겔의 빌딩 블록은 단백질 CUTA NpuN-(N) 및-S-NpuC CUTA (C) (도 1a, 표 1)를 공중합. NpuN / C는 Nostoc의 punctiforme (NPU)에서 테인 자연스럽게 분할 DnaE의 N-/C-fragments 있습니다. CUTA는 피로 코커스 호 리코 쉬이 4,5에서 안정적인 삼량 단백질이다. (도 1A 및 1C) : ?...

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Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

우리는 분할 테인 - 매개 단백질 겔의 합성을 제시한다. 이러한 하이드로 겔의 빌딩 블록은 각각 분할 테인의 가교제 및 ​​반 역할 삼량 단백질의 서브 유닛을 포함하는 단백질이 공중 합체이다. 두 단백질 공중 합체의 혼합은 하이드로 겔로 자기 조립 폴리펩티드 단위를 산출 테인 트랜스 - 스 플라이 싱 반응을 트리거합니다. 하이드로 겔은 높은 산도와 온도 안정, 유기 솔벤트와 함께, 쉽게 기능을 구형 단백질을 포함하고 있습니다.

테인 매개 인공 단백질 히드로 겔의 합성

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

synthesis-of-an-intein-mediated-artificial-protein-hydrogel

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.9K 조회수.  Texas A&M University, College Station.  우리는 분할 테인 - 매개 단백질 겔의 합성을 제시한다. 이러한 하이드로 겔의 빌딩 블록은 각각 분할 테인의 가교제 및 ​​반 역할 삼량 단백질의 서브 유닛을 포함하는 단백질이 공중 합체이다. 두 단백질 공중 합체의 혼합은 하이드로 겔로 자기 조립 폴리펩티드 단위를 산출 테인 트랜스 - 스 플라이 싱 반응을 트리거합니다. 하이드로 겔은 높은 산?...

비디오: Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently incorporated into film assemblies that serve as adsorption platforms for protein monolayer electrochemistry (PME). PME is utilized as the model system for studying electrochemical properties of redox proteins by confining them to an adsorption platform at a modified electrode, which also serves as a redox partner for electron transfer (ET) reactions. Studies have shown that gold nanoparticle film assemblies of this nature provide for a more homogeneous protein adsorption environment and promote ET without distance dependence compared to the more traditional systems modified with alkanethiol self-assembled monolayers (SAM).1-3 In this paper, MPCs functionalized with hexanethiolate ligands are synthesized using a modified Brust reaction4 and characterized with ultraviolet visible (UV-Vis) spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM), and proton (1H) nuclear magnetic resonance (NMR). MPC films are assembled on SAM modified gold electrode interfaces by using a "dip cycle" method of alternating MPC layers and dithiol linking molecules. Film growth at gold electrode is tracked electrochemically by measuring changes to the double layer charging current of the system. Analogous films assembled on silane modified glass slides allow for optical monitoring of film growth and cross-sectional TEM analysis provides an estimated film thickness. During film assembly, manipulation of the MPC ligand protection as well as the interparticle linkage mechanism allow for networked films, that are readily adaptable, to interface with redox protein having different adsorption mechanism. For example, Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) can be adsorbed hydrophobically to dithiol-linked films of hexanethiolate MPCs and cytochrome c (cyt c) can be immobilized electrostatically at a carboxylic acid modified MPC interfacial layer. In this report, we focus on the film protocol for the AZ system exclusively. Investigations involving the adsorption of proteins on MPC modified synthetic platforms could further the understanding of interactions between biomolecules and man-made materials, and consequently aid the development of biosensor schemes, ET modeling systems, and synthetic biocompatible materials.5-8

Alkanethiolate stabilized gold colloids known as monolayer protected clusters (MPCs) are synthesized, characterized, and assembled into thin films as an adsorption interface for protein monolayer electrochemistry of simple redox protein like Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) and cytochrome c (cyt c).

Monolayer의 합성, 조립, 그리고 특성화는 단백질 Monolayer의 전기에 대한 골드 Nanoparticle 필름을 보호

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

연구

생체공학

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with conventional one-sample-at-a-time synthesis techniques, a more recent high-throughput approach has been developed enabling the synthesis and testing of large libraries of polyanhydrides1. This will facilitate more efficient optimization and design process of these biomaterials for drug and vaccine delivery applications. The method in this work describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries. In this robotically operated method (Figure 1), linear actuators and syringe pumps are controlled by LabVIEW, which enables a hands-free automated protocol, eliminating user error. Furthermore, this method enables the rapid fabrication of micro-scale polymer libraries, reducing the batch size while resulting in the creation of multivariant polymer systems. This combinatorial approach to polymer synthesis facilitates the synthesis of up to 15 different polymers in an equivalent amount of time it would take to synthesize one polymer conventionally. In addition, the combinatorial polymer library can be fabricated into blank or protein-loaded geometries including films or nanoparticles upon dissolution of the polymer library in a solvent and precipitation into a non-solvent (for nanoparticles) or by vacuum drying (for films). Upon loading a fluorochrome-conjugated protein into the polymer libraries, protein release kinetics can be assessed at high-throughput using a fluorescence-based detection method (Figures 2 and 3) as described previously1. This combinatorial platform has been validated with conventional methods2 and the polyanhydride film and nanoparticle libraries have been characterized with 1H NMR and FTIR. The libraries have been screened for protein release kinetics, stability and antigenicity; in vitro cellular toxicity, cytokine production, surface marker expression, adhesion, proliferation and differentiation; and in vivo biodistribution and mucoadhesion1-11. The combinatorial method developed herein enables high-throughput polymer synthesis and fabrication of protein-loaded nanoparticle and film libraries, which can, in turn, be screened in vitro and in vivo for optimization of biomaterial performance.

This method describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries.

조합의 합성과 고분자 필름과 Nanoparticle 도서관에서 높은 처리량 단백질 출시

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the limited access to donor hearts. An example of a treatment to recover the function of the heart consists of the local delivery of drugs and bioactives from a hydrogel. In this paper a method is introduced to formulate and inject a drug-loaded hydrogel non-invasively and side-specific into the pig heart using a long, flexible catheter. The use of 3-D electromechanical mapping and injection via a catheter allows side-specific treatment of the myocardium. To provide a hydrogel compatible with this catheter, a supramolecular hydrogel is used because of the convenient switching from a gel to a solution state using environmental triggers. At basic pH this ureido-pyrimidinone modified poly(ethylene glycol) acts as a Newtonian fluid which can be easily injected, but at physiological pH the solution rapidly switches into a gel. These mild switching conditions allow for the incorporation of bioactive drugs and bioactive species, such as growth factors and exosomes as we present here in both in vitro and in vivo experiments. The in vitro experiments give an on forehand indication of the gel stability and drug release, which allows for tuning of the gel and release properties before the subsequent application in vivo. This combination allows for the optimal tuning of the gel to the used bioactive compounds and species, and the injection system.

Supramolecular hydrogelators based on ureido-pyrimidinones allow full control over the macroscopic gel properties and the sol&#8211;gel switching behavior using pH. Here, we present a protocol for formulating and injecting such a supramolecular hydrogelator via a catheter delivery system for local delivery directly in relevant areas in the pig heart.

돼지 심장에 현지 카테터 주입 용 주사 및 약물로드 초분자 히드로 겔

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel capabilities to perform basic and applied sciences in test tube reactions. Over the past decade, cell-free TXTL has become a powerful technique for a broad range of novel multidisciplinary research areas related to quantitative and synthetic biology. The new TXTL platforms are particularly useful to construct and interrogate biochemical systems through the execution of synthetic or natural gene circuits. In vitro TXTL has proven convenient to rapidly prototype regulatory elements and biological networks as well as to recapitulate molecular self-assembly mechanisms found in living systems. In this article, we describe how infectious bacteriophages, such as MS2 (RNA), &#934;&#935;174 (ssDNA), and T7 (dsDNA), are entirely synthesized from their genome in one-pot reactions using an all Escherichia coli, cell-free TXTL system. Synthesis of the three coliphages is quantified using the plaque assay. We show how the yield of synthesized phage depends on the biochemical settings of the reactions. Molecular crowding, emulated through a controlled concentration of PEG 8000, affects the amount of synthesized phages by orders of magnitudes. We also describe how to amplify the phages and how to purify their genomes. The set of protocols and results presented in this work should be of interest to multidisciplinary researchers involved in cell-free synthetic biology and bioengineering.

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation platforms has been engineered to construct biochemical systems in vitro through the execution of gene circuits. In this article, we describe how bacteriophages, such as MS2, &#934;&#935;174, and T7, are synthesized from their genome using an all E. coli cell-free TXTL system.

에는 대장균-감염 살 균 소의 합성 기반 셀 무료 식 시스템

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

An Additive Manufacturing Technique for the Facile and Rapid Fabrication of Hydrogel-based Micromachines with Magnetically Responsive Components

Polyethylene glycol (PEG)-based hydrogels are biocompatible hydrogels that have been approved for use in humans by the FDA. Typical PEG-based hydrogels have simple monolithic architectures and often function as scaffolding materials for tissue engineering applications. More sophisticated structures typically take a long time to fabricate and do not contain moving components. This protocol describes a photolithography method that allows for facile and rapid microfabrication of PEG structures and devices. This strategy involves an in-house developed fabrication stage that allows for the rapid fabrication of 3D structures by building upwards in a layer-by-layer fashion. Independent moving components can also be aligned and assembled onto support structures to form integrated devices. These independent components are doped with superparamagnetic iron oxide nanoparticles that are sensitive to magnetic actuation. In this manner, the fabricated devices can be actuated using external magnets to yield movement of the components within. Hence, this technique allows for the fabrication of sophisticated MEMS-like devices (micromachines) that are composed entirely out of a biocompatible hydrogel, able to function without an onboard power source, and respond to a contact-less method of actuation. This manuscript describes the fabrication of both the fabrication set-up as well as the step-by-step method for the microfabrication of these hydrogels-based MEMS-like devices.

An additive manufacturing strategy for processing UV-crosslinkable hydrogels has been developed. This strategy allows for the layer-by-layer assembly of microfabricated hydrogel structures as well as the assembly of independent components, yielding integrated devices containing moving components that are responsive to magnetic actuation.

첨가제 제조 기술은 자석으로 응답 구성 요소와 히드로 기반 Micromachines의 손쉬운 고 빠른 제작을 위해

Polyethylene glycol (PEG)-based hydrogels are biocompatible hydrogels that have been approved for use in humans by the FDA. Typical PEG-based hydrogels ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

멀티플렉스 인공 세포 MicroEnvironment 배열의 제작

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with controlled pore structure and mechanical properties. Cellulose nanocrystals (CNCs, 69.62 wt%) based hydrogel ink with matrix (sodium alginate and gelatin) was developed and 3D printed into scaffolds with uniform and gradient pore structure (110-1,100 &#181;m). The scaffolds showed compression modulus in the range of 0.20-0.45 MPa when tested in simulated in vivo conditions (in distilled water at 37 &#176;C). The pore sizes and the compression modulus of the 3D scaffolds matched with the requirements needed for cartilage regeneration applications. This work demonstrates that the consistency of the ink can be controlled by the concentration of the precursors and porosity can be controlled by the 3D printing process and both of these factors in return defines the mechanical properties of the 3D printed porous hydrogel scaffold. This process method can therefore be used to fabricate structurally and compositionally customized scaffolds according to the specific needs of patients.&#160;

The three critical steps of this protocol are i) developing the right composition and consistency of the cellulose hydrogel ink, ii) 3D printing of scaffolds into various pore structures with good shape fidelity and dimensions and iii) demonstration of the mechanical properties in simulated body conditions for cartilage regeneration.

3D 인쇄 다공성 셀 루 로스 나노 하이드로 겔 건설 기계

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an attractive alternative to liposomes or fatty acid-based vesicles. Externally or within the vesicles, peptides can be easily expressed and simplify the synthesis of membrane precursors. Provided here is a protocol for the creation of vesicles with diameters of ~200 nm based on the amphiphilic elastin-like polypeptides (ELP) utilizing dehydration-rehydration from glass beads. Also presented are protocols for bacterial ELP expression and purification via inverse temperature cycling, as well as their covalent functionalization with fluorescent dyes. Furthermore, this report describes a protocol to enable the transcription of RNA aptamer dBroccoli inside ELP vesicles as a less complex example for a biochemical reaction. Finally, a protocol is provided, which allows in vesiculo expression of fluorescent proteins and the membrane peptide, whereas synthesis of the latter results in vesicle growth.

Presented here are protocols for the creation of peptide-based small unilamellar vesicles capable of growth. To facilitate in vesiculo production of the membrane peptide, these vesicles are equipped with a transcription-translation system and the peptide-encoding plasmid.

자율 적인 소포 성장을 위한 펩티드 멤브레인 전구체의 베시큘로 합성

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These issues represent drawbacks in workflows that can ultimately result in irreproducibility of research findings. Manual-based workflows are further limiting the advancement and widespread adoption of viscous materials, such as hydrogels used for biomedical applications. These challenges can be overcome by using automated workflows with standardized mixing processes to increase reproducibility. In this study, we present step-by-step instructions to use an open source protocol designer, to operate an open source workstation, and to identify reproducible mixtures. Specifically, the open source protocol designer guides the user through the experimental parameter selection and generates a ready-to-use protocol code to operate the workstation. This workstation is optimized for pipetting of viscous materials to enable automated and highly reliable handling by the integration of temperature docks for thermoresponsive materials, positive displacement pipettes for viscous materials, and an optional tip touch dock to remove excess material from the pipette tip. The validation and verification of mixtures are performed by a fast and inexpensive absorbance measurement of Orange G. This protocol presents results to obtain 80% (v/v) glycerol mixtures, a dilution series for gelatin methacryloyl (GelMA), and double network hydrogels of 5% (w/v) GelMA and 2% (w/v) alginate. A troubleshooting guide is included to support users with protocol adoption. The described workflow can be broadly applied to a number of viscous materials to generate user-defined concentrations in an automated fashion.

This protocol serves as a comprehensive tutorial for standardized and reproducible mixing of viscous materials with a novel open source automation technology. Detailed instructions are provided on the operation of a newly developed open source workstation, the usage of an open source protocol designer, and the validation and verification to identify reproducible mixtures.

하이드로겔 기반 3D 문화 모델을 자동화및 표준화방식으로 제조하는 오픈 소스 기술 플랫폼

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous developments have made the CFPS platform more accessible to new users and have expanded the range of applications. For lysate based CFPS systems, cell extracts can be generated from a variety of organisms, harnessing the unique biochemistry of that host to augment protein synthesis. Within the last 20 years, Escherichia coli (E. coli) has become one of the most widely used organisms for supporting CFPS due to its affordability and versatility. Despite numerous key advances, the workflow for E. coli cell extract preparation has remained a key bottleneck for new users to implement CFPS for their applications. The extract preparation workflow is time-intensive and requires technical expertise to achieve reproducible results. To overcome these barriers, we previously reported the development of a 24 hour cell-free autoinduction (CFAI) workflow that reduces user input and technical expertise required. The CFAI workflow minimizes the labor and technical skill required to generate cell extracts while also increasing the total quantities of cell extracts obtained. Here we describe that workflow in a step-by-step manner to improve access and support the broad implementation of E. coli based CFPS.

This work describes the preparation of cell extract from Escherichia coli (E. coli) followed by cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in under 24 hours. Explanation of the cell-free autoinduction (CFAI) protocol details improvements made to reduce researcher oversight and increase quantities of cell extract obtained.