著者らは、欧州のFP7研究プロジェクトNAMDIATREAM（NMP4-LA-2010から246479、http://www.namdiatream.eu）とINTERREG IVフランス - スイスNAOMIプロジェクトから部分的な資金調達を承認したいと思います。

1。文化と人間のESCの拡大<ol><li> 20％ノックアウト血清、1％MEM非必須アミノ酸、1％L-グルタミン200 mMの、1％ペニシリン - ストレプトマイシン、および3.5μlのβ-メルカプトエタノールを補充したノックアウトDMEMを含有する（PMとも呼ばれる）、細胞増殖培地を調製する。 </li><li> 8ミリリットル午後媒体に人間のESC（​​hESCの）を解凍し、DMSOを補充凍結培地を廃棄するように115×gでそれらを5分遠心する。 </li><li>解凍の際にアポトーシスを防止し、細胞生存を改善するために岩の10mM阻害剤を含むPM培地1 mLを加え（わずか24時間のインキュベーション）。 </li><li>多能性の維持のために所望の濃度（4〜10 ng / mlの）でのPMに塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を添加する。 </li><li>以前に2×10 4細胞/ cm 2の濃度で播種し、フィーダー細胞（γHFF）（ 図1A）、照射されたヒト包皮上プレートのhESC。 </li><li>毎日培地交換や、必要なときに、Cの部分を除去細長いシャープにカットし、パスツールピペットを用いて吸引により差別化を始めolonies。 </li><li>週に一度、通路コロニー酵素的に： <ol><li>培地を除去し、2ミリリットルのPBSでコロニーを洗う。 </li><li> PBSを除去し、37℃、5％CO 2で10分間、1 mg / mlのコラゲナーゼの温IVのウェルあたり0.5mlでそれらをインキュベートする。 </li><li> 3分間115×gで2ミリリットル新PMおよび遠心機でコロニーの断片を収集します。 </li></ol></li><li>代わりに、コロニーはこすることによって、機械的に継代することができる。 <ol><li>培地を除去し、2ミリリットルのPBSでコロニーを洗う。 </li><li>手動STEMPRO EZPassageローラースクレーパーツール（ 図1B）を使用してコロニーをこすり。 </li><li>コロニーの断片を収集し、上清を除去するために115×gで3分間遠心分離器。 </li><li>プレート断片γHFFまたは胚様体（EB）への分化のためにそれらを処理します。 </li></ol></li></ol> 2。人間のESC分化プロトコル<ol><li>調製ノックアウトDMEMを用いて分化培地（DM）を2％のハイクローン血清、1.0％MEM非必須アミノ酸、1.0％L-グルタミン200 mMの、1％ペニシリン - ストレプトマイシン、3.5μlのβ-メルカプトエタノールを補充した。 </li><li>培地を除去し、2ミリリットルのPBSでコロニーを洗う。 </li><li>懸濁液中のコロニーフラグメントのEB形成： <ol><li> PBSを除去し、37℃、5％CO 2で10分間、1 mg / mlのコラゲナーゼの温IVのウェルあたり0.5mlでそれらをインキュベートする。 </li><li> 3分間115×gで2ミリリットル新しいDMおよび遠心機でコロニーの断片を収集します。 </li><li> 4日間（ 図1C）超低付着6 -ウェルプレート（ウェルあたり2ml）中の懸濁液で培養して。 </li><li>収集し、0.1％ゼラチンでコーティングされた24ウェルプレート（約3のEB /ウェル）（ 図1D）に新たに形成されたEBプレート。 </li></ol></li><li>あるいは、Aggrewell板を用いてEBを単一細胞への凝集を強制。 <ol><li> PBSを削除し、をAccutase（0.5ミリリットル/ウェル）を使用して、単一細胞にコロニーを解離する。 </li><li> DMでの遠心分離と再懸濁細胞1.2×10 6 / mlで。 </li><li> 1日（ 図1B &#39;）のためAggrewell室当たり2ミリリットルを追加します。 </li><li>新たに形成されたEB（ 図1C &#39;）を収集し、0.1％ゼラチンでコーティングされた24ウェルプレート（約3のEB /ウェル）上にプレート。 </li><li>心筋細胞（15-30日）のクラスタを破っての登場まで、2〜3日ごとにDMを変更します。 </li></ol></li></ol> 3。のHNPを持つクラスタとラベリングを打つの気液3D培養物は、 <ol><li>特定し、手動で打つ心筋細胞（ 図1D）のクラスターを分析、通常は細長いシャープにカットパスツールピペットを用いて、文化の2-4週間後に現れる。 </li><li> 6ウェルプレート（ 図1F）に配置されます挿入あたりの預金4 PTFE製フィルター。 </li><li> EACの上DM培地1mlを追加H井戸。 </li><li>プレートあたりすなわち 24凝集（ 図1F &#39;）、各PTFEフィルター（ 図1E）、最大4/wellでクラスタを破って解剖さ1を追加します。 </li><li> 2〜3日ごとにDM培地を変更します。 </li><li>クラスタにラベルを付けるには、（170ミクロン厚）拍動クラスターを含むPTFEフィルターを取り外し、3.5センチガラスボトムディッシュの上に置いた。 </li><li> 30分間の50μg/ mlの濃度でHNPの1ミリリットルを加える。 </li></ol> 4。非線形光学イメージング<ol><li>サンプル調製。 HNPの標識後（ステップ3.6を参照）、高開口数対物レンズの作動距離に対応して170ミクロン厚のガラスボトムディッシュ上でのPTFEフィルター上（収縮外観上に解剖さ）は、初期HEBSまたは心臓の鼓動のクラスタを差別化のどちらか全体を転送します。代わりに、0.1％ゼラチンで予めコーティングされたガラスボトムディッシュに暴行クラスタの直接コーティングを適用します。 </li><li>への転送サンプルオールインワンの安定した温度、湿度、長期間にわたって、CO 2制御を確実にチャンバーをインキュベートを備えた顕微鏡。 </li><li>初期検査の後に、分化したEBまたはさらなる調査のために選択される活性拍動クラスター内の対象物の構造を同定するための白色光照明下での広視野画像化を介して、画像サンプル。 </li><li>セルNADHからの自家蛍光とのHNPからSHが同時に取得する必要がある場合は、分子吸収に合わせて短いレーザー励起波長（ すなわち 720 nm）を設定します。半分の励起波長を中心とする1狭帯域バンドパスフィルタを使用して、スペクトル（ すなわち 、λ= 360±10nm）をSHを検出するために、もう一つは自己蛍光を検出すること。 </li><li>まず心臓クラスタの全体的な形態を再構築し、いくつかの目に見えるHNPとクラスタボリューム内の画像平面を選択するための高速、低解像度、3次元スキャンを行うS。 </li><li>必要に応じて、最高のサンプルの光学特性に合わせて自由に励起波長を変更したり、IR波長（ すなわち 、790 nm）を有する組織に深く光退色、光損傷やイメージにを避けるために（ すなわち 、395 nmのそれに応じて第二高調波フィルターを交換）。試料上に堆積したHNPの第二高調波信号を最大化することにより、選択した動作波長のレーザーパルス予備圧縮の設定を最適化します。 </li><li>リアルタイムで心臓クラスタ収縮を監視する二次元画像の高速取得を可能にする、そのような共振モード等の最速モードで顕微鏡光学スキャナを設定する。 </li><li>画像コントラストおよび取得速度との間の最良の妥協などの設定を選択してください、のような： <ul type="disc"><li>スキャン平均：4 </li><li>画素滞留時間：0.1秒</li><li>画像レート：毎秒3.75フレーム（fps） </li></ul></li><li>レーザパワーは、焦点のに応じて調整されるIZEと走査速度。 50 MW（対物レンズの入射で測定）は、0.1秒のピクセル滞留時間、細胞生存率を維持する計画APO 20X NA 0.75目的の典型的な値である。 </li></ol> 5。画像解析<ol><li>アキシャル校正手順。ベア基板上に堆積された単一のHNPを選択します。 SH強度を最大にするために（ナノ粒子の軸方向の位置IE）ピントを合わせます。焦点面からオフセットHNPの関数としてSH強度を関連付ける較正曲線を得るために、顕微鏡ステージの軸方向位置制御された方法で変化する。プランAPO 20X NA 0.75対物について、この較正手順の出力は、 図4Cに報告されている。 </li><li>すべてのビデオフレームに存在するのHNPを選択し、その定期的な運動を決定する。この手順は、容易に定義された関心領域内の最大信号強度のスポットを求めて、カスタムコードによって、例えば、自動化することができる異なるフレーム間でこれらを接続する（画像処理ツールボックスの &#39;領域の小道具を&#39;関数を使用してbをMatlabのR2009で書かれたサンプルコードが提供されている）。 </li><li>ステップ5.1において確立された検量線を用いて軸方向の変位に異なるフレームにわたってそれらの強度変調に変換することにより、光軸に沿って移動する非連続的にトレーサブルのHNPに関連付けられた面外変位の定量化を評価する。この手順は、軸方向の動きへのアクセスを与えるが、絶対的な方向（上方または下方）を決定するために使用できないことに注意してください。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

幹細胞研究するナノテクノロジーの応用は比較的新しいが、急速に拡大する分野である。主題の種々の総説によって指摘されたように、ナノ粒子の使用は、タンパク質および遺伝子の細胞内送達には、（ インビトロおよびインビボの両方で ）追跡セルに至るまで、異なる研究タスクを達成するために適用することができる、少なくともしないの作成特定の分化経路19,...

非線形顕微鏡検査システムは、その固有の三次元セクショニング能力のおかげで、ますます近赤外における二光子吸収帯を有する光安定なフルオロフォアの需要を引き起こした。唯一ここ数年で、蛍光ベースの標識（アップコンバートナノ色素、量子ドット）の開発を補完するために、異なるイメージング手法は、ラベル、 すなわちとして本質的に非線形のナノ粒子の新規なファミリーの使用を利用してきた具体的には、ナノ粒子高調波多光子顕微鏡法のために開発されている（たHNP）。無機非中心対称の結晶に基づくこ​​れらの標識は、励起周波数のSHを生成する光学的コントラストを発揮する：近赤外パルス励起光の一部を変換することにより、例えば、可視青色光に（λ= 800 nm）を（λ/ 2 = 400 nm）を。最近の過去のいくつかの著者は、鉄、ヨウ素酸鉄（IOを含め、様々な材料をテストした<suロ&gt; 3）3 1、ニオブ酸カリウム（のKNbO 3）2、ニオブ酸リチウム（LiNbO 3）3、チタン酸バリウム（BaTiO 3）4,5、チタン酸リン酸カリウム（KTiOPO4、KTP）6-8、および酸化亜鉛（ZnO ）5,9,10。蛍光プローブと比較すると、たHNPは、漂白の完全な欠如などの魅力的な性質、および点滅、狭い発光バンド（紫外から赤外まで）、励起波長の可変性、オリエンテーション検索機能、コヒーレント光学応答のシリーズを持っている。これらのユニークな特性は、最近2包括的なレビュー論文11,12で説明した。散乱及び吸収を最小にすることによって、撮像深さを増加させる赤外スペクトル領域で作業する可能性も大幅に試料光分解13,14を制限する。また、のHNPにより保証無限の光安定した信号は、I、長期的な細胞の追跡のための理想的なプローブになる特に再生医療アプリケーション15を訴えよ。 この可視化実験では、プロトコルの詳細は、非官能化のHNPを有するヒト胚性幹細胞（hESC）をインビトロで標識するために設けられている。コロイド懸濁液の合成と製造は、以前の出版物およびその中の参考文献16に詳述されてこの仕事の範囲を超えています。 （長期的な空気液体培養として維持）心臓クラスタに多光子顕微鏡法およびその分化によるヒトES細胞の研究のための方法論を提示する。ヒトESCは、懸濁液中のコロニー断片のEBの形成によって、または図1Aに示すように、代替的に、Aggrewell板を用いたEBへの単一細胞の凝集を強制いずれか二つの異なる方法で、いわゆる胚様体（EB）内で分化するようにさせことができる（PTFE）、ポリテトラフルオロエチレンで心臓細胞の拍動クラスターを培養多孔質フィルタファク（活動電位の例電気生理学的測定のための）さらなる研究のための長期的なメンテナンスをilitates。 走査顕微鏡の励起源のHNPは、第二高調波イメージングを実行するのに必要なピークパワーを達成するために、（サンプル300フェムト秒より小さいパルス持続時間を有する）超短パルスを送達することができるべきである。例えば、画像化に使用される最も一般的なFSECソースは、調整可能なTiは以下のとおりです。サファイアレーザー。サファイアポンピング赤外線光パラメトリック発振器：あるいは、他の超高速レーザは、インスタンスエルビウムイオン17、クロムフォルステ18またはTiのために用いることができる。顕微鏡は、好ましくは、かなり高い開口数の対物レンズを装備することができる。非常に重要なことは、測定に先立って、及び対物が交換されるたびに、現用のレーザパルス予備圧縮器の設定を最適化することにより、セットアップ（レンズ）における分散を最小に存在することが必須である選択した波長。この手順は、プロトコルの詳細は、レーザパルスは焦 ​​点面におけるフーリエ限られた期間（ すなわち、最短のような）にできるだけ近く、試料非線形応答を最大にすることを保証する。 プロトコルの最後に記載された画像解析の目的は、特定し、心臓のクラスタを破ってのリズミカルな収縮に関連した3次元のHNPの動きに追従することです。像平面内のトラッキングナノ粒子は、単に、連続する動画フレーム内の位置を識別することによって実現される。軸方向の動きの情報を抽出するために、軸方向変位の関数として非線形強度応答の事前のキャリブレーションが必須です。長期的な測定のために、試料の軸方向位置の能動光干渉制御は、熱および/または機械的なドリフトの存在下での検量線の有効性を維持するために必要であることに留意されたい。 Tracのためにここに使用されるのHNP集計以内に電子破っ細胞は、ニオブ酸カリウム酸化物（のKNbO 3）に基づいていますが、他の利用可能な非線形ナノ材料はStaedler ら 16の研究で詳細に検討される。 これまでに調査し、ナノ材料のほとんどの非線形光学効率が非常に匹敵する。のKNbO 3のための選択は、基本的にコロイド溶液でも、かなり高濃度と長い博覧時間16で、いくつかのヒトの細胞系でテストされ、その優れた生体適合性の良好な安定性によって動機づけられた。 この作業のために使用ナノ材料の新規性を考えると、蛍光/発光のバイオマーカーに比べてのHNPの主な特徴は、著者が実現短い元のコンピュータビデオアニメーションで表示されます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1008">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Microscope Incubator</td>
			<td style="width:231px;">OKO LAB</td>
			<td style="width:205px;">UNO package (top stage)</td>
			<td style="width:343px;">&#160;37&#176;C, 5% CO2, moisturized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="2" style="height:64px;width:231px;">Multiphoton microscope</td>
			<td rowspan="2" style="width:231px;">Nikon</td>
			<td rowspan="2" style="width:205px;">AR1-MP</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:343px;">Fast scanning, four non photomultiplier descanned detectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="3" style="height:64px;width:231px;">Filters SHG and autofluorescence</td>
			<td rowspan="3" style="width:231px;">Semrock</td>
			<td style="width:205px;">FF01-360/12-25</td>
			<td rowspan="3" style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">FF01-395/11-25&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:205px;">FF02-485/20-25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="3" style="height:64px;width:231px;">Microscope objectives</td>
			<td rowspan="3" style="width:231px;">Nikon</td>
			<td style="width:205px;">CFI Plan Fluor 10x</td>
			<td style="width:343px;">NA 0.30, WD 16 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">CFI Plan Apo 20x</td>
			<td style="width:343px;">NA 0.75, WD 1.0 mm, VC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:205px;">CFI Apo 40x</td>
			<td style="width:343px;">NA 1.25, WD 0.18mm &#955;S, Nano-Crystal Coat</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:231px;">Rhock inhibitor&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Sigma</td>
			<td style="width:205px;">Y-27632</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:231px;">Knockout DMEM</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">10829</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Knockout Serum&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">10828</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">MEM Non-Essential Amino Acids&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">1140</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">L-glutamine 200mM&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">25030</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">15140</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">&#946;-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Sigma</td>
			<td style="width:205px;">M7522</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Collagenase IV&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:205px;">17104-019</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Roller scraper tool&#160;</td>
			<td style="width:231px;">StemPro EZPassage, Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">23181-010</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">StemPro Accutase&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:205px;">S11105-01</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Aggrewell system&#160;</td>
			<td style="width:231px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:205px;">27845</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Hyclone serum&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:205px;">SH30070.03</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Gelatin</td>
			<td style="width:231px;">Sigma</td>
			<td style="width:205px;">G9391</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">6-well plates&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Falcon</td>
			<td style="width:205px;">353046</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">24-well plates&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Nunclon</td>
			<td style="width:205px;">142475</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:231px;">Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters</td>
			<td style="width:231px;">Millipore&#160;</td>
			<td style="width:205px;">NA76/25</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Inserts</td>
			<td style="width:231px;">Millipore</td>
			<td style="width:205px;">PICM03050</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harmonic nanoparticles for regenerative research

この可視化実験では、プロトコルの詳細は、第二高調波発生ナノ粒子（のHNP）を用いてヒト胚性幹細胞（hESC）のインビトロでの標識化のために設けられている。後者は最近、多光子イメージングのための生物学的サンプルを標識するために導入されたプローブの新しいファミリーである。 HNPは、励起波長に制限なく第二高調波発生の非線形光学過程により励起光の周波数を2倍にすることができる。 心臓クラスタ（長期的な気液培養として維持されている）へのhESC分化のための多光子ベースの方法論が詳細に提示されています。具体的には、3Dで心臓組織を破っての3次元監視中に孤立のHNPの強烈な第二高調波（SH）排出量を最大化する方法についての証拠が示されている。 3D変位パターンを取得する結果の画像の分析も詳述されている。

共焦点イメージングによる叩解活性を評価する前に、PTFEフィルタの非線形光学応答の慎重な特徴付けは、単独で、または高濃度（1 mg / ml）でのHNPの存在下でのいずれかで実施した。 I）ベア基板2光子励起蛍光は非常に弱く、関連する生物学的サンプルを測定防ぐことはできないと、ii）単離されたHNPからのSH発光を容易にエピ検出モードで基板を介して画像化することで取得することができ?...

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Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

プロトコルの詳細は、 インビトロ第二高調波発生ナノ粒子でヒト胚性幹細胞を標識するために設けられている。多光子顕微鏡および心臓のクラスタへの分化によるヒトES細胞の研究のための方法論も提示されています。

回生研究ハーモニックナノ粒子

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

harmonic-nanoparticles-for-regenerative-research

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.2K ビュー.  University of Geneva. プロトコルの詳細は、 インビトロ第二高調波発生ナノ粒子でヒト胚性幹細胞を標識するために設けられている。多光子顕微鏡および心臓のクラスタへの分化によるヒトES細胞の研究のための方法論も提示されています。 

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Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively for tissue regeneration, a number of variables must be taken into account. These variables include: the total volume and surface area of the implantation site, the mechanical properties of the tissue and the tissue microenvironment, which includes the amount of vascularization and the components of the extracellular matrix. Therefore, the materials being used to deliver these cells must be biocompatible with a defined chemical composition while maintaining a mechanical strength that mimics the host tissue. These materials must also be permeable to oxygen and nutrients to provide a favorable microenvironment for cells to attach and proliferate. Chitosan, a cationic polysaccharide with excellent biocompatibility, can be easily chemically modified and has a high affinity to bind with in vivo macromolecules4-5. Chitosan mimics the glycosaminoglycan portion of the extracellular matrix, enabling it to function as a substrate for cell adhesion, migration and proliferation. In this study we utilize chitosan in the form of microspheres to deliver adipose-derived stem cells (ASC) into a collagen based three-dimensional scaffold6. An ideal cell-to-microsphere ratio was determined with respect to incubation time and cell density to achieve maximum number of cells that could be loaded. Once ASC are seeded onto the chitosan microspheres (CSM), they are embedded in a collagen scaffold and can be maintained in culture for extended periods. In summary, this study provides a method to precisely deliver stem cells within a three dimensional biomaterial scaffold.

A major hurdle in current stem cell therapies is determining the most effective method to deliver these cells to host tissues. Here, we describe a chitosan-based delivery method that is efficient and simple in approach, while allowing adipose-derived stem cells to maintain their multipotency.

幹細胞にロードされたキトサンミクロスフェアの配信のためにコラーゲンハイドロゲルの構築

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively ...

生物工学

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

のためのウイルス粒子<emインビボ&gt;</em&gt;腫瘍イメージング

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticles for Multimodal Molecular Imaging Applications

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, complementary imaging techniques. These imaging agents facilitate the real-time assessment of pathways and mechanisms in vivo, which enhance both diagnostic and therapeutic efficacy. This article presents the protocol for the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles (PB NPs) - a novel class of agents for use in multimodal, molecular imaging applications. The imaging modalities incorporated in the nanoparticles, fluorescence imaging and magnetic resonance imaging (MRI), have complementary features. The PB NPs possess a core-shell design where gadolinium and manganese ions incorporated within the interstitial spaces of the PB lattice generate MRI contrast, both in T1 and T2-weighted sequences. The PB NPs are coated with fluorescent avidin using electrostatic self-assembly, which enables fluorescence imaging. The avidin-coated nanoparticles are modified with biotinylated ligands that confer molecular targeting capabilities to the nanoparticles. The stability and toxicity of the nanoparticles are measured, as well as their MRI relaxivities. The multimodal, molecular imaging capabilities of these biofunctionalized PB NPs are then demonstrated by using them for fluorescence imaging and molecular MRI in vitro.

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

マルチモーダル分子イメージングアプリケーションのためのBiofunctionalizedプルシアンブルーナノ粒子

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

細胞内ターゲティングアプリケーションのための固体脂質ナノ粒子（SLNs）

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

量子ドットナノ粒子を用いた相関光 - 及び電子顕微鏡

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.2. Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart3. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact4. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

In these studies, we provide methodology for novel, neonatal, murine cardiac scaffolds for use in regenerative studies.

新生児心臓足場：再生研究のための新しい行列

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

液体中のパルスレーザアブレーションによる金属ナノ粒子の生成：ナノ粒子の抗菌特性を調べるためのツール

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

20 mJ, 1 ps Yb:YAG Thin-disk Regenerative Amplifier

This is a report on a 100 W, 20 mJ, 1 ps Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier. A homemade Yb:YAG thin-disk, Kerr-lens mode-locked oscillator with turn-key performance and microjoule-level pulse energy is used to seed the regenerative chirped-pulse amplifier. The amplifier is placed in airtight housing. It operates at room temperature and exhibits stable operation at a 5 kHz repetition rate, with a pulse-to-pulse stability less than 1%. By employing a 1.5 mm-thick beta barium borate crystal, the frequency of the laser output is doubled to 515 nm, with an average power of 70 W, which corresponds to an optical-to-optical efficiency of 70%. This superior performance makes the system an attractive pump source for optical parametric chirped-pulse amplifiers in the near-infrared and mid-infrared spectral range. Combining the turn-key performance and the superior stability of the regenerative amplifier, the system facilitates the generation of a broadband, CEP-stable seed. Providing the seed and pump of the optical parametric chirped-pulse amplification (OPCPA) from one laser source eliminates the demand of active temporal synchronization between these pulses. This work presents a detailed guide to set up and operate a Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier, based on chirped-pulse amplification (CPA), as a pump source for an optical parametric chirped-pulse amplifier.

A protocol for the operation of a high-energy, high-power optical parametric chirped pulse amplifier pump source based on an Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier is presented here.

20mJ、1ps Yb：YAGシンディスク再生アンプ

This is a report on a 100 W, 20 mJ, 1 ps Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier. A homemade Yb:YAG thin-disk, Kerr-lens mode-locked oscillator with ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

注射の再生療法と高スループットの薬剤のスクリーニングのための 3 D への放射能

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation purposes. The process to generate such tissues is complex, and includes an appropriate combination of specific cell types, scaffolds, and physical or biochemical stimuli to guide cell growth and differentiation. Microcarriers represent an appealing tool to expand cells in a three-dimensional (3D) microenvironment, since they provide higher surface-to volume ratios and mimic more closely the in vivo situation compared to traditional two-dimensional methods. The vascular system, supplying oxygen and nutrients to the cells and ensuring waste removal, constitutes an important building block when generating engineered tissues. In fact, most constructs fail after being implanted due to lacking vascular support. In this study, we present a protocol for endothelial cell expansion on recombinant collagen-based microcarriers under dynamic conditions in spinner flask and bioreactors, and we explain how to determine in this setting cell viability and functionality. In addition, we propose a method for cell delivery for vascularization purposes without additional detachment steps necessary. Furthermore, we provide a strategy to evaluate the cell vascularization potential in a perfusion bioreactor on a decellularized&#160;biological matrix. We believe that the use of the presented methods could lead to the development of new cell-based therapies for a large range of tissue engineering applications in the clinical practice.

We propose a cell expansion protocol on macroporous microcarriers and their use as delivery system in a perfusion bioreactor to seed a decellularized tissue matrix. We also include different techniques to determine cell proliferation and viability of cells cultured on microcarriers. Furthermore, we demonstrate functionality of cells after bioreactor cultures.