Los autores desean agradecer la financiación parcial del Proyecto de Investigación FP7 NAMDIATREAM Europea (NMP4-LA-2.010-246479, http://www.namdiatream.eu) y el proyecto INTERREG IV Francia-Suiza NAOMI.

1. Cultura y Ampliación de ESC Humano <ol><li> Preparar el medio de propagación de células (llamado PM) que contiene Knockout DMEM suplementado con 20% suero Knockout, 1% MEM ácidos no esencial amino, 1% de L-glutamina 200 mM, 1% de penicilina-estreptomicina, y 3,5 l β-mercaptoetanol. </li><li> Descongelar ESC humana (células madre) en 8 ml de medio PM y los centrifugar 5 min a 115 xg para descartar medio de congelación DMSO-complementado. </li><li> Añadir 1 ml de PM medio que contiene 10 mM de inhibidor de la roca para evitar la apoptosis y mejorar la supervivencia celular tras la descongelación (sólo 24 h de incubación). </li><li> Añadir el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) a la PM en la concentración deseada (4-10 ng / ml) para el mantenimiento de la pluripotencia. </li><li> Placa del hESC en humano irradiado prepucio células alimentadoras (γHFF) (Figura 1A), previamente se sembraron a una concentración de 2 x 10 4 células / cm 2. </li><li> Cambie medio diario y, cuando sea necesario, eliminar partes de colonies empezando a diferenciarse por aspiración mediante un reducido drásticamente pipeta Pasteur alargada. </li><li> Una vez a la semana, las colonias de paso por vía enzimática: <ol><li> Retire medio y lavar las colonias con 2 ml de PBS. </li><li> Retirar PBS y se incuban con 0,5 ml por pocillo de la colagenasa IV caliente a 1 mg / ml durante 10 min a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Recoge fragmentos de colonias en 2 ml nuevo PM y centrifugar a 115 xg durante 3 min. </li></ol></li><li> Alternativamente, las colonias pueden ser pasados ​​mecánicamente por raspado: <ol><li> Retire medio y lavar las colonias con 2 ml de PBS. </li><li> Raspar manualmente colonias utilizando la herramienta rascador rodillo StemPro EZPassage (Figura 1B). </li><li> Recoger fragmentos de colonias y centrifugar a continuación durante 3 minutos a 115 xg para eliminar el sobrenadante. </li><li> Fragmentos de placas de γHFF o a procesar para la diferenciación en cuerpos embrionarios (EBS). </li></ol></li></ol> 2. Diferenciación ESC HumanoProtocolo <ol><li> Preparar el medio de diferenciación (DM) utilizando Knockout DMEM suplementado con 2% de suero Hyclone, 1,0% MEM ácidos no esencial amino, 1,0% de L-glutamina 200 mM, 1% de penicilina-estreptomicina, 3,5 l β-mercaptoetanol. </li><li> Retire medio y lavar las colonias con 2 ml de PBS. </li><li> EB formación de fragmentos de colonias en suspensión: <ol><li> Retirar PBS y se incuban con 0,5 ml por pocillo de la colagenasa IV caliente a 1 mg / ml durante 10 min a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Recoge fragmentos de colonias en 2 ml nueva DM y centrifugar a 115 xg durante 3 min. </li><li> Cultura en suspensión en ultra bajo apego placas de 6 pocillos (2 ml por pocillo) durante 4 días (Figura 1C). </li><li> Recoger y placa EBS recién formadas en 0,1% gelatina revestido placas de 24 pocillos (aproximadamente 3 EB / pocillo) (Figura 1D). </li></ol></li><li> Alternativamente, la agregación de células individuales forzado a EBS utilizando la placa de Aggrewell: <ol><li> Retirar PBS ydisociar colonias en células individuales utilizando Accutase (0,5 ml / pocillo). </li><li> Centrífuga y volver a suspender las células en DM a 1,2 x 10 6 / ml. </li><li> Añadir 2 ml por cámara Aggrewell por 1 días (Figura 1B &#39;). </li><li> Recoger EBS recién formados (Figura 1C &#39;) y la placa de ellas en 0,1% gelatina revestido placas de 24 pocillos (aproximadamente 3 EB / pocillo). </li><li> Cambie DM cada 2-3 días hasta la aparición de vencer a los grupos de los cardiomiocitos (15-30 días). </li></ol></li></ol> 3. Aire-líquido Culturas 3D de Vencer Clusters y etiquetado con HNPs <ol><li> Identificar y analizar manualmente los racimos de batiendo cardiomiocitos (Figura 1D), normalmente aparece después de 2-4 semanas de cultivo, utilizando un reducido drásticamente pipeta Pasteur alargada. </li><li> Depósito 4 filtros de PTFE por plaquita que se pondrán en una placa de 6 pocillos (Figura 1F). </li><li> Añadir 1 ml de medio de DM en la parte superior de each también. </li><li> Añadir un racimo diseccionado batiendo en cada filtro PTFE (Figura 1 E), máximo 4/well, es decir, 24 agregados por placa (Figura 1 F &#39;). </li><li> Cambie medio DM cada 2-3 días. </li><li> Para etiquetar los clusters, retire el filtro de PTFE que contiene el cluster paliza y lo puso en 3,5 cm plato de vidrio inferior (170 m de espesor). </li><li> Añadir 1 ml de PNH a una concentración de 50 mg / ml para 30 min. </li></ol> 4. Optico y no lineal <ol><li> Preparación de la muestra. Después del marcaje HNP (ver Paso 3.6), traslado, ya sea enteros diferenciadores HEBS primeros o clusters paliza cardiaca (disecados en apariencia contracción) en los filtros de PTFE sobre una gruesa placa de 170 m con fondo de cristal compatible con la distancia de trabajo de altos objetivos numéricos de apertura. Por otra parte, aplicar un recubrimiento directo de vencer grupos para el plato de fondo de vidrio recubierto previamente con 0,1% de gelatina. </li><li> Transferir las muestras a untodo-en-uno microscopio equipado con incubando cámara de garantizar una temperatura estable, humedad y CO de control 2 durante períodos de tiempo prolongados. </li><li> Después de la inspección inicial, la imagen de la muestra a través de imágenes de campo amplio con iluminación de luz blanca para identificar estructuras de interés dentro de EBS diferenciados o clusters paliza activos que serán seleccionados para futuras investigaciones. </li><li> Si la autofluorescencia celular desde el NADH y SH de HNPs tienen que ser adquirida de forma simultánea, establecer una longitud de onda de excitación de láser más corto (es decir, 720 nm) para que coincida con la absorción molecular. Utilice un filtro de paso de banda espectral estrecha centrada en la mitad de la longitud de onda de excitación (es decir, λ = 360 ± 10 nm) para detectar SH, y otro para la detección de la autofluorescencia. </li><li> En primer lugar realizar una baja resolución rápida, escaneo tridimensional para reconstruir la morfología general de la agrupación cardiaca y seleccione un plano de imagen dentro del volumen de cluster con varios HNP visibles. </li><li> Si es necesario, cambie la longitud de onda de excitación libremente para adaptarse mejor a las propiedades ópticas de la muestra o para evitar photobleaching, el daño por luz y la imagen más profunda en los tejidos con una longitud de onda de infrarrojos (es decir, 790 nm) y vuelva a colocar el segundo filtro de armónicos en consecuencia (es decir, 395 nm ). Optimizar los ajustes del pulso de láser de pre-compresor a la longitud de onda de trabajo de elección mediante la maximización de la segunda señal armónica de HNPs depositados en la muestra. </li><li> Para controlar en tiempo real las contracciones cardíacas de racimo, establecer el escáner óptico microscopio en el modo más rápido, tales como modo de resonancia, lo que permite la adquisición de alta velocidad de imágenes de dos dimensiones. </li><li> Elija los ajustes que mejor compromiso entre el contraste de la imagen y la velocidad de adquisición, tales como: <ul type="disc"><li> Promediado Scan: 4 </li><li> Píxel tiempo de espera: 0,1 microsegundos </li><li> Tasa de imagen: 3,75 fotogramas por segundo (fps) </li></ul></li><li> Potencia del láser se ajusta de acuerdo a la mancha focal sIze y velocidad de exploración. 50 mW (medido en la entrada del objetivo) es un valor típico para 0,1 microsegundos píxel tiempo de permanencia y el Plan de APO 20X NA 0,75 objetivo preservar la viabilidad celular. </li></ol> 5. Análisis de Imágenes <ol><li> Procedimiento de calibración Axial. Seleccione un solo HNP depositado sobre un sustrato desnudo. Ajuste el enfoque (es decir, la posición axial de la nanopartícula) para maximizar la intensidad SH. Varían de forma controlada la posición axial de la platina del microscopio para obtener la curva de calibración correspondiente a la intensidad de SH como una función de la PNH desplazamiento desde el plano focal. La salida de este procedimiento de calibración para el Plan de APO 20X NA 0,75 objetivo se informó en la Figura 4C. </li><li> Seleccione HNPs presentes en todos los fotogramas de vídeo y determinar sus movimientos periódicos. Este procedimiento puede automatizarse fácilmente, por ejemplo mediante un código personalizado en busca de manchas máxima de la señal de intensidad en una región de interés definida yconectándolos entre diferentes marcos (un código de ejemplo escrito en Matlab R2009 b utilizando la función &#39;props&#39; región de la caja de herramientas de procesamiento de imágenes se presenta). </li><li> Evaluar la cuantificación de los desplazamientos fuera del plano, asociados con HNPs no trazables continuamente en movimiento a lo largo del eje óptico, mediante la conversión de sus modulaciones de intensidad a lo largo de diferentes marcos en desplazamiento axial usando la curva de calibración establecida en el paso 5.1. Tenga en cuenta que este procedimiento da acceso a movimientos axiales, pero no se puede utilizar para determinar la dirección absoluta (hacia arriba o hacia abajo). </li></ol>

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	<li>Bonacina, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+Fe(IO3)3+nanocrystals+as+local+probes+for+nonlinear+microscopy.">Polar Fe(IO3)3 nanocrystals as local probes for nonlinear microscopy.</a> Applied Physics B-Lasers and Optics. 87, 399-403 (2007).</li><li>Nakayama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+nanowire+nonlinear+optical+probe.">Tunable nanowire nonlinear optical probe.</a> Nature. 447, 1098-1101 (2007).</li><li>Aufray, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Synthesis+of+Nanosized+Niobium+Oxides+and+Lithium+Niobate+Particles+and+Their+Characterization+by+XPS+Analysis.">New Synthesis of Nanosized Niobium Oxides and Lithium Niobate Particles and Their Characterization by XPS Analysis.</a> J Nanosci Nanotechno. 9, 4780-4785 (2009).</li><li>Hsieh, C. L., Grange, R., Pu, Y., Psaltis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+harmonic+holographic+microcopy+using+nanoparticles+as+probes+for+cell+imaging.">Three-dimensional harmonic holographic microcopy using nanoparticles as probes for cell imaging.</a> Opt Express. 17, 2880-2891 (2009).</li><li>Pantazis, P., Maloney, J., Wu, D., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+harmonic+generating+(SHG)+nanoprobes+for+in+vivo+imaging.">Second harmonic generating (SHG) nanoprobes for in vivo imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14535-14540 (2010).</li><li>Baumner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evanescent-field-induced+second+harmonic+generation+by+noncentrosymmetric+nanoparticles.">Evanescent-field-induced second harmonic generation by noncentrosymmetric nanoparticles.</a> Opt Express. 18, 23218-23225 (2010).</li><li>Le Xuan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostable+second-harmonic+generation+from+a+single+KTiOPO4+nanocrystal+for+nonlinear+microscopy.">Photostable second-harmonic generation from a single KTiOPO4 nanocrystal for nonlinear microscopy.</a> Small. 4, 1332-1336 (2008).</li><li>Sandeau, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defocused+imaging+of+second+harmonic+generation+from+a+single+nanocrystal.">Defocused imaging of second harmonic generation from a single nanocrystal.</a> Opt Express. 15, 16051-16060 (2007).</li><li>Johnson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-field+imaging+of+nonlinear+optical+mixing+in+single+zinc+oxide+nanowires.">Near-field imaging of nonlinear optical mixing in single zinc oxide nanowires.</a> Nano Lett. 2, 279-283 (2002).</li><li>Kachynski, A. V., Kuzmin, A. N., Nyk, M., Roy, I., Prasad, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+oxide+nanocrystals+for+nonresonant+nonlinear+optical+microscopy+in+biology+and+medicine.">Zinc oxide nanocrystals for nonresonant nonlinear optical microscopy in biology and medicine.</a> J Phys Chem C. 112, 10721-10724 (2008).</li><li>Bonacina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+Nanomedecine:+Harmonic+Nanoparticles+toward+Targeted+Diagnosis+and+Therapy.">Nonlinear Nanomedecine: Harmonic Nanoparticles toward Targeted Diagnosis and Therapy.</a> Mol Pharmaceut. 10, 783-792 (2013).</li><li>Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHG+nanoprobes:+advancing+harmonic+imaging+in+biology.">SHG nanoprobes: advancing harmonic imaging in biology.</a> Bioessays. 34, 351-360 (2012).</li><li>Campagnola, P. J., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-harmonic+imaging+microscopy+for+visualizing+biomolecular+arrays+in+cells,+tissues+and+organisms.">Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms.</a> Nat Biotechnol. 21, 1356-1360 (2003).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Photon+Laser+Scanning+Fluorescence+Microscopy.">2-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li><li>Magouroux, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed+Tracking+of+Murine+Cardiac+Stem+Cells+by+Harmonic+Nanodoublers.">High-Speed Tracking of Murine Cardiac Stem Cells by Harmonic Nanodoublers.</a> Small. 8, 2752-2756 (2012).</li><li>Staedler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonic+Nanocrystals+for+Biolabeling:+A+Survey+of+Optical+Properties+and+Biocompatibility.">Harmonic Nanocrystals for Biolabeling: A Survey of Optical Properties and Biocompatibility.</a> Acs Nano. 6, 2542-2549 (2012).</li><li>Extermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodoublers+as+deep+imaging+markers+for+multi-photon+microscopy.">Nanodoublers as deep imaging markers for multi-photon microscopy.</a> Optics Express. 17, 15342-15349 (2009).</li><li>Chen, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wavelength+dependent+damage+in+biological+multi-photon+confocal+microscopy:+A+micro-spectroscopic+comparison+between+femtosecond+Ti+:+sapphire+and+Cr+:+forsterite+laser+sources.">Wavelength dependent damage in biological multi-photon confocal microscopy: A micro-spectroscopic comparison between femtosecond Ti : sapphire and Cr : forsterite laser sources.</a> Opt. Quantum Electron. 34, 1251-1266 (2002).</li><li>Ferreira, L., Karp, J. M., Nobre, L., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+opportunities:+The+use+of+Nanotechnologies+to+manipulate+and+track+stem+cells.">New opportunities: The use of Nanotechnologies to manipulate and track stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 136-146 (2008).</li><li>Kaur, S., Singhal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+nano+meets+stem:+The+impact+of+nanotechnology+in+stem+cell+biology.">When nano meets stem: The impact of nanotechnology in stem cell biology.</a> J Biosci Bioeng. 113, 1-4 (2012).</li><li>Hong, H., Yang, Y. N., Zhang, Y., Cai, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Invasive+Imaging+of+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Non-Invasive Imaging of Human Embryonic Stem Cells.</a> Curr Pharm Biotechno. 11, 685-692 (2010).</li><li>Tumbar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+epithelial+stem+cell+niche+in+skin.">Defining the epithelial stem cell niche in skin.</a> Science. 303, 359-363 (2004).</li><li>Shah, B. S., Clark, P. A., Moioli, E. K., Stroscio, M. A., Mao, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+mesenchymal+stem+cells+by+bioconjugated+quantum+dots.">Labeling of mesenchymal stem cells by bioconjugated quantum dots.</a> Nano Lett. 7, 3071-3079 (2007).</li><li>Zimmer, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+series+of+small+indium+arsenide-zinc+selenide+core-shell+nanocrystals+and+their+application+to+in+vivo+imaging.">Size series of small indium arsenide-zinc selenide core-shell nanocrystals and their application to in vivo imaging.</a> J Am Chem Soc. 128, 2526-2527 (2006).</li><li>Vallee, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-based+cardiopatches+improve+cardiac+function+in+infarcted+rats.">Embryonic stem cell-based cardiopatches improve cardiac function in infarcted rats.</a> Stem Cells Transl Med. 1, 248-260 (2012).</li><li>Idris, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+transplanted+cells+in+live+animal+using+upconversion+fluorescent+nanoparticles.">Tracking transplanted cells in live animal using upconversion fluorescent nanoparticles.</a> Biomaterials. 30, 5104-5113 (2009).</li><li>Haase, M., Schafer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upconverting+nanoparticles.">Upconverting nanoparticles.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 50, 5808-5829 (2011).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+Upconversion+Nanoparticles+for+Dual-Modal+Imaging-Guided+Stem+Cell+Therapy+under+Remote+Magnetic+Control.">Multifunctional Upconversion Nanoparticles for Dual-Modal Imaging-Guided Stem Cell Therapy under Remote Magnetic Control.</a> Adv Funct Mater. 23, 272-280 (2013).</li><li>Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+response+to+near-infrared+femtosecond+laser+pulses+in+two-photon+microscopes.">Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two-photon microscopes.</a> Optics Letters. 22, 135-136 (1997).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La aplicación de la nanotecnología a la investigación con células madre es una disciplina relativamente nueva, pero en rápida expansión campo. Como se ha señalado por varios artículos de revisión sobre el tema, el uso de nanopartículas se puede aplicar para llevar a cabo diferentes tareas de investigación, que van desde celular de seguimiento (tanto in vitro como in vivo), para el suministro intracelular de proteínas y genes, no menos importante la creación de entornos celulares biomiméti...

Sistemas de microscopía no lineal, gracias a sus tres capacidades de seccionamiento dimensionales inherentes, han provocado cada vez más la demanda de fluoróforos foto-estable con bandas de absorción de dos fotones del infrarrojo cercano. Sólo en el último par de años, para complementar el desarrollo de etiquetas basadas en la fluorescencia (colorantes, puntos cuánticos, up-conversión de nanopartículas), una metodología diferente de imágenes ha estado explotando el uso de una nueva familia de nanopartículas inherentemente no lineales como etiquetas, es decir, nanopartículas de armónicos (HNPs) que se han desarrollado específicamente para la microscopía de múltiples fotones. Estas etiquetas, basadas en cristales noncentrosymmetric inorgánicos, ejercen contraste óptico que genera el SH de la frecuencia de excitación, por ejemplo mediante la conversión de una fracción de la luz cercana al infrarrojo excitación pulsada (λ = 800 nm) en luz azul visible (λ / 2 = 400 nm) . Varios autores en los últimos años han probado diferentes materiales, incluyendo yodato de hierro Fe (IO <sub&gt; 3) 3 1, niobato de potasio (KNbO 3) 2, niobato de litio (LiNbO 3) 3, titanato de bario (BaTiO3) 4,5, fosfato de potasio titanilo (KTiOPO4, KTP) 6-8, y óxido de zinc (ZnO ) 5,9,10. En comparación con las sondas fluorescentes, HNPs poseen una serie de propiedades atractivas, tales como la ausencia completa de blanqueo y parpadear, bandas de emisión estrechas, capacidad de ajuste de excitación de longitud de onda (desde el ultravioleta al infrarrojo), la capacidad de recuperación de la orientación, y la respuesta óptica coherente. Estas propiedades únicas se han explicado recientemente en dos artículos de revisión exhaustivos 11,12. La posibilidad de trabajar en la región espectral infrarroja, que aumenta la profundidad de formación de imágenes, reduciendo al mínimo la dispersión y absorción, también limita drásticamente la degradación foto de la muestra 13,14. Por otra parte, la señal de la foto estables infinitamente garantizada por HNPs los convierte en ideales para las sondas de rastreo celular a largo plazo, que is especialmente atractivo para aplicaciones de medicina regenerativa 15. En este experimento se visualizó, detalles del protocolo se proporcionan para marcaje in vitro de las células madre embrionarias humanas (CMEH) con HNPs no funcionalizados. La síntesis y preparación de suspensiones coloidales se detalla en una publicación anterior, y en las referencias allí 16 y está más allá del alcance de este trabajo. Se presentan metodologías para la investigación de células madre mediante microscopía multi-fotón y su diferenciación en grupos cardíacos (mantenidas como cultivos al aire líquido a largo plazo). ESC humana se puede dejar para diferenciar dentro de los llamados cuerpos embrioides (EBS) en dos formas diferentes, ya sea por la formación de EB de fragmentos de colonias en suspensión o, alternativamente, la agregación de células individuales en EBS utilizando la placa de Aggrewell forzados, como se ilustra en la Figura 1A . El cultivo de vencer a grupos de células cardiacas en politetrafluoroetileno (PTFE) filtros porosos FACilitates su mantenimiento a largo plazo para estudios posteriores (por ejemplo, las mediciones electrofisiológicas de los potenciales de acción). La fuente de excitación de la microscopio de barrido debe ser capaz de entregar pulsos ultracortos (con una duración de pulso menor que 300 fs a la muestra) a fin de alcanzar la potencia de pico necesaria para realizar la imagen con segundo armónico de HNPs. Por ejemplo, el fs-fuente más común utilizado para la formación de imágenes son sintonizables Ti: láseres de zafiro. Alternativamente, otros láseres ultrarrápidos pueden emplearse, por ejemplo iones de erbio 17, forsterita cromo 18 o Ti: zafiro bombeado infrarrojos osciladores paramétricos ópticos. El microscopio puede estar equipado con un objetivo con una apertura numérica preferentemente bastante alto. Muy importante, antes de las medidas, y cada vez que el objetivo se sustituye, es obligatorio para reducir al mínimo la dispersión presente en el set-up (lentes) mediante la optimización de la configuración de la pulso de láser pre-compresor en el trabajolongitud de onda de la elección. Este procedimiento, se detalla en el protocolo, se asegura de que el pulso de láser es tan cerca como sea posible a la transformación duración limitada (es decir, más corta como sea posible) en el plano focal y maximiza la respuesta de muestra no lineal. El objetivo del análisis de la imagen se describe al final del protocolo es identificar y realizar un seguimiento de los movimientos en 3D HNPs asociados con las contracciones rítmicas de vencer grupos cardíacas. Nanopartículas de seguimiento en el plano de la imagen es simplemente dieron cuenta mediante la identificación de sus posiciones en los sucesivos fotogramas de película. Para extraer información sobre el movimiento axial, una calibración previa de la respuesta no lineal de intensidad como una función del desplazamiento axial es obligatorio. Tenga en cuenta que para las mediciones a largo plazo, un control interferométrico activa de la posición axial de la muestra se requiere para mantener la validez de la curva de calibración, en presencia de derivas térmicas y / o mecánicos. Los HNPs utilizados aquí para traccélulas e latiendo dentro de los agregados están basados ​​en óxido de niobato de potasio (KNbO 3), pero otros nanomateriales no lineales disponibles son revisados ​​en detalle en la obra de Staedler et al 16. Las eficiencias ópticas no lineales de la mayoría de los nanomateriales investigadas hasta ahora son muy comparables. La elección de KNbO 3 fue motivado esencialmente por la buena estabilidad de la solución coloidal y su buena biocompatibilidad, probado en varias líneas celulares humanas incluso en concentración bastante alta y tiempos de exposición largos 16. Dada la novedad del nanomaterial empleado para este trabajo, las principales características de HNPs en comparación con / luminiscentes bio-marcadores fluorescentes se muestran en un vídeo de animación de ordenador original corto realizado por los autores.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1008">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
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	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Microscope Incubator</td>
			<td style="width:231px;">OKO LAB</td>
			<td style="width:205px;">UNO package (top stage)</td>
			<td style="width:343px;">&#160;37&#176;C, 5% CO2, moisturized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="2" style="height:64px;width:231px;">Multiphoton microscope</td>
			<td rowspan="2" style="width:231px;">Nikon</td>
			<td rowspan="2" style="width:205px;">AR1-MP</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:343px;">Fast scanning, four non photomultiplier descanned detectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="3" style="height:64px;width:231px;">Filters SHG and autofluorescence</td>
			<td rowspan="3" style="width:231px;">Semrock</td>
			<td style="width:205px;">FF01-360/12-25</td>
			<td rowspan="3" style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">FF01-395/11-25&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:205px;">FF02-485/20-25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="3" style="height:64px;width:231px;">Microscope objectives</td>
			<td rowspan="3" style="width:231px;">Nikon</td>
			<td style="width:205px;">CFI Plan Fluor 10x</td>
			<td style="width:343px;">NA 0.30, WD 16 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">CFI Plan Apo 20x</td>
			<td style="width:343px;">NA 0.75, WD 1.0 mm, VC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:205px;">CFI Apo 40x</td>
			<td style="width:343px;">NA 1.25, WD 0.18mm &#955;S, Nano-Crystal Coat</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:231px;">Rhock inhibitor&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Sigma</td>
			<td style="width:205px;">Y-27632</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:231px;">Knockout DMEM</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">10829</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Knockout Serum&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">10828</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">MEM Non-Essential Amino Acids&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">1140</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">L-glutamine 200mM&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">25030</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">15140</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">&#946;-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Sigma</td>
			<td style="width:205px;">M7522</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Collagenase IV&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:205px;">17104-019</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Roller scraper tool&#160;</td>
			<td style="width:231px;">StemPro EZPassage, Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">23181-010</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">StemPro Accutase&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:205px;">S11105-01</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Aggrewell system&#160;</td>
			<td style="width:231px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:205px;">27845</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Hyclone serum&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:205px;">SH30070.03</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Gelatin</td>
			<td style="width:231px;">Sigma</td>
			<td style="width:205px;">G9391</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">6-well plates&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Falcon</td>
			<td style="width:205px;">353046</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">24-well plates&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Nunclon</td>
			<td style="width:205px;">142475</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:231px;">Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters</td>
			<td style="width:231px;">Millipore&#160;</td>
			<td style="width:205px;">NA76/25</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Inserts</td>
			<td style="width:231px;">Millipore</td>
			<td style="width:205px;">PICM03050</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harmonic nanoparticles for regenerative research

En este experimento se visualizó, detalles del protocolo se proporcionan para marcaje in vitro de las células madre embrionarias humanas (CMEH) con nanopartículas de generación de armónicos segundo (HNPs). Estos últimos son una nueva familia de sondas introducidas recientemente para el etiquetado de las muestras biológicas para imágenes multi-fotón. HNPs son capaces de duplicar la frecuencia de la luz de excitación por el proceso óptico no lineal de generación de segundo armónico sin restricciones en la longitud de onda de excitación. Multi-fotón metodologías para la diferenciación de células madre en grupos cardíacos (mantenidas como cultivos al aire líquido a largo plazo) en base se presentan en detalle. En particular, se muestra evidencia sobre cómo aprovechar al máximo el segundo armónico (SH) de emisión intensa de HNPs aisladas durante el control 3D de golpear el tejido cardíaco en 3D. El análisis de las imágenes resultantes para recuperar los patrones de desplazamiento en 3D también se detalla.

Antes de la evaluación de la actividad latidos por imagen confocal, se realizó una caracterización cuidadosa de la respuesta óptica no lineal de los filtros de PTFE, ya sea solo o en presencia de HNPs a alta concentración (1 mg / ml). Se aseguró de que: i) el sustrato desnudo de dos fotones de fluorescencia excitada es muy débil y no puede evitar que la medición de las muestras biológicas pertinentes, y ii) la emisión SH a partir de HNPs aislados puede ser fácilmente adquirido por formación de imágenes a tr...

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Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Detalles del Protocolo se proporcionan para etiquetado células embrionarias humanas in vitro madre con segunda nanopartículas que generan armónicos. También se presentan metodologías para la investigación de células madre mediante microscopía multi-fotón y su diferenciación en grupos cardíacas.

Armónica Nanopartículas para Regenerativa de Investigación

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.2K vistas.  University of Geneva.  Detalles del Protocolo se proporcionan para etiquetado células embrionarias humanas in vitro madre con segunda nanopartículas que generan armónicos. También se presentan metodologías para la investigación de células madre mediante microscopía multi-fotón y su diferenciación en grupos cardíacas. 

Video: Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively for tissue regeneration, a number of variables must be taken into account. These variables include: the total volume and surface area of the implantation site, the mechanical properties of the tissue and the tissue microenvironment, which includes the amount of vascularization and the components of the extracellular matrix. Therefore, the materials being used to deliver these cells must be biocompatible with a defined chemical composition while maintaining a mechanical strength that mimics the host tissue. These materials must also be permeable to oxygen and nutrients to provide a favorable microenvironment for cells to attach and proliferate. Chitosan, a cationic polysaccharide with excellent biocompatibility, can be easily chemically modified and has a high affinity to bind with in vivo macromolecules4-5. Chitosan mimics the glycosaminoglycan portion of the extracellular matrix, enabling it to function as a substrate for cell adhesion, migration and proliferation. In this study we utilize chitosan in the form of microspheres to deliver adipose-derived stem cells (ASC) into a collagen based three-dimensional scaffold6. An ideal cell-to-microsphere ratio was determined with respect to incubation time and cell density to achieve maximum number of cells that could be loaded. Once ASC are seeded onto the chitosan microspheres (CSM), they are embedded in a collagen scaffold and can be maintained in culture for extended periods. In summary, this study provides a method to precisely deliver stem cells within a three dimensional biomaterial scaffold.

A major hurdle in current stem cell therapies is determining the most effective method to deliver these cells to host tissues. Here, we describe a chitosan-based delivery method that is efficient and simple in approach, while allowing adipose-derived stem cells to maintain their multipotency.

La construcción de un hidrogel de colágeno para la entrega de la madre microesferas cargadas con células quitosano

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively ...

Investigación

Bioingeniería

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Las nanopartículas virales para<em&gt; En vivo</em&gt; Imágenes de tumores

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticles for Multimodal Molecular Imaging Applications

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, complementary imaging techniques. These imaging agents facilitate the real-time assessment of pathways and mechanisms in vivo, which enhance both diagnostic and therapeutic efficacy. This article presents the protocol for the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles (PB NPs) - a novel class of agents for use in multimodal, molecular imaging applications. The imaging modalities incorporated in the nanoparticles, fluorescence imaging and magnetic resonance imaging (MRI), have complementary features. The PB NPs possess a core-shell design where gadolinium and manganese ions incorporated within the interstitial spaces of the PB lattice generate MRI contrast, both in T1 and T2-weighted sequences. The PB NPs are coated with fluorescent avidin using electrostatic self-assembly, which enables fluorescence imaging. The avidin-coated nanoparticles are modified with biotinylated ligands that confer molecular targeting capabilities to the nanoparticles. The stability and toxicity of the nanoparticles are measured, as well as their MRI relaxivities. The multimodal, molecular imaging capabilities of these biofunctionalized PB NPs are then demonstrated by using them for fluorescence imaging and molecular MRI in vitro.

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

Biofuncionalizadas prusiana nanopartículas azul para Multimodal Molecular Aplicaciones de imágenes

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Sólido lípidos nanopartículas (GLC) Aplicaciones para intracelular de focalización

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Correlativa a la luz y microscopía electrónica de Uso de Quantum Dot nanopartículas

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.2. Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart3. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact4. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

In these studies, we provide methodology for novel, neonatal, murine cardiac scaffolds for use in regenerative studies.

Los andamios neonatal cardíaca: Matrices novedosos para Estudios regenerativos

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

Producción de nanopartículas metálicas por ablación por láser pulsado en líquidos: una herramienta para estudiar las propiedades antibacterianas de las nanopartículas

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

20 mJ, 1 ps Yb:YAG Thin-disk Regenerative Amplifier

This is a report on a 100 W, 20 mJ, 1 ps Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier. A homemade Yb:YAG thin-disk, Kerr-lens mode-locked oscillator with turn-key performance and microjoule-level pulse energy is used to seed the regenerative chirped-pulse amplifier. The amplifier is placed in airtight housing. It operates at room temperature and exhibits stable operation at a 5 kHz repetition rate, with a pulse-to-pulse stability less than 1%. By employing a 1.5 mm-thick beta barium borate crystal, the frequency of the laser output is doubled to 515 nm, with an average power of 70 W, which corresponds to an optical-to-optical efficiency of 70%. This superior performance makes the system an attractive pump source for optical parametric chirped-pulse amplifiers in the near-infrared and mid-infrared spectral range. Combining the turn-key performance and the superior stability of the regenerative amplifier, the system facilitates the generation of a broadband, CEP-stable seed. Providing the seed and pump of the optical parametric chirped-pulse amplification (OPCPA) from one laser source eliminates the demand of active temporal synchronization between these pulses. This work presents a detailed guide to set up and operate a Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier, based on chirped-pulse amplification (CPA), as a pump source for an optical parametric chirped-pulse amplifier.

A protocol for the operation of a high-energy, high-power optical parametric chirped pulse amplifier pump source based on an Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier is presented here.

20 mJ, 1 ps Yb: YAG amplificador regenerativo de disco delgado

This is a report on a 100 W, 20 mJ, 1 ps Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier. A homemade Yb:YAG thin-disk, Kerr-lens mode-locked oscillator with ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

Microtissues 3D para la terapia regenerativa inyectable y drogas de alto rendimiento

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation purposes. The process to generate such tissues is complex, and includes an appropriate combination of specific cell types, scaffolds, and physical or biochemical stimuli to guide cell growth and differentiation. Microcarriers represent an appealing tool to expand cells in a three-dimensional (3D) microenvironment, since they provide higher surface-to volume ratios and mimic more closely the in vivo situation compared to traditional two-dimensional methods. The vascular system, supplying oxygen and nutrients to the cells and ensuring waste removal, constitutes an important building block when generating engineered tissues. In fact, most constructs fail after being implanted due to lacking vascular support. In this study, we present a protocol for endothelial cell expansion on recombinant collagen-based microcarriers under dynamic conditions in spinner flask and bioreactors, and we explain how to determine in this setting cell viability and functionality. In addition, we propose a method for cell delivery for vascularization purposes without additional detachment steps necessary. Furthermore, we provide a strategy to evaluate the cell vascularization potential in a perfusion bioreactor on a decellularized&#160;biological matrix. We believe that the use of the presented methods could lead to the development of new cell-based therapies for a large range of tissue engineering applications in the clinical practice.

We propose a cell expansion protocol on macroporous microcarriers and their use as delivery system in a perfusion bioreactor to seed a decellularized tissue matrix. We also include different techniques to determine cell proliferation and viability of cells cultured on microcarriers. Furthermore, we demonstrate functionality of cells after bioreactor cultures.