Les auteurs tiennent à remercier le financement partiel du projet de recherche du 7e PC NAMDIATREAM européenne (NMP4-LA-2010-246479, http://www.namdiatream.eu) et le projet INTERREG IV France-Suisse NAOMI.

1. Culture et de l&#39;expansion de l&#39;ESC humain <ol><li> Préparer le milieu de propagation cellulaire (appelée PM) contenant Knockout DMEM supplémenté avec 20% Knockout sérum, 1% de MEM non-acides aminés essentiels, 1% de L-glutamine 200 mM, 1% de pénicilline-streptomycine, et 3,5 ul de β-mercaptoéthanol. </li><li> Décongeler les CSE humaines (CSEh) dans 8 ml de milieu de PM et de les centrifuger 5 min à 115 xg pour éliminer milieu de congélation DMSO-complété. </li><li> Ajouter 1 ml de milieu PM contenant 10 mM inhibiteur de roche pour empêcher l&#39;apoptose et d&#39;améliorer la survie des cellules après décongélation (24 heures d&#39;incubation seulement). </li><li> Ajouter facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF) pour la PM à la concentration désirée (4-10 ng / ml) pour le maintien de la pluripotence. </li><li> Plaque la CSEh sur humain irradié prépuce de cellules nourricières (γHFF) (figure 1A), auparavant plaqué à une concentration de 2 x 10 4 cellules / cm 2. </li><li> Changer le milieu tous les jours et, le cas échéant, retirer des parties de colonies de commencer à différencier par aspiration à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur fortement réduit allongée. </li><li> Une fois par semaine, les colonies de passage par voie enzymatique: <ol><li> Éliminer le milieu et laver colonies avec 2 ml de PBS. </li><li> Retirer du PBS et les incuber avec 0,5 ml par puits de la collagénase IV chaud à 1 mg / ml pendant 10 min à 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Recueillir des fragments de colonies dans 2 ml nouveau PM et centrifuger à 115 g pendant 3 min. </li></ol></li><li> Alternativement, les colonies peuvent être repiquées mécaniquement par grattage: <ol><li> Éliminer le milieu et laver colonies avec 2 ml de PBS. </li><li> Gratter manuellement colonies à l&#39;aide de l&#39;outil rouleau racleur STEMPRO EZPassage (figure 1B). </li><li> Recueillir des fragments de colonies et centrifuger ensuite pendant 3 min à 115 xg pour éliminer le surnageant. </li><li> fragments de plaque sur γHFF ou les traitent de différenciation en corps embryoïdes (EBS). </li></ol></li></ol> 2. Différenciation des CSE humainesProtocole <ol><li> Préparer le milieu de différenciation (DM) à l&#39;aide Knockout milieu DMEM additionné de 2% de sérum de Hyclone, 1,0% MEM non-acides aminés essentiels, 1,0% de L-glutamine 200 mM, 1% de pénicilline-streptomycine, 3,5 ul β-mercaptoéthanol. </li><li> Éliminer le milieu et laver colonies avec 2 ml de PBS. </li><li> Formation EB de fragments de colonies en suspension: <ol><li> Retirer du PBS et les incuber avec 0,5 ml par puits de la collagénase IV chaud à 1 mg / ml pendant 10 min à 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Recueillir des fragments de colonies dans 2 ml nouveau DM et centrifuger à 115 g pendant 3 min. </li><li> Culture en suspension dans les ultra-faible attachement des plaques de 6 puits (2 ml par puits) pendant 4 jours (figure 1C). </li><li> Recueillir et plaquer les EB nouvellement formés sur 0,1% revêtues de gélatine 24 puits plaques (environ 3 EB / puits) (figure 1D). </li></ol></li><li> Sinon, forcé agrégation de cellules uniques en EB en utilisant la plaque Aggrewell: <ol><li> Retirer du PBS etdissocier colonies en cellules individuelles en utilisant Accutase (0,5 ml / puits). </li><li> Centrifuger les cellules et remettre en suspension dans DM à 1,2 x 10 6 / ml. </li><li> Ajouter 2 ml par chambre Aggrewell pour 1 jour (figure 1B). </li><li> Recueillir EB nouvellement formées (figure 1C ») et de la plaque sur les 0,1% des plaques à 24 puits revêtues de gélatine (environ 3 EB / puits). </li><li> Changer DM tous les 2-3 jours jusqu&#39;à l&#39;apparition de battre des grappes de cardiomyocytes (15-30 jours). </li></ol></li></ol> 3. Air-liquide cultures 3D de battant Clusters et marquage avec HNPs <ol><li> Identifier et manuellement disséquer grappes de cardiomyocytes battant (figure 1D), apparaissant normalement après 2-4 semaines de culture, à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur fortement réduit allongée. </li><li> Dépôt 4 filtres de PTFE par insert qui seront placés sur une plaque à 6 puits (figure 1F). </li><li> Ajouter 1 ml de milieu de DM sur le dessus de l&#39;EACh bien. </li><li> Ajouter une grappe disséqué battre sur chaque filtre PTFE (figure 1E), 4/well maximale, soit 24 agrégats par plaque (figure 1F). </li><li> Changer le milieu de DM tous les 2-3 jours. </li><li> Pour marquer les grappes, retirez le filtre PTFE contenant la grappe battant et le mettre sur 3,5 cm verre plat inférieur (170 um d&#39;épaisseur). </li><li> Ajouter 1 ml de SNP à une concentration de 50 ug / ml pendant 30 min. </li></ol> 4. Imagerie optique non linéaire <ol><li> La préparation des échantillons. Après marquage de la PNH (voir l&#39;étape 3.6), transférer soit entiers de différenciation début HeBS ou des groupes de battement cardiaque (disséqués en cas d&#39;apparition de contraction) sur des filtres en PTFE sur un plat à fond de verre de 170 um d&#39;épaisseur compatible avec la distance de travail des objectifs de grande ouverture numérique. Alternativement, appliquer une couche directe de battre grappes au plat à fond de verre pré-revêtu avec 0,1% de gélatine. </li><li> échantillons de transfert à untout-en-un microscope équipé d&#39;incubation chambre assurant une température stable, de l&#39;humidité et de CO 2 contrôle sur de longues périodes de temps. </li><li> Après l&#39;inspection initiale, l&#39;image de l&#39;échantillon par l&#39;imagerie à grand champ sous éclairage en lumière blanche d&#39;identifier les structures d&#39;intérêt dans EB différenciés ou des groupes de battement actifs qui seront sélectionnés pour des examens complémentaires. </li><li> Si autofluorescence cellulaire de NADH et SH de HNPs doivent être acquises simultanément, définissez une longueur d&#39;onde plus courte d&#39;excitation laser (c. 720 nm) pour correspondre à l&#39;absorption moléculaire. Utiliser une étroite passe-bande filtre spectral centré sur la moitié de la longueur d&#39;onde d&#39;excitation (c.-à λ = 360 ± 10 nm) afin de détecter SH, et l&#39;autre pour détecter des auto-fluorescence. </li><li> Effectuer d&#39;abord une faible résolution rapide, balayage tridimensionnel pour reconstruire la morphologie globale de la grappe cardiaque et sélectionner un plan d&#39;image dans le volume de la grappe avec plusieurs PNH visibles. </li><li> Si nécessaire, changer la longueur d&#39;onde d&#39;excitation librement pour correspondre au mieux les propriétés optiques de l&#39;échantillon ou pour éviter photoblanchiment, des dommages de photo et à l&#39;image plus profondément dans les tissus avec une longueur d&#39;onde infrarouge (c&#39;est à dire, 790 nm) et remplacer le second filtre harmonique en conséquence (c.-à 395 nm ). Optimiser les paramètres de l&#39;impulsion laser de pré-compression à la longueur d&#39;onde de fonctionnement de choix en maximisant le signal de second harmonique de HNPs déposées sur l&#39;échantillon. </li><li> Pour suivre en temps réel les contractions cardiaques munitions, mettre le lecteur optique du microscope dans le mode le plus rapide tel que le mode de résonance, permettant l&#39;acquisition à grande vitesse d&#39;images en deux dimensions. </li><li> Choisissez les paramètres que le meilleur compromis entre le contraste d&#39;image et la vitesse d&#39;acquisition, tels que: <ul type="disc"><li> Moyenne de numérisation: 4 </li><li> Pixel temps de séjour: 0,1 microsecondes </li><li> Taux d&#39;image: 3,75 images par seconde (ips) </li></ul></li><li> Puissance du laser est ajustée en fonction de tache focale siser et la vitesse de balayage. 50 mW (mesurée à l&#39;entrée de l&#39;objectif) est une valeur typique de 0,1 microsecondes pixel temps de séjour et le Plan APO 20X NA 0,75 objectif la préservation de la viabilité des cellules. </li></ol> 5. Analyse de l&#39;image <ol><li> Procédure de calibrage axial. Sélectionnez une seule PNH déposé sur un substrat nu. Ajuster la mise au point (c&#39;est à dire la position axiale de la nanoparticule) pour maximiser l&#39;intensité du SH. Faire varier de manière contrôlée la position axiale de la platine du microscope afin d&#39;obtenir la courbe d&#39;étalonnage reliant l&#39;intensité de SH en tant que fonction de la PNH décalé par rapport au plan focal. Le résultat de cette procédure d&#39;étalonnage pour le plan d&#39;APO 0,75 objectif 20X NA est rapporté sur la figure 4C. </li><li> Sélectionnez HNPs présents dans toutes les images de la vidéo et de déterminer leurs mouvements périodiques. Cette procédure peut être facilement automatisée, par exemple par un code personnalisé à la recherche de points d&#39;intensité maximum de signal dans une région d&#39;intérêt définie etles reliant entre les différents cadres (un exemple de code écrit en Matlab R2009 b en utilisant la fonction &#39;région&#39; accessoires de la boîte à outils de traitement d&#39;image est présentée). </li><li> Évaluer la quantification des déplacements hors-plan, associés à HNPs non-permanence traçables déplaçant le long de l&#39;axe optique, en convertissant leurs modulations d&#39;intensité tout au long de différents cadres en déplacement axial en utilisant la courbe d&#39;étalonnage établie à l&#39;étape 5.1. A noter que ce procédé donne accès à des mouvements axiaux, mais ne peut pas être utilisé pour déterminer la direction absolue (vers le haut ou vers le bas). </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

L&#39;application de la nanotechnologie à la recherche de cellule souche est relativement nouveau mais en pleine expansion domaine. Comme le souligne divers articles de revue sur le sujet, l&#39;utilisation de nanoparticules peut être appliqué pour accomplir des tâches de recherche différents, allant de la cellule de suivi (à la fois in vitro et in vivo), pour la délivrance intracellulaire de protéines et de gènes, notamment la création d&#39; environnements cellulaires biomimétiques pour la stimulat...

Systèmes de microscopie non linéaire, grâce à leurs trois capacités inhérentes de coupes dimensions, sont de plus déclenché la demande de fluorophores avec des bandes d&#39;absorption à deux photons photo-stable dans le proche infrarouge. Seulement dans les deux dernières années, afin de compléter le développement de labels basés sur la fluorescence (colorants, les points quantiques, jusqu&#39;à conversion nanoparticules), une méthode d&#39;imagerie différente a été exploite l&#39;utilisation d&#39;une nouvelle famille de nanoparticules intrinsèquement non linéaires comme des étiquettes, à savoir nanoparticules harmoniques (de HNPs) qui ont été spécifiquement développés pour la microscopie multi-photons. Ces étiquettes, à base de cristaux non-centrosymétriques inorganiques, exercent contraste optique générant le SH de la fréquence d&#39;excitation: par exemple en convertissant une fraction de la lumière d&#39;excitation pulsée dans le proche infrarouge (λ = 800 nm) en lumière bleue visible (λ / 2 = 400 nm) . Plusieurs auteurs dans le passé récent ont testé différents matériaux, y compris iodate de fer Fe (IO <sub&gt; 3) 3 1, le niobate de potassium (KNbO 3) 2, le niobate de lithium (LiNbO 3) 3, du titanate de baryum (BaTiO 3) 4,5, phosphate de potassium titanyle (KTiOPO4, KTP) 6-8, et de l&#39;oxyde de zinc (ZnO ) 5,9,10. Par rapport à des sondes fluorescentes, HNPs possèdent une série de propriétés intéressantes, telles que l&#39;absence complète de blanchiment et clignotant, des bandes d&#39;émission étroites, l&#39;excitation d&#39;onde accordabilité (de l&#39;ultraviolet à l&#39;infrarouge), la capacité de récupération de l&#39;orientation, et la réponse optique cohérente. Ces propriétés uniques ont été récemment expliqué dans deux articles de synthèse complet 11,12. La possibilité de travailler dans le domaine spectral infrarouge, ce qui augmente la profondeur d&#39;imagerie en réduisant au minimum la diffusion et l&#39;absorption, limite également considérablement la dégradation de l&#39;échantillon photo 13,14. En outre, le signal infiniment de photo-stable garanti par HNPs fait des sondes idéales pour le suivi des cellules à long terme, qui is particulièrement attrayant pour des applications en médecine régénérative 15. Dans cette expérience visualisée, les informations de protocole sont fournies pour le marquage in vitro de cellules souches embryonnaires humaines (hESC) avec HNPs non fonctionnalisés. La synthèse et la préparation des suspensions colloïdales est détaillée dans une publication précédente et dans les références qui y sont 16 et est au-delà de la portée de ce travail. Méthodologies d&#39;enquête sur les CSEh par microscopie multi-photons et leur différenciation en grappes cardiaques (maintenues comme cultures de l&#39;air liquide à long terme) sont présentés. ESC humain peut être laissé à la différence dans les corps embryoïdes dits (EBS) de deux façons différentes, soit par la formation EB de fragments de colonies en suspension ou, à défaut, forcés agrégation de cellules individuelles dans EB utilisant la plaque Aggrewell, comme illustré sur la figure 1A . mise en culture de battre des amas de cellules cardiaques de polytétrafluoroéthylène (PTFE) filtres poreux facilitates leur maintien à long terme pour d&#39;autres études (par exemple des mesures électrophysiologiques de potentiels d&#39;action). La source du microscope à balayage d&#39;excitation doit être capable de délivrer des impulsions ultracourtes (avec une durée d&#39;impulsion inférieure à 300 fs à l&#39;échantillon) pour atteindre la puissance crête nécessaire pour effectuer l&#39;imagerie de seconde harmonique de HNPs. Par exemple, le fs-source la plus courante utilisée pour l&#39;imagerie sont accordable Ti: saphir lasers. Alternativement, d&#39;autres lasers ultrarapides peuvent être utilisés, par exemple l&#39;erbium ion 17, chrome forstérite 18 ou Ti: saphir pompé infrarouges oscillateurs paramétriques optiques. Le microscope peut être équipée d&#39;un objectif avec de préférence une ouverture numérique relativement élevée. Très important, avant les mesures, et à chaque fois que l&#39;objectif est remplacé, il est impératif de réduire au minimum la dispersion présente dans la configuration (lentilles) en optimisant les paramètres de l&#39;impulsion laser de pré-compresseur au travaillongueur d&#39;onde de choix. Ce procédé, décrit dans le protocole, en sorte que l&#39;impulsion laser soit aussi proche que possible de la transformer durée limitée (c&#39;est à dire la plus courte que possible) dans le plan focal et à optimiser la réponse de l&#39;échantillon non linéaire. L&#39;objectif de l&#39;analyse d&#39;image décrite à la fin du protocole est d&#39;identifier et de suivre les mouvements en 3D HNPs associés aux contractions rythmiques de battre grappes cardiaques. Nanoparticules de suivi dans le plan de l&#39;image est tout simplement réalisé en identifiant leurs positions dans des images vidéo successives. Pour extraire des informations sur le déplacement axial, un étalonnage préalable de la réponse non linéaire de l&#39;intensité en fonction du déplacement axial est obligatoire. Notez que pour les mesures à long terme, un contrôle interférométrique actif de la position axiale de l&#39;échantillon est nécessaire pour maintenir la validité de la courbe d&#39;étalonnage en présence de dérives thermiques et / ou mécaniques. Les HNPs utilisés ici pour traccellules e battant dans les agrégats sont basés sur l&#39;oxyde de potassium de niobate (KNbO 3), mais d&#39;autres nanomatériaux non linéaires disponibles sont examinés en détail dans l&#39;ouvrage de Staedler et al 16. Les rendements optiques non linéaires de la plupart des nanomatériaux étudiés à ce jour sont très comparables. Le choix de KNbO 3 est essentiellement motivé par la bonne stabilité de la solution colloïdale et sa bonne biocompatibilité, testé sur plusieurs lignées de cellules humaines, même à concentration relativement élevée et des temps d&#39;exposition longs 16. Compte tenu de la nouveauté du nanomatériau utilisé pour ce travail, les principales caractéristiques de HNPs que par rapport à / luminescents bio-marqueurs fluorescents sont présentés dans une animation vidéo de l&#39;ordinateur d&#39;origine à court réalisé par les auteurs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1008">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Microscope Incubator</td>
			<td style="width:231px;">OKO LAB</td>
			<td style="width:205px;">UNO package (top stage)</td>
			<td style="width:343px;">&#160;37&#176;C, 5% CO2, moisturized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="2" style="height:64px;width:231px;">Multiphoton microscope</td>
			<td rowspan="2" style="width:231px;">Nikon</td>
			<td rowspan="2" style="width:205px;">AR1-MP</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:343px;">Fast scanning, four non photomultiplier descanned detectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="3" style="height:64px;width:231px;">Filters SHG and autofluorescence</td>
			<td rowspan="3" style="width:231px;">Semrock</td>
			<td style="width:205px;">FF01-360/12-25</td>
			<td rowspan="3" style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">FF01-395/11-25&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:205px;">FF02-485/20-25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="3" style="height:64px;width:231px;">Microscope objectives</td>
			<td rowspan="3" style="width:231px;">Nikon</td>
			<td style="width:205px;">CFI Plan Fluor 10x</td>
			<td style="width:343px;">NA 0.30, WD 16 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">CFI Plan Apo 20x</td>
			<td style="width:343px;">NA 0.75, WD 1.0 mm, VC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:205px;">CFI Apo 40x</td>
			<td style="width:343px;">NA 1.25, WD 0.18mm &#955;S, Nano-Crystal Coat</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:231px;">Rhock inhibitor&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Sigma</td>
			<td style="width:205px;">Y-27632</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:231px;">Knockout DMEM</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">10829</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Knockout Serum&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">10828</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">MEM Non-Essential Amino Acids&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">1140</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">L-glutamine 200mM&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">25030</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">15140</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">&#946;-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Sigma</td>
			<td style="width:205px;">M7522</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Collagenase IV&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:205px;">17104-019</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Roller scraper tool&#160;</td>
			<td style="width:231px;">StemPro EZPassage, Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">23181-010</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">StemPro Accutase&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:205px;">S11105-01</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Aggrewell system&#160;</td>
			<td style="width:231px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:205px;">27845</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Hyclone serum&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:205px;">SH30070.03</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Gelatin</td>
			<td style="width:231px;">Sigma</td>
			<td style="width:205px;">G9391</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">6-well plates&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Falcon</td>
			<td style="width:205px;">353046</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">24-well plates&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Nunclon</td>
			<td style="width:205px;">142475</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:231px;">Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters</td>
			<td style="width:231px;">Millipore&#160;</td>
			<td style="width:205px;">NA76/25</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Inserts</td>
			<td style="width:231px;">Millipore</td>
			<td style="width:205px;">PICM03050</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harmonic nanoparticles for regenerative research

Dans cette expérience visualisée, les informations de protocole sont fournies pour le marquage in vitro de cellules souches embryonnaires humaines (hESC) avec des nanoparticules de seconde génération harmonique (HNPs). Ces derniers sont une nouvelle famille de sondes introduites récemment pour l&#39;étiquetage des échantillons biologiques pour l&#39;imagerie multi-photonique. HNPs sont capable de doubler la fréquence de la lumière d&#39;excitation par le processus optique non linéaire de génération de seconde harmonique sans restriction sur la longueur d&#39;onde d&#39;excitation. Multi-photon méthodes de différenciation des CSEh en grappes cardiaques (maintenues comme cultures de l&#39;air liquide longue durée) en fonction sont présentés en détail. En particulier, les données sur la façon de maximiser la seconde harmonique (SH) émission intense de HNPs isolés pendant le suivi 3D de battre le tissu cardiaque en 3D s&#39;affiche. L&#39;analyse des images obtenues à récupérer des modèles de déplacement 3D est également détaillée.

Avant l&#39;évaluation de l&#39;activité de battements par imagerie confocale, une caractérisation soigneuse de la réponse optique non linéaire des filtres en PTFE a été effectuée, soit seul, soit en présence d&#39;HNPs à forte concentration (1 mg / ml). On a veillé à ce que: i) le substrat nu fluorescence à deux photons excités est très faible et ne peut pas empêcher la mesure des échantillons biologiques pertinents, et ii) l&#39;émission de SH de HNPs isolé peut être facilement acquis par imagerie ...

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Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Détails du Protocole sont prévus pour l&#39;étiquetage des cellules souches in vitro d&#39;embryons humains à des nanoparticules deuxième engendrent des harmoniques. Méthodologies d&#39;enquête sur les CSEh par microscopie multi-photons et leur différenciation en grappes cardiaques sont également présentés.

Harmonique nanoparticules régénératrice recherche

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.2K vues.  University of Geneva.  Détails du Protocole sont prévus pour l'étiquetage des cellules souches in vitro d'embryons humains à des nanoparticules deuxième engendrent des harmoniques. Méthodologies d'enquête sur les CSEh par microscopie multi-photons et leur différenciation en grappes cardiaques sont également présentés. 

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Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively for tissue regeneration, a number of variables must be taken into account. These variables include: the total volume and surface area of the implantation site, the mechanical properties of the tissue and the tissue microenvironment, which includes the amount of vascularization and the components of the extracellular matrix. Therefore, the materials being used to deliver these cells must be biocompatible with a defined chemical composition while maintaining a mechanical strength that mimics the host tissue. These materials must also be permeable to oxygen and nutrients to provide a favorable microenvironment for cells to attach and proliferate. Chitosan, a cationic polysaccharide with excellent biocompatibility, can be easily chemically modified and has a high affinity to bind with in vivo macromolecules4-5. Chitosan mimics the glycosaminoglycan portion of the extracellular matrix, enabling it to function as a substrate for cell adhesion, migration and proliferation. In this study we utilize chitosan in the form of microspheres to deliver adipose-derived stem cells (ASC) into a collagen based three-dimensional scaffold6. An ideal cell-to-microsphere ratio was determined with respect to incubation time and cell density to achieve maximum number of cells that could be loaded. Once ASC are seeded onto the chitosan microspheres (CSM), they are embedded in a collagen scaffold and can be maintained in culture for extended periods. In summary, this study provides a method to precisely deliver stem cells within a three dimensional biomaterial scaffold.

A major hurdle in current stem cell therapies is determining the most effective method to deliver these cells to host tissues. Here, we describe a chitosan-based delivery method that is efficient and simple in approach, while allowing adipose-derived stem cells to maintain their multipotency.

Construction d&#39;un hydrogel de collagène pour la prestation de souches microsphères Cell-chargé Chitosan

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively ...

Recherche

Bio-ingénierie

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Les nanoparticules virales pour<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des tumeurs

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticles for Multimodal Molecular Imaging Applications

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, complementary imaging techniques. These imaging agents facilitate the real-time assessment of pathways and mechanisms in vivo, which enhance both diagnostic and therapeutic efficacy. This article presents the protocol for the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles (PB NPs) - a novel class of agents for use in multimodal, molecular imaging applications. The imaging modalities incorporated in the nanoparticles, fluorescence imaging and magnetic resonance imaging (MRI), have complementary features. The PB NPs possess a core-shell design where gadolinium and manganese ions incorporated within the interstitial spaces of the PB lattice generate MRI contrast, both in T1 and T2-weighted sequences. The PB NPs are coated with fluorescent avidin using electrostatic self-assembly, which enables fluorescence imaging. The avidin-coated nanoparticles are modified with biotinylated ligands that confer molecular targeting capabilities to the nanoparticles. The stability and toxicity of the nanoparticles are measured, as well as their MRI relaxivities. The multimodal, molecular imaging capabilities of these biofunctionalized PB NPs are then demonstrated by using them for fluorescence imaging and molecular MRI in vitro.

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

Biofunctionalized bleu de Prusse nanoparticules pour l&#39;imagerie moléculaire multimodale Applications

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Solide Lipid nanoparticules (SLN) Applications pour le ciblage intracellulaire

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Corrélative Light- et Microscopie électronique Utilisation de Quantum Dot Nanoparticules

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.2. Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart3. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact4. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

In these studies, we provide methodology for novel, neonatal, murine cardiac scaffolds for use in regenerative studies.

Néonatale cardiaque Echafaudages: Matrices nouveaux pour Études régénératives

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

Production de nanoparticules métalliques par laser-ablation pulsée dans les liquides: un outil pour étudier les propriétés antibactériennes des nanoparticules

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

20 mJ, 1 ps Yb:YAG Thin-disk Regenerative Amplifier

This is a report on a 100 W, 20 mJ, 1 ps Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier. A homemade Yb:YAG thin-disk, Kerr-lens mode-locked oscillator with turn-key performance and microjoule-level pulse energy is used to seed the regenerative chirped-pulse amplifier. The amplifier is placed in airtight housing. It operates at room temperature and exhibits stable operation at a 5 kHz repetition rate, with a pulse-to-pulse stability less than 1%. By employing a 1.5 mm-thick beta barium borate crystal, the frequency of the laser output is doubled to 515 nm, with an average power of 70 W, which corresponds to an optical-to-optical efficiency of 70%. This superior performance makes the system an attractive pump source for optical parametric chirped-pulse amplifiers in the near-infrared and mid-infrared spectral range. Combining the turn-key performance and the superior stability of the regenerative amplifier, the system facilitates the generation of a broadband, CEP-stable seed. Providing the seed and pump of the optical parametric chirped-pulse amplification (OPCPA) from one laser source eliminates the demand of active temporal synchronization between these pulses. This work presents a detailed guide to set up and operate a Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier, based on chirped-pulse amplification (CPA), as a pump source for an optical parametric chirped-pulse amplifier.

A protocol for the operation of a high-energy, high-power optical parametric chirped pulse amplifier pump source based on an Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier is presented here.

20 mJ, 1 ps Yb: YAG amplificateur régénérateur à disque mince

This is a report on a 100 W, 20 mJ, 1 ps Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier. A homemade Yb:YAG thin-disk, Kerr-lens mode-locked oscillator with ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

Microtissues 3D pour thérapie régénérative Injectable et de dépistage des drogues de haut débit

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation purposes. The process to generate such tissues is complex, and includes an appropriate combination of specific cell types, scaffolds, and physical or biochemical stimuli to guide cell growth and differentiation. Microcarriers represent an appealing tool to expand cells in a three-dimensional (3D) microenvironment, since they provide higher surface-to volume ratios and mimic more closely the in vivo situation compared to traditional two-dimensional methods. The vascular system, supplying oxygen and nutrients to the cells and ensuring waste removal, constitutes an important building block when generating engineered tissues. In fact, most constructs fail after being implanted due to lacking vascular support. In this study, we present a protocol for endothelial cell expansion on recombinant collagen-based microcarriers under dynamic conditions in spinner flask and bioreactors, and we explain how to determine in this setting cell viability and functionality. In addition, we propose a method for cell delivery for vascularization purposes without additional detachment steps necessary. Furthermore, we provide a strategy to evaluate the cell vascularization potential in a perfusion bioreactor on a decellularized&#160;biological matrix. We believe that the use of the presented methods could lead to the development of new cell-based therapies for a large range of tissue engineering applications in the clinical practice.

We propose a cell expansion protocol on macroporous microcarriers and their use as delivery system in a perfusion bioreactor to seed a decellularized tissue matrix. We also include different techniques to determine cell proliferation and viability of cells cultured on microcarriers. Furthermore, we demonstrate functionality of cells after bioreactor cultures.

Collagène recombinant j’ai microporteurs de Peptide pour l’Expansion des cellules et leur utilisation potentielle comme système de diffusion de cellule dans un bioréacteur modèle