La importancia del protocolo se basa en la señalización de membrana a núcleo y no afecta directamente al genoma, como es el caso de las células madre pluripotentes inducidas. La naturaleza no teratógena de las células madre pluripotentes derivadas de la sangre es la principal ventaja de la técnica, por lo que es adecuada para una aplicación clínica segura en diversos campos de la medicina regenerativa. Demostrando el procedimiento está la Dra. Anne-Kathrin Schott, líder del proyecto, y Oksana Greenacre, una asistente de laboratorio en mi laboratorio.
Para aislar los PBMNCs, agregue 25 mililitros de sangre uno a uno diluida con PBS a 10 mililitros de medios de gradiente de densidad y centrifume la mezcla a 300 veces G durante 30 minutos. Aísle la capa de interfaz entre el plasma y el medio de gradiente de densidad mediante pipeteo. Lave las células aisladas con cinco mililitros de PBS estéril y centrífuga a 300 veces G durante 10 minutos.
Después de repetir el procedimiento dos veces, cuente el número de celdas usando una cámara de conteo. Agregue 6 por 10 a las 6tas células mononucleares a un tubo de 15 mililitros, luego realice la reticulación de anticuerpos agregando anticuerpos específicos de la membrana ligada a GPI humana a las células en PBS con BSA al 1% e incubando durante 30 minutos a 37 grados Celsius. Después de la reticulación, reemplace el medio de incubación con el medio modificado de Dulbecco de Iscove complementado con 10% de FBS.
Cultive las células en tubos de poliestireno de 15 mililitros colocándolas en una incubadora a 37 grados Centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 8 a 10 días sin agitar. En el quinto día, agregue uno a dos mililitros adicionales del Medio de Iscove complementado con 10% de FBS a cada tubo de 15 mililitros. Cuente las células cultivadas con una cámara de conteo.
A continuación, centrifugar la suspensión celular de aproximadamente 5 por 10 a las 6 ª células a 300 veces G durante 10 minutos y aspirar el sobrenadante resultante con una pipeta Pasteur estéril. Resuspend el pellet celular en 90 microlitros de PBS preenfriado de pH 7,2 con 0,5% BSA y dos EDTA milimolares. A continuación, agregue 80 microlitros CD-45 de perlas magnéticas de tamaño nanodimensionado positivo a la suspensión celular e incube en hielo durante 15 minutos.
Para lavar las células, agregue dos mililitros de tampón de PBS y centrífuga a 300 veces G durante 10 minutos. Resuspend las células en 500 microlitros del almacenador intermediario de PBS. Lave la columna con 500 microlitros de tampón PBS preenfriado y colócalo en el campo magnético.
Coloque la suspensión de la célula en la columna y lávela dos veces con 500 microlitros de tampón PBS. Recoger las células en el medio de Iscove complementado con 1%BSA y contar las células en la cámara de recuento. Coloque las tapas de vidrio en placas de cuatro pocillos y recubrirlas con una a cinco poli-L-ornitina diluida y agua destilada doble.
Después de incubar los cubrebocas a 37 grados centígrados durante una hora, lávelos con agua destilada doble. Descongelar lentamente 0.5 a dos miligramos por mililitro de laminina y añadirlo a la parte superior de los cubrebocas. Incubarlos a 37 grados centígrados durante dos horas, luego eliminar el exceso de laminina por pipeteo y añadir el medio neuronal N2 a los platos de cultivo.
Cultivo de células CD-45 negativas derivadas de BD en medio N2 en cubrebocas de vidrio recubiertos de ornitina de laminina durante dos días en una incubadora con dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados para iniciar una diferenciación neuronal de las células recién generadas por BD. A continuación, cultivar células en medio de diferenciación neuronal y colocar las placas en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 16 días. Preparar un fijador con 75 mililitros de agua estéril y cuatro gramos de paraformacionaldehído.
Añadir 10 hidróxido de sodio normal según sea necesario con agitación hasta que la solución se despeje. Añadir la mezcla de sacarosa a la solución y valorarla a pH 7.4 con seis ácidos clorhídrico normales. Llevar el volumen a 100 mililitros con agua estéril.
Después de eliminar el medio del cultivo celular, incubarlo con fijador de preguerra durante 15 minutos, luego deseche el fijador y lave las células tres veces durante cinco minutos cada una. Inmediatamente añadir una solución recién hecha al 0,3% Triton-X y permeabilizar las células durante cinco minutos. Lavar tres veces con PBS y añadir una solución de bloqueo de PBS y 5%BSA.
Bloquee las celdas a temperatura ambiente en una placa basora durante una hora. Preparar una dilución adecuada de anticuerpos en PBS al 1%BSA e incubar las células con los anticuerpos en una placa basculante durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Lave las células tres veces con PBS durante cinco minutos por lavado.
Incubar las células con DAPI y montar las cubiertas con medios de montaje para su visualización en un microscopio. El aspecto morfológico de las células dedifferentiated de BD fue estudiado el los días uno, cinco, y 10, demostrando una tendencia de la desaparición gradual de células nonactivated y de una nueva población constantemente cada vez mayor de células en cultura activada. Las células dedifferentiated de BD eran pequeñas y demostraron las características de células agranulares no maduras con menos orgánulos y núcleos grandes con la cromatina condensada similar a ESCs.
Las células fueron estudiadas para la re-diferenciación neura después de cultivar en platos laminón-revestidos de la cultura por 30 días. Ya en cuatro días, se pudieron detectar las primeras células similares a las neuronales con largas estructuras de ramificación. La mayoría de las células esféricas pequeñas se desarrollaron en células ramificadas con formas alargadas más grandes, lo que implica un proceso activo hacia la diferenciación a linajes neuronales.
El cuerpo celular y los procesos de las células mostraron una mayor complejidad que las células indiferenciadas, presentando una alta densidad de retículo endoplásmico rugoso y haces de filamentos de actina. Las células que crecen en medios de diferenciación con frecuencia establecieron contactos de célula a célula que involucraban el cuerpo celular, mientras que otras involucraron procesos celulares de manera similar a la neurita. El análisis de inmunoquímica realizado usando los anticuerpos específicos confirmó que las células dedifferentiated de BD son capaces de la re-diferenciación hacia varios linajes neuronales, incluyendo astrocytes de GFAP.
Esta técnica permite crear células autólogas no teratógenas capaces de re-diferenciación en células de las tres capas germinales, abriendo nuevas oportunidades en la investigación de la medicina regenerativa.
