Yazarlar, Avrupa FP7 Araştırma Projesi NAMDIATREAM (NMP4-LA-2010-246479, http://www.namdiatream.eu) ve INTERREG IV Fransa-İsviçre NAOMI projeden kısmi fon kabul etmek istiyorum.

1.. Kültür ve İnsan ESC Genişleme <ol><li> Hazırlama Knockout DMEM ihtiva eden (PM olarak adlandırılır) hücre çoğalma ortamı içinde% 20 Knockout serumu,% 1 MEM gerekli olmayan amino asitler,% 1 L-glutamin, 200 mM,% 1 penisilin-streptomisin, ve 3.5 ul β-merkaptoetanol ile takviye edilmiştir. </li><li> 8 ml PM ortamda insan ESC (HESC) çözülme ve DMSO-desteklenmiş donma orta atmak için 115 xg&#39;de onları 5 dakika santrifüj. </li><li> (Sadece 24 saat enkübasyon) çözülmesi üzerine apoptozu önlemek ve hücre yaşamını geliştirmek için 10 mM Kaya inhibitörü içeren PM ortamın 1 ml ilave edilir. </li><li> Pluripotensin bakım için istenen konsantrasyonda (4-10 ng / ml) de PM, temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ilave edin. </li><li> Daha önce / cm 2 2 x 10 4 hücre konsantrasyonunda kaplama besleyici hücreler sünnet derisi ışınlanmış insan ile ilgili en hESC (γHFF) (Şekil 1A), Plate. </li><li> Gerektiğinde c kısımlarını kaldırmak, orta günlük değiştirin veolonies uzatılmış keskin kesmek Pasteur pipeti kullanarak aspirasyon ile ayırt başlıyor. </li><li> Enzimatik olarak bir hafta, pasaj koloniler kez: <ol><li> Ortamı çıkarın ve 2 ml PBS ile koloniler yıkayın. </li><li> PBS çıkarın ve 37 ° C,% 5 CO2 &#39;de 10 dakika boyunca 1 mg / ml&#39; de sıcak kollajenaz IV, oyuk başına 0.5 ml ile inkübe edin. </li><li> 2 ml 3 dakika boyunca 115 x g yeni PM ve santrifüj koloni parçaları toplayın. </li></ol></li><li> Seçenek olarak ise, koloniler kazınarak mekanik geçişli olabilir: <ol><li> Ortamı çıkarın ve 2 ml PBS ile koloniler yıkayın. </li><li> Elle StemPro EZPassage silindir kazıyıcı aracı (Şekil 1B) kullanarak koloniler kazıyın. </li><li> Koloni parçalarını toplamak ve süpernatant kaldırmak için 115 g&#39;de 3 dakika sonra santrifüj. </li><li> ΓHFF veya plaka fragmanları embriyoid organları (EBS) içine farklılaşması için onları süreci. </li></ol></li></ol> 2.. İnsan ESC FarklılaşmaProtokol <ol><li> Hazırlama Knockout DMEM kullanılarak farklılaşma ortamı (DM)% 2 Hyclone serumu,% 1.0 MEM gerekli olmayan amino asitler,% 1.0 L-glutamin, 200 mM,% 1 penisilin-streptomisin, 3.5 ul β-merkaptoetanol ile takviye edilmiştir. </li><li> Ortamı çıkarın ve 2 ml PBS ile koloniler yıkayın. </li><li> Süspansiyon içinde koloni parçalarının EB sistemi: <ol><li> PBS çıkarın ve 37 ° C,% 5 CO2 &#39;de 10 dakika boyunca 1 mg / ml&#39; de sıcak kollajenaz IV, oyuk başına 0.5 ml ile inkübe edin. </li><li> 2 ml 3 dakika boyunca 115 x g yeni DM ve santrifüj koloni parçaları toplayın. </li><li> 4 gün (Şekil 1C) için ultra-düşük eki 6 oyuklu plakalar (bölme başına 2 mi) içinde süspansiyon halinde kültür bunları. </li><li> Toplama ve% 0.1 jelatin kaplı 24 oyuklu plakalar (yaklaşık 3 EBS / oyuk) (Şekil 1D) ile ilgili en yeni oluşan EBS plaka. </li></ol></li><li> Seçenek olarak ise, Aggrewell plaka kullanılarak EBS içine tek hücrelerin toplanmasını zorunlu: <ol><li> Kaldırmak PBS veAccutase (0.5 ml / oyuk) kullanılarak bir hücre içine koloniler ayrışır. </li><li> 1,2 x 10 6 / ml DM Santrifüj ve tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> 1 gün (Şekil 1B &#39;) için Aggrewell odasının başına 2 ml ekleyin. </li><li> Yeni oluşan EBS (Şekil 1C &#39;) toplamak ve% 0.1 jelatin kaplı 24 oyuklu plakalar (yaklaşık 3 EBS / oyuk) bunları plaka. </li><li> Kardiyomiyositler (15-30 gün) kümeleri dayak görünümünü kadar her 2-3 gün DM değiştirin. </li></ol></li></ol> HNPs ile Kümeler ve Etiketleme yenmek 3. Hava-sıvı 3D Kültürler <ol><li> Tanımlamak ve el normal bir uzun keskin kesmek Pasteur pipeti kullanarak, kültür 2-4 hafta sonra ortaya çıkan, dayak kardiyomiyositler (Şekil 1D) kümeleri teşrih. </li><li> 6 oyuklu plaka (Şekil 1F) üzerine yerleştirileceği uç başına Deposit 4 PTFE filtresi. </li><li> EAC üstüne DM ortamı 1 ml ekleyinh iyi. </li><li> Her PTFE filtre (Şekil 1E) tek disseke yenerek küme, maksimum 4/well, plaka (Şekil 1F &#39;) başına yani 24 agrega ekleyin. </li><li> 2-3 günde DM orta değiştirin. </li><li> Kümeleri etiketlemek için, (170 mikron kalınlığında) dayak kümesini içeren PTFE filtreyi kaldırmak ve 3.5 cm cam alt çanak üzerine koydu. </li><li> 30 dakika boyunca 50 ug / ml &#39;lik bir konsantrasyonda HNP 1 ml ilave edilir. </li></ol> 4. Non-Lineer Optik Görüntüleme <ol><li> Örnek hazırlama. HNP etiketleme (Adım 3.6), yüksek sayısal açıklık hedeflerinin çalışma mesafesi ile uyumlu bir 170 mikron kalınlığında cam alt çanak üzerindeki teflon filtreler üzerinde tam ayırt erken hEBs veya (kasılma görünüm üzerine disseke) kalp atış kümeleri ya aktardıktan sonra. Seçenek olarak ise, cam alt çanak% 0.1 jelatin ile ön-kaplanmış kümeler dayak doğrudan bir kaplama uygulanır. </li><li> Bir transfer örnekleriall-in-one sabit sıcaklık, nem ve uzun süre üzerinde CO 2 kontrolü sağlamak odasına kuluçka ile donatılmış mikroskop. </li><li> İlk muayene, görüntü sonra beyaz ışık aydınlatma altında geniş alan görüntüleme yoluyla numune ileri tetkikler için seçilmiş olacaktır farklılaşmış EBS veya aktif dayak kümeleri içinde ilgi yapılarını belirlemek için. </li><li> Hücre NADH otofloresans ve HNPs SH eş zamanlı olarak elde edilmesi varsa, moleküler emilimini maç için kısa bir lazer dalgaboyu (yani 720 nm) ayarlanır. Yarım dalgaboyu merkezli bir dar bant geçiren spektral filtre kullanın (örneğin, λ = 360 ± 10 nm) SH tespit etmek ve başka bir otoflüoresanı algılamak için. </li><li> Öncelikle kalp kümenin genel morfolojisini yeniden ve birkaç görünür HNP ile küme hacmi içinde bir görüntü düzlem seçmek için hızlı, düşük çözünürlüklü, üç boyutlu tarama gerçekleştirins. </li><li> Gerekirse, en numunenin optik özelliklerini maç serbestçe dalgaboyu değiştirmek veya kızılötesi dalga boyu (yani, 790 nm) ile dokulara daha derin photobleaching, fotoğraf hasar ve görüntü önlemek ve (yani, 395 nm buna göre ikinci harmonik filtresini değiştirin .) Numune üzerine biriken HNPs ikinci harmonik sinyali en üst düzeye çıkararak tercih edilen bir çalışma dalga boyunda lazer darbeli ön kompresör ayarlarını optimize. </li><li> , Gerçek zamanlı kalp küme kasılmaları monitör, iki boyutlu görüntüleri yüksek hız edinimi sağlayan, örneğin rezonans modu gibi hızlı modunda mikroskop optik tarayıcıyı ayarlamak için. </li><li> Gibi görüntü kontrast ve toplama hızı arasındaki en iyi uzlaşma olarak ayarları seçin: <ul type="disc"><li> Tarama ortalama: 4 </li><li> Pixel bekleme süresi: 0.1 mikro saniye olduğu </li><li> Görüntü oranı: saniyede 3.75 kare (fps) </li></ul></li><li> Lazer gücü odak nokta s göre ayarlanırize ve tarama hızı. (Objektif girişinde ölçülen) 50 mW 0.1 mikro saniye olduğu piksel bekleme süresi ve hücre canlılığını korurken Planı APO 20X NA 0.75 amaç için tipik bir değerdir. </li></ol> 5. Görüntü Analizi <ol><li> Eksenel kalibrasyon prosedürü. Çıplak bir tabaka üzerinde biriken tek HNP seçin. SH yoğunluğunu maksimize etmek için (nanopartikülün eksenel pozisyonda yani) odağı ayarlayın. HNP bir fonksiyonu olarak SH yoğunluğu ile bir kalibrasyon eğrisi elde etmek için mikroskop kademesinin eksenel konumu odak düzlemi ile denkleştirilmiştir kontrollü bir şekilde değişir. Plan APO 20X NA 0.75 amaç için, bu ayarlama prosedürünün çıkış Şekil 4C&#39;de bildirilmektedir. </li><li> Tüm video çerçeveler mevcut HNPs seçin ve bunların periyodik hareketlerini belirler. Bu prosedür kolayca ilgi tanımlanmış bir bölgede sinyal maksimum yoğunluğu noktalar için arayan bir özel kod, örneğin otomatik edilebilirfarklı kare arasında onları bağlayan (Görüntü İşleme Araç kutusu &#39;bölge sahne&#39; fonksiyonunu kullanarak b Matlab R2009 yazılmış bir kod örneği sunulmuştur). </li><li> Olmayan sürekli izlenebilir HNPs Adım 5.1 kurulan kalibrasyon eğrisi kullanılarak eksenel deplasman içine farklı çerçeveler boyunca şiddeti modülasyon dönüştürerek, optik ekseni boyunca hareket ile ilişkili out-of-düzlem değiştirmeler, niceliğini değerlendirin. Bu prosedür eksenel hareketleri erişim sağlar ancak mutlak yön (yukarı veya aşağıya doğru) belirlenmesi için kullanılamaz unutmayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Bonacina, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+Fe(IO3)3+nanocrystals+as+local+probes+for+nonlinear+microscopy.">Polar Fe(IO3)3 nanocrystals as local probes for nonlinear microscopy.</a> Applied Physics B-Lasers and Optics. 87, 399-403 (2007).</li><li>Nakayama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+nanowire+nonlinear+optical+probe.">Tunable nanowire nonlinear optical probe.</a> Nature. 447, 1098-1101 (2007).</li><li>Aufray, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Synthesis+of+Nanosized+Niobium+Oxides+and+Lithium+Niobate+Particles+and+Their+Characterization+by+XPS+Analysis.">New Synthesis of Nanosized Niobium Oxides and Lithium Niobate Particles and Their Characterization by XPS Analysis.</a> J Nanosci Nanotechno. 9, 4780-4785 (2009).</li><li>Hsieh, C. L., Grange, R., Pu, Y., Psaltis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+harmonic+holographic+microcopy+using+nanoparticles+as+probes+for+cell+imaging.">Three-dimensional harmonic holographic microcopy using nanoparticles as probes for cell imaging.</a> Opt Express. 17, 2880-2891 (2009).</li><li>Pantazis, P., Maloney, J., Wu, D., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+harmonic+generating+(SHG)+nanoprobes+for+in+vivo+imaging.">Second harmonic generating (SHG) nanoprobes for in vivo imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14535-14540 (2010).</li><li>Baumner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evanescent-field-induced+second+harmonic+generation+by+noncentrosymmetric+nanoparticles.">Evanescent-field-induced second harmonic generation by noncentrosymmetric nanoparticles.</a> Opt Express. 18, 23218-23225 (2010).</li><li>Le Xuan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostable+second-harmonic+generation+from+a+single+KTiOPO4+nanocrystal+for+nonlinear+microscopy.">Photostable second-harmonic generation from a single KTiOPO4 nanocrystal for nonlinear microscopy.</a> Small. 4, 1332-1336 (2008).</li><li>Sandeau, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defocused+imaging+of+second+harmonic+generation+from+a+single+nanocrystal.">Defocused imaging of second harmonic generation from a single nanocrystal.</a> Opt Express. 15, 16051-16060 (2007).</li><li>Johnson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-field+imaging+of+nonlinear+optical+mixing+in+single+zinc+oxide+nanowires.">Near-field imaging of nonlinear optical mixing in single zinc oxide nanowires.</a> Nano Lett. 2, 279-283 (2002).</li><li>Kachynski, A. V., Kuzmin, A. N., Nyk, M., Roy, I., Prasad, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+oxide+nanocrystals+for+nonresonant+nonlinear+optical+microscopy+in+biology+and+medicine.">Zinc oxide nanocrystals for nonresonant nonlinear optical microscopy in biology and medicine.</a> J Phys Chem C. 112, 10721-10724 (2008).</li><li>Bonacina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+Nanomedecine:+Harmonic+Nanoparticles+toward+Targeted+Diagnosis+and+Therapy.">Nonlinear Nanomedecine: Harmonic Nanoparticles toward Targeted Diagnosis and Therapy.</a> Mol Pharmaceut. 10, 783-792 (2013).</li><li>Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHG+nanoprobes:+advancing+harmonic+imaging+in+biology.">SHG nanoprobes: advancing harmonic imaging in biology.</a> Bioessays. 34, 351-360 (2012).</li><li>Campagnola, P. J., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-harmonic+imaging+microscopy+for+visualizing+biomolecular+arrays+in+cells,+tissues+and+organisms.">Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms.</a> Nat Biotechnol. 21, 1356-1360 (2003).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Photon+Laser+Scanning+Fluorescence+Microscopy.">2-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li><li>Magouroux, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed+Tracking+of+Murine+Cardiac+Stem+Cells+by+Harmonic+Nanodoublers.">High-Speed Tracking of Murine Cardiac Stem Cells by Harmonic Nanodoublers.</a> Small. 8, 2752-2756 (2012).</li><li>Staedler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonic+Nanocrystals+for+Biolabeling:+A+Survey+of+Optical+Properties+and+Biocompatibility.">Harmonic Nanocrystals for Biolabeling: A Survey of Optical Properties and Biocompatibility.</a> Acs Nano. 6, 2542-2549 (2012).</li><li>Extermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodoublers+as+deep+imaging+markers+for+multi-photon+microscopy.">Nanodoublers as deep imaging markers for multi-photon microscopy.</a> Optics Express. 17, 15342-15349 (2009).</li><li>Chen, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wavelength+dependent+damage+in+biological+multi-photon+confocal+microscopy:+A+micro-spectroscopic+comparison+between+femtosecond+Ti+:+sapphire+and+Cr+:+forsterite+laser+sources.">Wavelength dependent damage in biological multi-photon confocal microscopy: A micro-spectroscopic comparison between femtosecond Ti : sapphire and Cr : forsterite laser sources.</a> Opt. Quantum Electron. 34, 1251-1266 (2002).</li><li>Ferreira, L., Karp, J. M., Nobre, L., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+opportunities:+The+use+of+Nanotechnologies+to+manipulate+and+track+stem+cells.">New opportunities: The use of Nanotechnologies to manipulate and track stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 136-146 (2008).</li><li>Kaur, S., Singhal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+nano+meets+stem:+The+impact+of+nanotechnology+in+stem+cell+biology.">When nano meets stem: The impact of nanotechnology in stem cell biology.</a> J Biosci Bioeng. 113, 1-4 (2012).</li><li>Hong, H., Yang, Y. N., Zhang, Y., Cai, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Invasive+Imaging+of+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Non-Invasive Imaging of Human Embryonic Stem Cells.</a> Curr Pharm Biotechno. 11, 685-692 (2010).</li><li>Tumbar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+epithelial+stem+cell+niche+in+skin.">Defining the epithelial stem cell niche in skin.</a> Science. 303, 359-363 (2004).</li><li>Shah, B. S., Clark, P. A., Moioli, E. K., Stroscio, M. A., Mao, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+mesenchymal+stem+cells+by+bioconjugated+quantum+dots.">Labeling of mesenchymal stem cells by bioconjugated quantum dots.</a> Nano Lett. 7, 3071-3079 (2007).</li><li>Zimmer, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+series+of+small+indium+arsenide-zinc+selenide+core-shell+nanocrystals+and+their+application+to+in+vivo+imaging.">Size series of small indium arsenide-zinc selenide core-shell nanocrystals and their application to in vivo imaging.</a> J Am Chem Soc. 128, 2526-2527 (2006).</li><li>Vallee, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-based+cardiopatches+improve+cardiac+function+in+infarcted+rats.">Embryonic stem cell-based cardiopatches improve cardiac function in infarcted rats.</a> Stem Cells Transl Med. 1, 248-260 (2012).</li><li>Idris, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+transplanted+cells+in+live+animal+using+upconversion+fluorescent+nanoparticles.">Tracking transplanted cells in live animal using upconversion fluorescent nanoparticles.</a> Biomaterials. 30, 5104-5113 (2009).</li><li>Haase, M., Schafer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upconverting+nanoparticles.">Upconverting nanoparticles.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 50, 5808-5829 (2011).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+Upconversion+Nanoparticles+for+Dual-Modal+Imaging-Guided+Stem+Cell+Therapy+under+Remote+Magnetic+Control.">Multifunctional Upconversion Nanoparticles for Dual-Modal Imaging-Guided Stem Cell Therapy under Remote Magnetic Control.</a> Adv Funct Mater. 23, 272-280 (2013).</li><li>Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+response+to+near-infrared+femtosecond+laser+pulses+in+two-photon+microscopes.">Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two-photon microscopes.</a> Optics Letters. 22, 135-136 (1997).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Kök hücre araştırmaları için nanoteknoloji uygulaması nispeten yeni ama hızla genişleyen bir alandır. Konuyla ilgili yorum eşyalar tarafından işaret edildiği gibi, nanopartiküllerin kullanımı azından oluşturma arasında proteinler ve genler hücre içi iletimi için, (in vitro ve hem de in vivo) izleme hücreden değişen, farklı araştırma görevleri yerine uygulanabilir Belirli farklılaşma tercihli stimülasyonu / engellenmesi için biomimetic hücresel ortamlar 19,20</sup...

Doğrusal olmayan mikroskopi sistemleri, onların doğasında üç boyutlu kesit yetenekleri sayesinde, giderek yakın-kızılötesi iki-foton soğurma bantları ile foto-stabil floroforlar için talebi tetikledi. Sadece son yıllarda çift, flüoresan bazlı etiket (boyalar, kuantum noktaları, yukarıya dönüştürücü nanopartiküller), farklı bir görüntüleme yöntemi etiket gibi doğal doğrusal olmayan nanopartiküller yeni bir ailesinin kullanımını istismar edilmiş, yani gelişimini tamamlamak için özellikle çoklu foton mikroskopi için geliştirilmiştir harmonik nanopartiküller (HNPs). Inorganik noncentrosymmetric kristaller dayanan bu etiketler, uyarma frekans SH üreten optik kontrast uygulamayın: yakın kızılötesi darbeli uyarma ışık bir kısmını dönüştürerek, örneğin görünür mavi ışığa (λ = 800 nm) (λ / 2 = 400 nm) . Yakın geçmişte birkaç yazar demir iyodat Fe (IO dahil, farklı malzemeler test ettik <sub&gt; 3) 3 1, potasyum niyobat (KNbO 3) 2, lityum niyobat (LiNbO 3) 3, baryum titanat (BaTiO 3) 4,5, potasyum titanil fosfat (KTiOPO4, KTP) 6-8, ve çinko oksit (ZnO ) 5,9,10. Flüoresan karşılaştırıldığında, HNPs gibi tam ağartma olmaması ve yanıp sönen, dar emisyon bantları, (kızılötesi için ultraviyole) uyarma dalga boyu Ayarlanabilirliğin, oryantasyon alma yeteneği, ve tutarlı optik cevap gibi çekici özellikler, bir dizi sahip. Bu benzersiz özellikleri son iki kapsamlı incelemesi gazetelerde 11,12 açıklanmıştır. Ayrıca, saçılması ve emilimini asgariye indirerek görüntüleme derinliğini artırır kızılötesi spektral bölgede, çalışan olasılığı büyük ölçüde örnek fotoğraf bozulmasını 13,14 sınırlar. Ayrıca, HNPs tarafından garanti sonsuz foto stabil sinyal uzun süreli cep izleme için ideal sondalar, yapar iözellikle rejeneratif tıp uygulamalarında 15 için itiraz var. Bu görsel deneyde, protokol bilgilerini fonksiyonelleştirilmemiş HNPs ile insan embriyonik kök hücrelerinin in vitro etiketleme (HESC) için verilmektedir. Koloid süspansiyonlarının sentezi ve hazırlık önceki yayında ve referanslar içinde 16 ayrıntılı olarak ve bu çalışmanın kapsamı dışındadır edilir. (Uzun vadeli hava-sıvı kültürleri olarak muhafaza) kalp kümeler halinde çoklu foton mikroskopi ve farklılaşma ile HESC soruşturma için metodolojiler sunulmaktadır. İnsan ESC süspansiyon içinde koloni fragmanlarının EB oluşumu ile ya da Şekil 1A &#39;da gösterildiği gibi, alternatif olarak, Aggrewell plaka kullanılarak EBS içine tek hücrelerin toplanmasını zorunlu ya da iki farklı şekillerde, sözde embriyoit organları (EBS) içinde ayırt etmek için izin olabilir . politetrafloretilenden kardiyak hücre kümeleri yenerek Culturing (PTFE) gözenekli filtreler facdaha fazla çalışmaları (aksiyon potansiyelleri örneğin elektrofizyolojik ölçümler) için uzun vadeli bakım ilitates. Tarama mikroskobu uyarım kaynağı HNPs ikinci harmonik görüntüleme gerçekleştirmek için gerekli pik güç ulaşmak için (numuneden 300 FSEC daha küçük bir darbe süresi ile) ultrashort bakliyat teslim etmek gerekir. Örneğin, görüntüleme için kullanılan en yaygın FSEC kaynak ayarlanabilir Ti vardır: Safir lazerler. Safir pompalanan kızılötesi optik parametrik osilatörler: Alternatif olarak, diğer ultra lazerler örneği erbyum iyonu 17, krom forsteritten 18 veya Ti için, istihdam edilebilir. Mikroskop tercihen oldukça yüksek bir sayısal diyafram ile bir objektif ile donatılmış olabilir. En önemlisi, önceki ölçümleri ve amaç değiştirildiği her zaman için, bu çalışma da lazer darbeli ön kompresör ayarlarını optimize ederek set-up (lens) &#39;de mevcut dispersiyon en aza indirmek için zorunludurseçim dalga boyu. Protokolde ayrıntılı Bu işlem, darbeli lazer odak düzlemi de sınırlı bir süre dönüşümü (örneğin, en kısa sürede) mümkün olduğu kadar yakın ve örnek doğrusal olmayan yanıtı maksimize sağlar. Protokol sonunda anlatılan görüntü analizi amacı belirlemek ve kardiyak kümeleri dayak ritmik kasılmalar ilişkili 3D HNPs hareketleri takip etmektir. Görüntü düzleminde izleme nanopartiküller, sadece takip eden film dilimlerinde konumlarını belirleyerek gerçekleştirilir. Eksenel hareketi üzerine bilgi elde etmek için, eksenel yer değiştirmesinin bir fonksiyonu olarak lineer olmayan bir şiddet tepkisinin bir ön kalibrasyon zorunludur. Uzun süreli ölçümler, örnek eksenel konumunun aktif interferometrik kontrolü için unutmayın termik ve / veya mekanik sürüklenir mevcudiyetinde kalibrasyon eğrisinin geçerliliği korumak için gereklidir. Trac için burada kullanılan HNPsbirikintiler içinde e yenerek hücreleri potasyum niobat oksit (KNbO 3) dayalı, ancak mevcut diğer doğrusal olmayan nanomateryaller Staedler ark 16 çalışmalarında ayrıntılı olarak gözden geçirilmiştir. Şimdiye kadar incelenen nanomalzemelerin çoğunun doğrusal olmayan optik verimleri çok benzer. KNbO 3 için seçim, esas olarak koloidal çözeltinin iyi stabilite ve hatta oldukça yüksek bir konsantrasyonda ve uzun zaman teşhir 16 birkaç insan hücre hatları üzerinde test onun iyi biyolojik uyumluluk, motive oldu. Bu iş için kullanılan nanomaterial yenilik göz önüne alındığında, floresan / ışıldayan biyo-belirteçler kıyasla HNPs temel özellikleri yazarlar tarafından gerçekleştirilen bir kısa orijinal bilgisayar video animasyon gösterilmiştir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1008">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Microscope Incubator</td>
			<td style="width:231px;">OKO LAB</td>
			<td style="width:205px;">UNO package (top stage)</td>
			<td style="width:343px;">&#160;37&#176;C, 5% CO2, moisturized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="2" style="height:64px;width:231px;">Multiphoton microscope</td>
			<td rowspan="2" style="width:231px;">Nikon</td>
			<td rowspan="2" style="width:205px;">AR1-MP</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:343px;">Fast scanning, four non photomultiplier descanned detectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="3" style="height:64px;width:231px;">Filters SHG and autofluorescence</td>
			<td rowspan="3" style="width:231px;">Semrock</td>
			<td style="width:205px;">FF01-360/12-25</td>
			<td rowspan="3" style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">FF01-395/11-25&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:205px;">FF02-485/20-25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="3" style="height:64px;width:231px;">Microscope objectives</td>
			<td rowspan="3" style="width:231px;">Nikon</td>
			<td style="width:205px;">CFI Plan Fluor 10x</td>
			<td style="width:343px;">NA 0.30, WD 16 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">CFI Plan Apo 20x</td>
			<td style="width:343px;">NA 0.75, WD 1.0 mm, VC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:205px;">CFI Apo 40x</td>
			<td style="width:343px;">NA 1.25, WD 0.18mm &#955;S, Nano-Crystal Coat</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:231px;">Rhock inhibitor&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Sigma</td>
			<td style="width:205px;">Y-27632</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:231px;">Knockout DMEM</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">10829</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Knockout Serum&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">10828</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">MEM Non-Essential Amino Acids&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">1140</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">L-glutamine 200mM&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">25030</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">15140</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">&#946;-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Sigma</td>
			<td style="width:205px;">M7522</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Collagenase IV&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:205px;">17104-019</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Roller scraper tool&#160;</td>
			<td style="width:231px;">StemPro EZPassage, Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">23181-010</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">StemPro Accutase&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:205px;">S11105-01</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Aggrewell system&#160;</td>
			<td style="width:231px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:205px;">27845</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Hyclone serum&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:205px;">SH30070.03</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Gelatin</td>
			<td style="width:231px;">Sigma</td>
			<td style="width:205px;">G9391</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">6-well plates&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Falcon</td>
			<td style="width:205px;">353046</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">24-well plates&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Nunclon</td>
			<td style="width:205px;">142475</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:231px;">Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters</td>
			<td style="width:231px;">Millipore&#160;</td>
			<td style="width:205px;">NA76/25</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Inserts</td>
			<td style="width:231px;">Millipore</td>
			<td style="width:205px;">PICM03050</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harmonic nanoparticles for regenerative research

Bu görsel deneyde, protokol bilgilerini ikinci harmonik üretimi nanopartiküller (HNPs) ile insan embriyonik kök hücrelerinin in vitro etiketleme (HESC) için verilmektedir. İkincisi yakın çoklu foton görüntüleme için bir biyolojik numune etiketleme için sunulan prob yeni bir ailesidir. HNPs uyarma dalga boyunda herhangi bir sınırlama ile ikinci harmonik nesil doğrusal olmayan optik işlem ile uyarma ışık sıklığını iki katına yeteneğine sahiptir. Çok foton (uzun vadeli hava-sıvı kültürler olarak tutulur) kalp kümeler halinde HESC farklılaşması için temel yöntemler detaylı olarak sunulmaktadır. Özellikle, 3D kalp dokusunu yenerek 3D izleme sırasında izole HNPs yoğun ikinci harmonik (SH) emisyonunu maksimize etmek için nasıl kanıt gösterilir. 3D deplasman desenleri almak için, elde edilen görüntülerin analizi de ayrıntılı.

Önceki konfokal görüntüleme ile dövülmesi aktivitesini değerlendirmek için, PTFE filtrelerin doğrusal olmayan optik cevap dikkatli bir karakterizasyonu yüksek bir konsantrasyonda (1 mg / ml), tek başına veya HNPs mevcudiyetinde ya da gerçekleştirildi. I) Çıplak yüzey iki foton heyecanlı floresan çok zayıf ve ilgili biyolojik numunelerin ölçüm engel olamaz, ve ii) izole HNPs gelen SH emisyon kolayca epi-algılama modunda substrat yoluyla görüntüleme ile elde edilebilir: O sağlanmıştır <stron...

Watch this Scientific Journal Video about Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research at JoVE.com

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Protokol bilgilerini, ikinci harmonik üreten nanopartiküller ile in vitro etiketleme insan embriyonik kök hücreleri için temin edilmiştir. Çoklu foton mikroskopi ve kalp kümeler halinde kendi farklılaşma ile HESC soruşturma için metodolojiler de sunulmuştur.

Rejeneratif Araştırma harmonik nanopartiküller

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

harmonic-nanoparticles-for-regenerative-research

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.2K Görüntüleme.  University of Geneva.  Protokol bilgilerini, ikinci harmonik üreten nanopartiküller ile in vitro etiketleme insan embriyonik kök hücreleri için temin edilmiştir. Çoklu foton mikroskopi ve kalp kümeler halinde kendi farklılaşma ile HESC soruşturma için metodolojiler de sunulmuştur. 

Video: Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively for tissue regeneration, a number of variables must be taken into account. These variables include: the total volume and surface area of the implantation site, the mechanical properties of the tissue and the tissue microenvironment, which includes the amount of vascularization and the components of the extracellular matrix. Therefore, the materials being used to deliver these cells must be biocompatible with a defined chemical composition while maintaining a mechanical strength that mimics the host tissue. These materials must also be permeable to oxygen and nutrients to provide a favorable microenvironment for cells to attach and proliferate. Chitosan, a cationic polysaccharide with excellent biocompatibility, can be easily chemically modified and has a high affinity to bind with in vivo macromolecules4-5. Chitosan mimics the glycosaminoglycan portion of the extracellular matrix, enabling it to function as a substrate for cell adhesion, migration and proliferation. In this study we utilize chitosan in the form of microspheres to deliver adipose-derived stem cells (ASC) into a collagen based three-dimensional scaffold6. An ideal cell-to-microsphere ratio was determined with respect to incubation time and cell density to achieve maximum number of cells that could be loaded. Once ASC are seeded onto the chitosan microspheres (CSM), they are embedded in a collagen scaffold and can be maintained in culture for extended periods. In summary, this study provides a method to precisely deliver stem cells within a three dimensional biomaterial scaffold.

A major hurdle in current stem cell therapies is determining the most effective method to deliver these cells to host tissues. Here, we describe a chitosan-based delivery method that is efficient and simple in approach, while allowing adipose-derived stem cells to maintain their multipotency.

Kök Hücre yüklü Chitosan Mikrokürelerin teslimi için bir Kollajen Hidrojel oluşturma

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively ...

Biyomühendislik

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Viral Nanopartiküller<em&gt; In vivo</em&gt; Tümör Görüntüleme

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticles for Multimodal Molecular Imaging Applications

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, complementary imaging techniques. These imaging agents facilitate the real-time assessment of pathways and mechanisms in vivo, which enhance both diagnostic and therapeutic efficacy. This article presents the protocol for the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles (PB NPs) - a novel class of agents for use in multimodal, molecular imaging applications. The imaging modalities incorporated in the nanoparticles, fluorescence imaging and magnetic resonance imaging (MRI), have complementary features. The PB NPs possess a core-shell design where gadolinium and manganese ions incorporated within the interstitial spaces of the PB lattice generate MRI contrast, both in T1 and T2-weighted sequences. The PB NPs are coated with fluorescent avidin using electrostatic self-assembly, which enables fluorescence imaging. The avidin-coated nanoparticles are modified with biotinylated ligands that confer molecular targeting capabilities to the nanoparticles. The stability and toxicity of the nanoparticles are measured, as well as their MRI relaxivities. The multimodal, molecular imaging capabilities of these biofunctionalized PB NPs are then demonstrated by using them for fluorescence imaging and molecular MRI in vitro.

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

Modlu Moleküler Görüntüleme Uygulamaları için Biofunctionalized Prusya Mavisi Nanopartikülleri

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Katı Lipit nanopartiküller (SLNs) Hücre içi Hedefleme için başvurular

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Kuantum Nokta Nanopartiküller kullanma Korelatif Işık- ve Elektron Mikroskobu

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.2. Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart3. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact4. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

In these studies, we provide methodology for novel, neonatal, murine cardiac scaffolds for use in regenerative studies.

Yenidoğan Kardiyak iskeleleri: Rejeneratif Çalışmaları Roman Matrisler

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

Sıvılardaki Darbeli Lazer-Ablasyonuyla Metal Nanopartikül Üretimi: Nanopartiküllerin Antibakteriyel Özelliklerini İncelemek İçin Bir Alet

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

20 mJ, 1 ps Yb:YAG Thin-disk Regenerative Amplifier

This is a report on a 100 W, 20 mJ, 1 ps Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier. A homemade Yb:YAG thin-disk, Kerr-lens mode-locked oscillator with turn-key performance and microjoule-level pulse energy is used to seed the regenerative chirped-pulse amplifier. The amplifier is placed in airtight housing. It operates at room temperature and exhibits stable operation at a 5 kHz repetition rate, with a pulse-to-pulse stability less than 1%. By employing a 1.5 mm-thick beta barium borate crystal, the frequency of the laser output is doubled to 515 nm, with an average power of 70 W, which corresponds to an optical-to-optical efficiency of 70%. This superior performance makes the system an attractive pump source for optical parametric chirped-pulse amplifiers in the near-infrared and mid-infrared spectral range. Combining the turn-key performance and the superior stability of the regenerative amplifier, the system facilitates the generation of a broadband, CEP-stable seed. Providing the seed and pump of the optical parametric chirped-pulse amplification (OPCPA) from one laser source eliminates the demand of active temporal synchronization between these pulses. This work presents a detailed guide to set up and operate a Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier, based on chirped-pulse amplification (CPA), as a pump source for an optical parametric chirped-pulse amplifier.

A protocol for the operation of a high-energy, high-power optical parametric chirped pulse amplifier pump source based on an Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier is presented here.

20 mJ, 1 ps Yb: YAG İnce Diskli Şarj Edici Amplifikatör

This is a report on a 100 W, 20 mJ, 1 ps Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier. A homemade Yb:YAG thin-disk, Kerr-lens mode-locked oscillator with ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

Enjekte edilebilir rejeneratif terapi ve yüksek-den geçerek uyuşturucu tarama için 3D Microtissues

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation purposes. The process to generate such tissues is complex, and includes an appropriate combination of specific cell types, scaffolds, and physical or biochemical stimuli to guide cell growth and differentiation. Microcarriers represent an appealing tool to expand cells in a three-dimensional (3D) microenvironment, since they provide higher surface-to volume ratios and mimic more closely the in vivo situation compared to traditional two-dimensional methods. The vascular system, supplying oxygen and nutrients to the cells and ensuring waste removal, constitutes an important building block when generating engineered tissues. In fact, most constructs fail after being implanted due to lacking vascular support. In this study, we present a protocol for endothelial cell expansion on recombinant collagen-based microcarriers under dynamic conditions in spinner flask and bioreactors, and we explain how to determine in this setting cell viability and functionality. In addition, we propose a method for cell delivery for vascularization purposes without additional detachment steps necessary. Furthermore, we provide a strategy to evaluate the cell vascularization potential in a perfusion bioreactor on a decellularized&#160;biological matrix. We believe that the use of the presented methods could lead to the development of new cell-based therapies for a large range of tissue engineering applications in the clinical practice.

We propose a cell expansion protocol on macroporous microcarriers and their use as delivery system in a perfusion bioreactor to seed a decellularized tissue matrix. We also include different techniques to determine cell proliferation and viability of cells cultured on microcarriers. Furthermore, we demonstrate functionality of cells after bioreactor cultures.