저자는 유럽 FP7 연구 프로젝트 NAMDIATREAM (NMP4-LA-2010-246479, http://www.namdiatream.eu) 및 INTERREG IV 프랑스 - 스위스 NAOMI 프로젝트에서 일부 자금을 인정하고 싶습니다.

1. 문화와 인간 ESC의 확장 <ol><li> 준비 녹아웃 DMEM을 함유하는 (PM이라고 함) 세포 증식 배지는 20 % 녹아웃 혈청, 1 % MEM 비 필수 아미노산, 1 % L-글루타민 200 mM의 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 및 3.5 μL의 β-머 캅토 에탄올이 보충. </li><li> 8 ML의 PM 매체에서 인간의 ESC (hESC의)를 해동 및 DMSO 첨가 된 동결 매체를 폐기 115 XG에서 그들에게 5 분 원심 분리기. </li><li> (만 24 시간 배양)를 해동시 세포 사멸을 방지하고 세포 생존을 개선하기 위해 10 mM의 바위 억제제를 포함하는 PM 매체의 1 ML을 추가합니다. </li><li> 능성의 유지에 필요한 농도 (4-10 NG / ㎖)에서 PM에 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF)를 추가한다. </li><li> 이전 / ㎠ 2 × 10 4 세포의 농도로 도금 피더 세포 포피 조사 인간의 hESC의 (γHFF) (그림 1A)를, 플레이트. </li><li> 필요한 경우 C의 일부를 제거, 중간 매일 변경olonies는 긴 크게 잘라 파스퇴르 피펫을 사용하여 흡인 차별화하기 시작했다. </li><li> 효소 주 통로 식민지 번 : <ol><li> 매체를 제거하고 2 ML PBS와 식민지를 씻어. </li><li> PBS를 제거하고 37 ° C, 5 % CO 2에서 10 분 동안 1 ㎎ / ㎖에서 따뜻한 콜라게나 제 IV 잘 당 0.5 ㎖로 그들을 품어. </li><li> 2 ㎖ 3 분 115 XG에 새로운 PM 원심 분리기에 식민지 조각을 수집합니다. </li></ol></li><li> 또한, 식민지 긁어 기계적으로 계대 할 수 있습니다 <ol><li> 매체를 제거하고 2 ML PBS와 식민지를 씻어. </li><li> 수동 StemPro EZPassage 롤러 긁는 도구 (그림 1B)를 사용하여 식민지를 다 쳤어요. </li><li> 식민지 조각을 수집하고 뜨는을 제거하기 위해 115 XG에서 3 분 동안 원심 분리 한 후. </li><li> γHFF 또는 플레이트 조각은 배아 체 (교환 사채)로 차별화를 처리합니다. </li></ol></li></ol> 2. 인간의 ESC 차별화프로토콜 <ol><li> 준비 녹아웃 DMEM을 사용하여 차별화 매체 (DM)는 2 % HyClone 사 혈청, 1.0 % MEM 비 필수 아미노산, 1.0 %의 L-글루타민 200 밀리미터, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신, 3.5 μL의 β-머 캅토 에탄올과 보충. </li><li> 매체를 제거하고 2 ML PBS와 식민지를 씻어. </li><li> 서스펜션의 식민지 조각의 EB 형성 : <ol><li> PBS를 제거하고 37 ° C, 5 % CO 2에서 10 분 동안 1 ㎎ / ㎖에서 따뜻한 콜라게나 제 IV 잘 당 0.5 ㎖로 그들을 품어. </li><li> 2 ㎖ 3 분 115 XG에 새로운 DM 원심 분리기에 식민지 조각을 수집합니다. </li><li> 사일 (그림 1C) 용 초저 첨부 6 - 웰 플레이트 (물론 당 2 ㎖) 현탁액 문화를. </li><li> 수집하고 0.1 % 젤라틴 코팅 24 - 웰 플레이트 (약 3 사채 /도) (그림 1D)에 새로 설립하는 교환 사채를 접시. </li></ol></li><li> 또한, Aggrewell 판을 사용하여 사채로 단일 세포의 집계를 강제 : <ol><li> 제거 PBS와accutase (0.5 ㎖ /도)를 사용하여 단일 세포로 식민지를 떼어 놓다. </li><li> 1.2 × 10 6 / ㎖에서 DM의 원심 분리기와에 resuspend 세포. </li><li> 일일 (그림 1B &#39;)에 대한 Aggrewell 챔버 당 2 ML을 추가합니다. </li><li> 새로 형성된 사채 (그림 1C &#39;)를 수집하고 0.1 % 젤라틴 코팅 24 - 웰 플레이트 (약 3 사채 / 웰)에 그들을 접시. </li><li> 심근 (15-30 일)가 클러스터를 상회의 모양까지 2-3 일마다 DM을 변경합니다. </li></ol></li></ol> HNPs와 클러스터 및 라벨링 잔 3. 공기 - 액체 3D 문화 <ol><li> 확인하고 수동으로 일반적으로 긴 크게 잘라 파스퇴르 피펫을 사용하여, 문화 2 ~ 4 주 후에 나타나는 치는 심근 (그림 1D)의 클러스터를 해부하다. </li><li> 6 잘 플레이트 (그림 1 층)에 배치됩니다 삽입 당 보증금 4 PTFE 필터. </li><li> EAC의 상단에 DM 매체의 1 ML을 추가합니다시간 잘. </li><li> 각 PTFE 필터 (그림 1E)에 하나의 해부 치고 클러스터, 최대 4/well, 플레이트 (그림 1 층 &#39;) 당 즉, 24 집계를 추가합니다. </li><li> 2-3 일마다 DM 매체를 변경합니다. </li><li> 클러스터 레이블을 지정하려면 (170 μm의 두께) 박동 클러스터를 포함하는 PTFE 필터를 제거하고 3.5 cm의 유리 바닥 접시에 넣어. </li><li> 30 분 동안 50 ㎍ / ml의 농도로 HNP 1 ㎖를 추가. </li></ol> 4. 비선형 광학 이미징 <ol><li> 샘플 준비. HNP 라벨 (단계 3.6 참조)를 사용하여 높은 개구 목표의 작동 거리와 호환되는 170 μm의 두께 유리 바닥 접시 위에 PTFE 필터에 전체 분화 초기 HEBS 또는 (수축 모양에 따라 절개) 심장 박동 클러스터 중 하나를 전송 한 후. 또한, 유리 바닥 접시 0.1 % 젤라틴으로 미리 코팅에 클러스터를 상회의 직접 코팅을 적용합니다. </li><li> 로 전송 샘플올인원 안정 온도, 습도 및 시간의 연장 기간 동안 CO 2 제어를 보장하는 실을 배양 장착 현미경. </li><li> 초기 검사, 이미지 후 백색광 조명 아래 넓은 필드 영상을 통해 샘플은 추가 조사를 위해 선택됩니다 차별화 된 사채 또는 활성 박동 클러스터 내에서 그 구조를 식별합니다. </li><li> 세포 NADH의 형광도 및 HNPs에서 SH 동시에 취득 할 수있는 경우, 분자 흡수에 맞게 짧은 레이저 여기 파장 (즉, 720 nm의)을 설정합니다. 반 여기 파장에 중심 한 협 대역 통과 스펙트럼 필터 사용 (즉, λ = 360 ± 10 ㎚) SH를 검출하고, 또 다른 하나는 형광도를 검출하도록. </li><li> 첫째 심장 클러스터의 전체 형태를 재건하고 여러 가지 볼 수 HNP와 클러스터 볼륨 내에서 이미지 평면을 선택하는 빠르고, 낮은 해상도, 입체 검사를 수행의. </li><li> 필요한 경우 유용한 샘플의 광학 특성을 일치하도록 자유롭게 여기 파장을 변경하거나 IR 파장 (즉, 790 nm 정도)을 가진 조직을 깊은 광표백, 사진 손상 및 화상에 않도록하고 (즉, 395 nm의 따라서 제 고조파 필터 교체 ). 샘플에 증착 HNPs의 제 고조파 신호를 최대화함으로써 선택의 작동 파장에서 레이저 펄스 사전 압축기의 설정을 최적화. </li><li> 실시간으로 심장 클러스터의 수축을 모니터링 두 가지 차원 영상의 고속 획득을 허용, 같은 공진 모드와 빠른 모드에서 현미경 광학 스캐너를 설정합니다. </li><li> 같은 이미지의 대비와 수집 속도 사이의 최고의 타협으로 설정을 선택합니다 : <ul type="disc"><li> 스캔 평균 : 4 </li><li> 픽셀 체류 시간 : 0.1 마이크로 초 </li><li> 이미지 속도 : 초당 4,125 프레임 (fps) </li></ul></li><li> 레이저 파워는 초점 스팟의에 따라 조정이지는 스캔 속도. (목적의 입구에서 측정) 50 mW의 0.1 마이크로 초 화소의 정지 시간 및 세포 생존 능력을 보존 계획 APO 20X NA 825 목적의 전형적인 값입니다. </li></ol> 5. 이미지 분석 <ol><li> 축 보정 절차. 베어 기판에 증착 된 단일 HNP를 선택합니다. SH 강도를 극대화 (나노 입자의 축 방향 위치, 즉) 초점을 조정합니다. HNP의 함수로서 SH 강도 관한 검량선을 얻었다 현미경 스테이지의 축 방향 위치는 초점 평면으로부터 오프셋 제어 된 방식으로 변화한다. 계획 APO 20X NA 825 목적이 보정 절차의 출력은 그림 (c)에보고됩니다. </li><li> 모든 비디오 프레임에 존재 HNPs를 선택하고 자신의주기적인 움직임을 결정한다. 이 절차는 쉽게 그 정의 된 영역에서 최대 신호 강도 반점을 추구하는 사용자 지정 코드로 예를 들어, 자동화 할 수 있습니다다른 프레임 사이를 연결 (이미지 처리 도구 상자의 &#39;지역의 소품&#39;기능을 사용하여 B를 Matlab을 R2009로 작성된 예제 코드은 제공됩니다). </li><li> 비 연속적 추적 HNPs 단계 5.1에서 확립 검량선을 이용하여 축 방향 변위로 다른 프레임에 걸쳐 자신의 강도 변조를 변환함으로써, 광축을 따라 이동과 연관된 면외 변위의 정량 평가. 이 절차는 축 방향의 움직임에 대한 액세스를 제공하지만, 절대적인 방향 (위 또는 아래)를 결정하는데 이용 될 수 없습니다. </li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

줄기 세포 연구에 나노 기술의 응용 프로그램은 비교적 새로운하지만 빠르게 확장 필드입니다. 주제에 대한 다양한 리뷰 기사에서 지적한 바와 같이, 나노 입자의 사용은 적어도 창조의 단백질 및 유전자의 세포 내 전달에, (시험 관내 및 생체 내에서 모두) 추적 세포에 이르기까지 다양한 연구 작업을 수행하기 위해 적용 할 수있는 특정 분화 우선 자극 / 억제를위한 생체 모방 세포 환경은...

비선형 현미경 시스템은 고유의 입체 단면 처리 능력 덕분에, 점점 근적외선의 이광자 흡수 밴드를 가진 광 안정 형광체에 대한 수요를 유발 하였다. 단지 지난 몇 년에, 형광 기반의 라벨 (염료, 양자 점, 최대 변환 나노 입자), 다른 이미징 방법은 레이블과 같은 본질적으로 비선형 나노 입자의 새로운 가족의 사용을 악용 한, 즉 개발을 보완하는 특히 다 광자 현미경을 위해 개발 된 고조파 나노 입자 (HNPs). 무기 noncentrosymmetric 결정에 따라 이러한 레이블은 여기 주파수의 SH를 생성 광학 대비를 발휘 : 근적외선 펄스 여기 빛의 일부를 변환하여 예를 볼 푸른 빛으로 (λ = 800 nm의) (λ / 2 = 400 nm의) . 최근 과거에 여러 저자는 철 요오드 철 (IO를 포함하여, 다른 재료를 테스트 한 <suB&gt; 3) 3 일, 칼륨 니오 베이트 (KNbO 3)이, 니오브 산 리튬 (의 LiNbO3) 3, 티탄산 바륨 (BaTiO3를) 4,5, 칼륨 티 타닐 포스페이트 (KTiOPO4, KTP) 6-8, 및 산화 아연 (ZnO의 ) 5,9,10. 형광 프로브에 비해 HNPs는 완전한 표백의 부재 점멸, 좁은 발광 밴드 (적외선하는 자외선에서) 여기 파장 조정 기능, 방향 검색 기능 및 일관성있는 광학 응답으로 매력적인 특성의 시리즈를 가지고있다. 이러한 독특한 특성은 최근 두 가지 종합적인 검토 논문 11, 12에 설명되어있다. 또한, 산란 및 흡수를 최소화하여 영상의 깊이를 증가 적외선 스펙트럼 영역에서 작업의 가능성이 크게 샘플 사진 저하 (13, 14)을 제한한다. 또한, HNPs 보장 무한 사진 안정 신호는 장기 세포 추적하기에 적합한 프로브를 만드는 전특히 재생 의학 응용 프로그램을 15 호소이야. 이 시각 실험에서, 프로토콜 세부 사항은 작용 화 HNPs으로 인간 배아 줄기 세포의 체외 라벨 (hESC의) 제공됩니다. 콜로이드 현탁액의 합성 및 제조는 이전 책에서 및 참조 거기에 16에서 설명하고이 범위에있다. (장기 공기 - 액체 문화로 유지) 심장 클러스터에 다 광자 현미경과 분화에 의해 hESC의 조사에 대한 방법론이 제시된다. 인간의 ESC 서스펜션의 식민지 조각의 EB 형성하거나 그림 1A에 도시 된 바와 같이, 대안, Aggrewell 판을 사용하여 사채에 단일 세포의 응집을 강제하거나 두 가지 방법으로 소위 배아 체 (교환 사채) 내에서 차별화 할 수 있도록 할 수 있습니다 . 폴리 테트라 플루오로 에틸렌에 심장 세포의 클러스터를 치고 배양 (PTFE) 다공성 필터 FAC추가 연구 (활동 전위의 예를 들어 전기 생리학 측정)에 대한 자신의 장기적인 유지 관리를 ilitates. 주사 현미경의 여진 원은 HNPs의 차 고조파 이미징을 수행하기 위해 필요한 최대 전력에 도달하기 위해 (샘플에서 300 FSEC보다 작은 펄스 시간) 초단 펄스를 제공 할 수 있어야한다. 예를 들어, 이미징에 사용되는 가장 일반적인 FSEC 소스는 가변 티 아르 : 사파이어 레이저. 사파이어 펌핑 적외선 광 파라 메트릭 발진기 : 또는 다른 초고속 레이저는 인스턴스 에르븀 이온 17, 크롬 포스 테 라이트 (18) 또는 티를 위해, 이용 될 수있다. 현미경은 바람직 다소 높은 개구 수 대물 탑재 될 수있다. 아주 중요한 것은, 앞서 측정 한 목적이 대체 될 때마다, 그것은이 운동에 레이저 펄스 사전 압축기의 설정을 최적화하여 셋업 (렌즈)의 분산액의 존재를 최소화하기 위해 필수선택의 파장. 프로토콜에 설명이 절차는, 레이저 펄스가 초점면에서 한정된 지속 기간을 변형 (즉, 최단 등)에 최대한 가깝게하고 샘플 비선형 응답을 최대화하는 것을 보장한다. 프로토콜의 끝 부분에 설명 된 이미지 분석의 목적은 파악하고 심장 클러스터를 상회의 리듬 수축과 관련된 3D HNPs의 움직임에 추적 할 수 있습니다. 이미지면에서 추적 나노 입자는 단순히 연속 동영상 프레임에서 자신의 위치를​​ 파악하여 실현된다. 축 방향 이동에 대한 정보를 추출하기 위해, 축 방향 변위의 함수로서 비선형 강도 응답의 사전 보정이 필수적이다. 장기 측정 샘플 축 위치의 활성 간섭계 컨트롤을주지는 열 및 / 또는 기계적 감도의 존재 검량선의 유효성을 유지하는 것이 요구된다. TRAC에 여기에 사용 HNPs집합 내의 전자 박동 세포는 니오븀 산 칼륨 산화물 (KNbO 3)을 기반으로하지만, 다른 가능한 비선형 나노 물질은 Staedler 등 (16)의 작품에서 자세히 검토하고 있습니다. 지금까지 조사 된 나노 물질의 대부분의 비선형 광학 효율이 매우 비교할 수 있습니다. KNbO 3의 선택은 본질적으로 콜로이드 용액의 좋은 안정성과도 상당히 높은 농도와 긴 박람회 16 배에서 몇 사람의 세포주의 좋은 생체 적합성에 의해 좌우되었다. 이 작업에 사용되는 나노 물질의 새로운 감안할 때, 형광 / 발광 바이오 마커에 비해 HNPs의 주요 특성은 저자에 의해 실현 짧은 원래 컴퓨터 비디오 애니메이션에 표시됩니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1008">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Microscope Incubator</td>
			<td style="width:231px;">OKO LAB</td>
			<td style="width:205px;">UNO package (top stage)</td>
			<td style="width:343px;">&#160;37&#176;C, 5% CO2, moisturized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="2" style="height:64px;width:231px;">Multiphoton microscope</td>
			<td rowspan="2" style="width:231px;">Nikon</td>
			<td rowspan="2" style="width:205px;">AR1-MP</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:343px;">Fast scanning, four non photomultiplier descanned detectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="3" style="height:64px;width:231px;">Filters SHG and autofluorescence</td>
			<td rowspan="3" style="width:231px;">Semrock</td>
			<td style="width:205px;">FF01-360/12-25</td>
			<td rowspan="3" style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">FF01-395/11-25&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:205px;">FF02-485/20-25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="3" style="height:64px;width:231px;">Microscope objectives</td>
			<td rowspan="3" style="width:231px;">Nikon</td>
			<td style="width:205px;">CFI Plan Fluor 10x</td>
			<td style="width:343px;">NA 0.30, WD 16 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">CFI Plan Apo 20x</td>
			<td style="width:343px;">NA 0.75, WD 1.0 mm, VC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:205px;">CFI Apo 40x</td>
			<td style="width:343px;">NA 1.25, WD 0.18mm &#955;S, Nano-Crystal Coat</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:231px;">Rhock inhibitor&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Sigma</td>
			<td style="width:205px;">Y-27632</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:231px;">Knockout DMEM</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">10829</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Knockout Serum&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">10828</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">MEM Non-Essential Amino Acids&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">1140</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">L-glutamine 200mM&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">25030</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">15140</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">&#946;-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Sigma</td>
			<td style="width:205px;">M7522</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Collagenase IV&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:205px;">17104-019</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Roller scraper tool&#160;</td>
			<td style="width:231px;">StemPro EZPassage, Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">23181-010</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">StemPro Accutase&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:205px;">S11105-01</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Aggrewell system&#160;</td>
			<td style="width:231px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:205px;">27845</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Hyclone serum&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:205px;">SH30070.03</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Gelatin</td>
			<td style="width:231px;">Sigma</td>
			<td style="width:205px;">G9391</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">6-well plates&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Falcon</td>
			<td style="width:205px;">353046</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">24-well plates&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Nunclon</td>
			<td style="width:205px;">142475</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:231px;">Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters</td>
			<td style="width:231px;">Millipore&#160;</td>
			<td style="width:205px;">NA76/25</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Inserts</td>
			<td style="width:231px;">Millipore</td>
			<td style="width:205px;">PICM03050</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harmonic nanoparticles for regenerative research

이 시각 실험에서, 프로토콜 정보는 두 번째 고조파 발생 나노 입자 (HNPs)와 인간 배아 줄기 세포의 체외 라벨 (hESC의) 제공됩니다. 후자는 최근 다중 광자 이미징을위한 생체 시료 라벨 도입 프로브의 새로운 가족입니다. HNPs는 여기 파장에 아무런 제한이 제 고조파 발생의 비선형 광학적 프로세스에 의해 여기 광의 주파수를 두배로 할 수있다. 다 광자 (장기 공기 - 액체 문화로 유지) 심장 클러스터로 hESC의 차별화를위한 방법론을 기반으로 상세하게 제공됩니다. 특히, 3D로 심장 조직을 구타의 3D 모니터링 동안 고립 HNPs의 강렬한 두 번째 고조파 (SH) 배출을 극대화하는 방법에 대한 증거가 표시됩니다. 3D 변위 패턴을 검색 결과 이​​미지의 분석은 또한 상술된다.

이전 촛점 촬상함에 고해 활성을 평가하기에, PTFE 필터의 비선형 광학 응답의 신중한 특성화 고농도 (1 ㎎ / ㎖)에서 단독으로 또는 HNPs의 존재 하에서도 수행 하였다. ⅰ) 상기 베어 기판 이광자 여기 형광이 미약하며 관련 생물학적 시료 측정을 방지 할 수 있고, ⅱ) 절연 HNPs로부터 SH 방출 쉽게 에피 검출 모드에서 상기 기판을 촬상하여 취득 할 수있다 : 그것은 것이 보장되었다 (그림 2).</str...

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Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

프로토콜 정보는 두 번째 고조파 발생 나노 입자와 생체 표지 인간 배아 줄기 세포 제공됩니다. 다 광자 현미경과 심장 클러스터로 분화하여 hESC의 조사에 대한 방법론도 제시된다.

재생 연구를위한 고조파 나노 입자

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.2K 조회수.  University of Geneva.  프로토콜 정보는 두 번째 고조파 발생 나노 입자와 생체 표지 인간 배아 줄기 세포 제공됩니다. 다 광자 현미경과 심장 클러스터로 분화하여 hESC의 조사에 대한 방법론도 제시된다. 

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Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively for tissue regeneration, a number of variables must be taken into account. These variables include: the total volume and surface area of the implantation site, the mechanical properties of the tissue and the tissue microenvironment, which includes the amount of vascularization and the components of the extracellular matrix. Therefore, the materials being used to deliver these cells must be biocompatible with a defined chemical composition while maintaining a mechanical strength that mimics the host tissue. These materials must also be permeable to oxygen and nutrients to provide a favorable microenvironment for cells to attach and proliferate. Chitosan, a cationic polysaccharide with excellent biocompatibility, can be easily chemically modified and has a high affinity to bind with in vivo macromolecules4-5. Chitosan mimics the glycosaminoglycan portion of the extracellular matrix, enabling it to function as a substrate for cell adhesion, migration and proliferation. In this study we utilize chitosan in the form of microspheres to deliver adipose-derived stem cells (ASC) into a collagen based three-dimensional scaffold6. An ideal cell-to-microsphere ratio was determined with respect to incubation time and cell density to achieve maximum number of cells that could be loaded. Once ASC are seeded onto the chitosan microspheres (CSM), they are embedded in a collagen scaffold and can be maintained in culture for extended periods. In summary, this study provides a method to precisely deliver stem cells within a three dimensional biomaterial scaffold.

A major hurdle in current stem cell therapies is determining the most effective method to deliver these cells to host tissues. Here, we describe a chitosan-based delivery method that is efficient and simple in approach, while allowing adipose-derived stem cells to maintain their multipotency.

줄기 세포 - 로드된 키토산 Microspheres의 배달을 위해 콜라겐 히드로겔을 구축

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively ...

연구

생체공학

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

에 대한 바이러스 나노 입자<em&gt; 생체에</em&gt; 종양 이미징

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticles for Multimodal Molecular Imaging Applications

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, complementary imaging techniques. These imaging agents facilitate the real-time assessment of pathways and mechanisms in vivo, which enhance both diagnostic and therapeutic efficacy. This article presents the protocol for the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles (PB NPs) - a novel class of agents for use in multimodal, molecular imaging applications. The imaging modalities incorporated in the nanoparticles, fluorescence imaging and magnetic resonance imaging (MRI), have complementary features. The PB NPs possess a core-shell design where gadolinium and manganese ions incorporated within the interstitial spaces of the PB lattice generate MRI contrast, both in T1 and T2-weighted sequences. The PB NPs are coated with fluorescent avidin using electrostatic self-assembly, which enables fluorescence imaging. The avidin-coated nanoparticles are modified with biotinylated ligands that confer molecular targeting capabilities to the nanoparticles. The stability and toxicity of the nanoparticles are measured, as well as their MRI relaxivities. The multimodal, molecular imaging capabilities of these biofunctionalized PB NPs are then demonstrated by using them for fluorescence imaging and molecular MRI in vitro.

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

멀티 모달 분자 이미징 애플리케이션을위한 Biofunctionalized 프 러시안 블루 나노 입자

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

고체 지질 나노 입자 (SLNs) 세포 내 타겟팅을위한 응용 프로그램

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

양자점 나노 입자를 사용하여 상호 빛 - 및 전자 현미경

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.2. Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart3. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact4. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

In these studies, we provide methodology for novel, neonatal, murine cardiac scaffolds for use in regenerative studies.

신생아 심장 공사장 공중 발판 : 회생 연구 소설 행렬

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

액체에서의 펄스 레이저 어블 레이션에 의한 금속 나노 입자의 제조 : 나노 입자의 항균성 연구를위한 도구

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

20 mJ, 1 ps Yb:YAG Thin-disk Regenerative Amplifier

This is a report on a 100 W, 20 mJ, 1 ps Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier. A homemade Yb:YAG thin-disk, Kerr-lens mode-locked oscillator with turn-key performance and microjoule-level pulse energy is used to seed the regenerative chirped-pulse amplifier. The amplifier is placed in airtight housing. It operates at room temperature and exhibits stable operation at a 5 kHz repetition rate, with a pulse-to-pulse stability less than 1%. By employing a 1.5 mm-thick beta barium borate crystal, the frequency of the laser output is doubled to 515 nm, with an average power of 70 W, which corresponds to an optical-to-optical efficiency of 70%. This superior performance makes the system an attractive pump source for optical parametric chirped-pulse amplifiers in the near-infrared and mid-infrared spectral range. Combining the turn-key performance and the superior stability of the regenerative amplifier, the system facilitates the generation of a broadband, CEP-stable seed. Providing the seed and pump of the optical parametric chirped-pulse amplification (OPCPA) from one laser source eliminates the demand of active temporal synchronization between these pulses. This work presents a detailed guide to set up and operate a Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier, based on chirped-pulse amplification (CPA), as a pump source for an optical parametric chirped-pulse amplifier.

A protocol for the operation of a high-energy, high-power optical parametric chirped pulse amplifier pump source based on an Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier is presented here.

20 mJ, 1 ps Yb : YAG Thin-disk 재생 앰프

This is a report on a 100 W, 20 mJ, 1 ps Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier. A homemade Yb:YAG thin-disk, Kerr-lens mode-locked oscillator with ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

주 사용 재생 치료와 높은 처리량 마약 검사에 대 한 3D Microtissues

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation purposes. The process to generate such tissues is complex, and includes an appropriate combination of specific cell types, scaffolds, and physical or biochemical stimuli to guide cell growth and differentiation. Microcarriers represent an appealing tool to expand cells in a three-dimensional (3D) microenvironment, since they provide higher surface-to volume ratios and mimic more closely the in vivo situation compared to traditional two-dimensional methods. The vascular system, supplying oxygen and nutrients to the cells and ensuring waste removal, constitutes an important building block when generating engineered tissues. In fact, most constructs fail after being implanted due to lacking vascular support. In this study, we present a protocol for endothelial cell expansion on recombinant collagen-based microcarriers under dynamic conditions in spinner flask and bioreactors, and we explain how to determine in this setting cell viability and functionality. In addition, we propose a method for cell delivery for vascularization purposes without additional detachment steps necessary. Furthermore, we provide a strategy to evaluate the cell vascularization potential in a perfusion bioreactor on a decellularized&#160;biological matrix. We believe that the use of the presented methods could lead to the development of new cell-based therapies for a large range of tissue engineering applications in the clinical practice.

We propose a cell expansion protocol on macroporous microcarriers and their use as delivery system in a perfusion bioreactor to seed a decellularized tissue matrix. We also include different techniques to determine cell proliferation and viability of cells cultured on microcarriers. Furthermore, we demonstrate functionality of cells after bioreactor cultures.