The authors are funded by the Wellcome Trust through the Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) and Programme Grant (Y.H., and R.M.M.) and Fellowship (J.R.G) funding, the BBSRC (G.C.), the American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. and R.M.M.), Asthma UK (H.J.McS.) and the Rainin Foundation (D.J.S. and R.M.M.).

NOTA: Todos los procedimientos de este protocolo se realiza de acuerdo con las directrices establecidas por el Reino Interior del Reino y de la Universidad de los Servicios Veterinarios de Edimburgo. 1. La infección de ratones por sonda <ol><li> Tienda Heligmosomoides polygyrus L3 larvas en agua destilada durante un máximo de seis meses a 4 ° C. </li><li> Antes de su uso, lavar larvas L3 tres veces en agua destilada: centrifugar a 300 xg durante 10 min (con freno), pero eliminar todos los 500 l de agua (para evitar larvas L3 granulado perturbador) y resuspender el pellet cada vez. </li><li> Para el tercer lavado, añadir agua a un volumen exacto (típicamente 40 ml) y aspirado de 20 l con un corte de punta de 200 l para ampliar su abertura. Coloque dos 20 muestras mu l sobre la superficie de una placa de cultivo de 60 mm y contar las larvas L3 (generalmente móvil, y el mejor se observa bajo magnificación 50X con un microscopio de disección). Resuspender el sedimento final en agua destilada a una concentration de 2.000 L3 larvas por ml. </li><li> Para la producción del ciclo de vida, infectar F1 (C57BL / 6xCBA) ratones 8 semanas de edad con 400 H. larvas L3 polygyrus en 200 l de agua destilada por sonda oral (restringir ratones en la posición vertical por la piel del cuello y pasar suavemente la aguja de sonda roma a través de la boca y el esófago hasta el estómago). Agitar bien antes de cada infección (larvas depositan rápidamente en agua) y aspirado de 200 l en una jeringa de 1 ml; utilizar una aguja de sonda dedicado con un extremo redondeado. Para la infección experimental de ratones más jóvenes (6-8 semanas de edad), o de otras cepas puras (por ejemplo, C57BL / 6 o BALBc), infectar a los ratones con 200 larvas L3. </li></ol> 2. Propagación y Mantenimiento de H. polygyrus <ol><li> Coloque el carbón en el centro de una gran tina de plástico y deje que el agua fría del grifo corra sobre ella durante un mínimo de 30 min (carbón activado sin lavar es tóxico para las larvas L3). Escurrir el agua de la bañera y colocar el carbón de leña en two capas de papel absorbente, dejándolo expuesto al aire ambiente hasta que esté completamente seco. </li><li> Si se necesitan huevos, raspar heces primero fuera del colon con pinzas y tijeras (si es necesario). Si se necesita un gran número de larvas L3, colocar los ratones en una rejilla de alambre y recoger bolitas fecales durante varios días. </li><li> Mezclar las heces con carbón granulado en una proporción de al menos un 1: 1, para lograr una consistencia humedad suficiente para adherirse a papel de filtro. Unte una capa delgada en el centro de un poco de papel de filtro humedecido en una placa de Petri y colocar esto en una caja húmeda (añadir un poco de toalla de papel húmeda y un plato de agua) en la oscuridad durante 12-14 días. </li><li> Eliminar larvas L3 de día 7 en adelante, y recogerlas en al menos dos ocasiones antes se descarta el papel. Las larvas forman un anillo alrededor del borde del papel de filtro; levantar el papel de filtro fuera de la placa de Petri y enjuagar las larvas que quedaron de la placa (utilizando una pipeta y 5 ml de agua estéril por placa) en un tubo de 50 ml. </li><li> Ascensoren el papel de filtro y la cosecha de las larvas restante dejado en el plato con agua destilada en un tubo de 50 ml. Centrifugar la solución efluente a 300 xg durante 10 min. Lavar las larvas tres veces con agua destilada y luego se almacena a 4 ° C en un máximo de 50 ml de agua destilada hasta que se requiera. NOTA: Las larvas permanecen viables e infecciosos durante al menos 6 meses. </li></ol> 3. Recolección de Adultos H. polygyrus Worms <ol><li> Preparar el aparato de Baermann modificado de antemano como se muestra en la Figura 1. </li><li> Ratones Cull Catorce días después de la infección. </li><li> Lavar el abdomen con etanol al 70%. Cortar la piel sobre el abdomen y tire hacia atrás para revelar la pared abdominal anterior. Haga incisión media para entrar en la cavidad peritoneal. </li><li> Eliminar todo el intestino delgado y grueso (de duodeno proximal al recto distal). Coloque en un plato de Petri seco. </li><li> Enderezar el intestino a lo largo de toda su longitud; extirpar el colon heces que contienen; colocar esto en un plato aparte para los preparados de huevo posteriores. </li><li> Escindir el proximales 20 cm de intestino delgado que contiene los gusanos adultos, identificados por la pared relativamente gruesa del duodeno y con frecuencia una apariencia de color rojo debido a los gusanos intra-luminal. Colocar en una (100 mm de diámetro) placa de Petri con 5 ml de solución de Hanks, se calentó a 37 ° C (dos especímenes por plato). </li><li> Abra la porción proximal del intestino gusano lleno longitudinalmente con tijeras (tijeras ronda terminado son los mejores para esto), y raspar el interior del intestino forro con dos láminas de vidrio para eliminar los gusanos. Luego deseche la pared del tubo digestivo limpio. </li><li> Gusanos punta en pequeñas bolsas de muselina, grapa cerradas y seguras con clips alrededor del borde del embudo de vidrio (Figura 1). </li><li> Llenar el embudo con la solución de Hanks y añadir aproximadamente 4 placas de Petri de gusanos en cada embudo. </li><li> Coloque el aparato en incubadora a 37ºC durante 1-2 horas, agitando suavemente a medio camino para desalojarresiduos de la preparación intestinal que puede ocluir el filtro de muselina. Tenga cuidado para evitar vertidos de escombros fuera de la bolsa de muselina - esto hará que la contaminación de la preparación final HES. Los gusanos adultos deberían haber emigrado lentamente a través de la tela de muselina y se instaló en la parte inferior del tubo de ensayo de vidrio. Cuidadosamente separe el tubo de ensayo de la manguera de caucho de conexión sobre el fregadero (teniendo cuidado de evitar la pérdida de gusanos en este punto). </li><li> Con una pipeta de plástico, transferir los gusanos en un tubo de 50 ml y lavar seis veces con Hanks &#39;solución (permiten gusanos se asienten con la gravedad, extraiga el soporte con un stripette, agregar 40 ml de Hanks&#39; solución y repita cinco veces). NOTA: lombricultura debe mantenerse estéril desde este punto en adelante. <ol><li> Mover a una campana de flujo laminar y lavar otras seis veces en solución estéril de Hank suplementado con 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina, listo para el cultivo in vitro. </li></ol></li><li> Cuente elgusanos adultos recuperados por la toma de dos muestras de 20 l tomadas con un corte de punta amarilla para ampliar su apertura; esperar que aproximadamente el 50% de la cantidad de larvas inoculado. </li></ol> 4. Configuración de las Culturas de HES: Preparación mediana, Lavado gusanos adultos <ol><li> Remojar los gusanos de 3,11 en aproximadamente 10 ml de RPMI suplementado con 10% de gentamicina durante 20 min, dejando el tubo de reposo en un ángulo para asegurar gusanos están completamente cubiertos. </li><li> Realice esto en una campana de flujo laminar: lavar de nuevo seis veces con solución de Hanks (suplementado con 5 U / ml de penicilina y 5 mg / ml de estreptomicina). </li><li> Preparar H. medios polygrus. </li><li> El mantenimiento de la esterilidad en una campana de flujo laminar, a 500 ml de RPMI1640, añadir 11,1 ml de 45% de glucosa (concentración final 1,2% como RPMI1640 contiene 0,2% de glucosa), 5 ml de 100x Peniclllin-estreptomicina (concentración final 5 U / ml de penicilina, 5 mg / ml de estreptomicina), 5 ml de L-glutamina (concentración final 2 mM), y5 ml de Gentamicina (concentración final 1%). No agregue FCS. </li><li> Gusanos alícuotas en frascos T25 ventilados, aprox. 1.000 gusanos en 15 ml H. polygyrus medios de comunicación por matraz, y el lugar en posición vertical en 37 ° C incubadora (5% CO 2) durante 3 semanas. </li></ol> 5. Preparación de HES <ol><li> Recoger HES contienen medios de cultivo a partir de cultivos a intervalos de no más de dos veces por semana, dejando de lado la primera colección después de 24 horas de cultivo (debido a los altos niveles de contaminación por LPS y proteínas del huésped - se puede procesar por separado o se descarta). Mantenga cada recogida selectiva y claramente etiquetado con la fecha y número de lote. Reemplace con un volumen igual de H. polygyrus medios en cada ocasión. </li><li> Centrifugar HES que contiene el medio a 400 x g durante 5 min. Luego filtrar esterilizar a través de 0,2 micras filtros baja en proteínas de unión en tubos de 50 ml. Conservar en el congelador a -20ºC claramente etiquetado con la fecha de la cosecha de gusano y la fecha de HES collection. </li><li> Después de 21 días de recolección de HES de la cultura, deseche gusanos. </li><li> Piscina 500-1.000 ml de HES sobrenadante (por lo general de madre congelada, y no como la recogida primeras 24 h) y concentrarse sobre un filtro de 3.000 MWCO en el dispositivo de ultrafiltración bajo presión de nitrógeno. NOTA: Tenga mucho cuidado de no dejar correr el filtro seco. <ol><li> Para configurar el dispositivo de filtro, lavar primero el lado brillante de la membrana 3 kDa abajo en un vaso de precipitados de 1 litro con agua destilada durante 3 x 20 min mientras se agitaba. Montar el dispositivo de ultrafiltración según las instrucciones del fabricante con membrana de filtro lado brillante hacia arriba. Lugar en el gabinete a 4 ° C y pasar 50 ml de agua destilada a través antes de comenzar a concentrarse HES agrupados. </li><li> Añadir cada tubo de HES en el dispositivo de filtración según sea necesario (100-140 ml por día), hasta que el volumen se concentró hasta 2-5 ml. </li></ol></li><li> Con el fin de eliminar los contaminantes de los medios de cultivo que contienen HES, añadir 50 ml de pyrfibrinógeno libre de PBS para el dispositivo de filtración y a continuación concentrar hasta aproximadamente 2 ml. Repita este paso dos veces (150 ml de PBS en total). Transferencia de HES en un tubo de 15 ml, esterilizar filtro (con un filtro de 0,2 micras) en una campana de flujo laminar y medir la concentración de proteína usando un espectrofotómetro (E 280 = 10) o por el ensayo de Bradford. </li><li> Alícuota, etiqueta con el número de lote y la fecha, y la congelación a -80 ° C. </li><li> Realizar un ensayo LAL cromogénico de acuerdo con los protocolos del fabricante en cada lote de HES antes de su uso. Si los niveles de LPS son mayores que 1 U LPS por 1 g de proteína, considere no utilizar este lote para experimentos in vivo o en cultivos in vitro. </li><li> Procesar las HES recogidos a las 24 horas por separado de la misma manera; Contendrá LPS y algunas proteínas del huésped y, aunque no es adecuado para experimentos funcionales, es una fuente útil de moléculas individuales que pueden ser aislados mediante purificación por afinidad de anticuerpos monoclonales. </li></ol&gt;

The authors have no conflicts of interest.

El ciclo de vida de H. polygyrus procede de una manera fiable consistente. Después de la ingestión natural o sonda oral de larvas L3 en el día 0, los quistes empiezan a formarse debajo de la serosa duodenal por día 5, progresando a mudas larvarias y luego emergiendo como gusanos adultos en el lumen intestinal a partir de 10 días, los huevos se pueden ver en las heces de días 14 y granulomas son visibles en la superficie serosa duodenal de día 21. El protocolo descrito anteriormente (y que se resumen en la Figura 6) permite la producción de alto rendimiento de H. productos polygyrus excreción-secreción (HES), además de la recuperación fiable de larvas L3 viable para futuras infecciones experimentales y su duración máxima. Infección por H. polygyrus ha demostrado ser protectora en modelos de asma dependientes de OVA o Der p 1 (ácaros del polvo doméstico alergeno) 14. Además, la supresión de la inflamación de las vías respiratorias puede ser transferido con CD4 + CD25 + </sup&gt; células T reguladoras 14 o CD19 + CD23 hi células B reguladoras 24 de no sensibilizados, H. polygyrus infectados ratones. En los modelos de autoinmunidad, H. infección polygyrus ha demostrado ser supresivo en el modelo de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) de la esclerosis múltiple 9, y la supresión puede ser transferida con células T CD4 + CD19 + o células B de ratones infectados 24. Heligmosomoides polygyrus productos de excreción-secreción (HES) modulan la respuesta inmune del huésped y suprimir la inflamación mediada por Th2 por una serie de mecanismos (descritas en la Figura 7), incluyendo: a) La inhibición de la respuesta de las células dendríticas a la estimulación 25, b) la inducción de CD4 Las células T reguladoras Foxp3 + + 18. y c) el bloqueo de IL-33 de producción 20. HES ha demostrado ser protectora cuando se administra unat sensibilización o desafío en el modelo OVA-alumbre de asma 19 y también cuando se administra por vía intranasal con alérgeno extracto de Alternaria 20, a través de la supresión de la primera liberación de IL-33. Evitar la contaminación LPS de HES es a menudo crucial para el éxito de los futuros experimentos inmunológicos. En el protocolo descrito aquí, los pasos críticos en el logro de este son asegurar que los desechos contenidos en las bolsas de muselina del Aparato Baermann no entre en la preparación HES final (véase 2.10) y dejar de lado la solución ES de las primeras 24 horas de cultivo (ver 5.1). En los últimos años, HES se ha caracterizado a fondo en el nivel proteómico con más de 370 proteínas distintas identificadas 26,27. Además, ES larvas de la cuarta etapa ha sido sometido a análisis proteómico 28. El trabajo en curso incluye la caracterización de los principales componentes de glicanos de HES, se sabe que son fuertemente inmunogénico 3, y se secreta micro-RNComo que están encapsulados en vesículas 50-100 nm o exosomas (Buck et al., Presentado para su publicación). Con el establecimiento de protocolos reproducibles para la recogida de ES de este parásito altamente inmunomodulador, y con gran cantidad de datos proteómicos que identifican los componentes moleculares de HES, el escenario está listo para la identificación y prueba terapéutica de las moléculas individuales de H. polygyrus que pueden mediar efectos fundamentales sobre el sistema inmune del huésped.

Heligmosomoides polygyrus es un helminto gastrointestinal murino natural que está estrechamente relacionado con altamente prevalentes nematodos parásitos humanos 1. En contraste con otros modelos de nematodos tales como Nippostrongylus brasiliensis, H. polygyrus establece consistentemente infección crónica en ratones como un resultado directo de múltiples mecanismos potentes inmunomoduladores que emplea para suprimir la respuesta inmune 2 host. H. polygyrus tiene un ciclo de vida directo: larvas L3 infectivas son ingeridas por la transmisión de FECO oral (o se administra por sonda oral en el laboratorio), con lo cual migran a la capa subserosa del duodeno y se enquistan antes de regresar a la luz intestinal como gusanos adultos aproximadamente ocho días después de la infección inicial. El apareamiento y producción de huevos se produce a los 10 días y es posible cosechar los gusanos adultos para la cultura y la recolección de productos de excreción-secreción de day 14 en adelante 3. H. polygyrus también interactúa con la microflora comensal, con un aumento de lactobacilos presentes en ratones susceptibles infectados 4-6, y el aumento de los niveles de H. infección polygyrus tras la exposición de ratones a los lactobacilos 6. La infección activa por H. polygyrus se ha demostrado que protege contra la inmunopatología en muchos modelos animales de autoinmunidad 7-10, colitis 11,12 y alergia 13-16. No ha habido en consecuencia un gran interés en el potencial de las moléculas excretor-secretoras de este parásito (&quot;HES&quot;) para abajo-modulan patología en vivo 17,18. De hecho, los efectos protectores se ven después del tratamiento de ratones con productos de HES 19 a través de vías que están siendo identificados 18,20. Aquí se describe un protocolo para la producción fiable de Heligmosomoides polygyrus y la recuperación de sus productos secretadosque pueden ser utilizados adicionalmente para una serie de investigaciones bioquímicas e inmunológicas funcionales.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1183">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Material Name</td>
			<td style="width:83px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:157px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Amicon concentrator</td>
			<td style="width:83px;">Millipore</td>
			<td style="width:143px;">5112</td>
			<td style="width:157px;">Model 8050 50 ml 
			http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM 
			_NF-5122</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Hanks&#8217; buffered salt solution</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">H9394</td>
			<td style="width:157px;">500 ml 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&#38;region=GB</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Penicillin streptomycin</td>
			<td style="width:83px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:143px;">15070-063</td>
			<td style="width:157px;">100 ml 
			http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:83px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:143px;">25030-081</td>
			<td style="width:157px;">200 MM 100ml 
			https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Activated charcoal</td>
			<td style="width:83px;">Merck</td>
			<td style="width:143px;">1.09624.0500</td>
			<td style="width:157px;">18-35 mesh 
			http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Glucose solution</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">G8769</td>
			<td style="width:157px;">100 ml 45% solution 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&#38;region=GB</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Falcon tubes</td>
			<td style="width:83px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:143px;">62.547.254</td>
			<td style="width:157px;">50 ml 
			http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">T25 Flasks</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">CLS430639&#160;</td>
			<td style="width:157px;">25cm vented flask 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&#38;region=GB</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Chromogenic LAL assay</td>
			<td style="width:83px;">Lonza</td>
			<td style="width:143px;">50-647U</td>
			<td style="width:157px;">QCL-1000 assay 
			http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:83px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">15710-049</td>
			<td style="width:157px;">100 ml 
			http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td>
			<td style="width:83px;">Gibco</td>
			<td align="right">11875093</td>
			<td style="width:157px;">500 ml; without L-glutamine 
			http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivation of heligmosomoides polygyrus: an immunomodulatory nematode parasite and its secreted products

Heligmosomoides polygyrus (anteriormente conocido como Nematospiroides dubius, y también referido por algunos como H. bakeri) es un helminto gastrointestinal que emplea varios mecanismos inmunomoduladores para establecer la infección crónica en ratones y se parece bastante infecciones por helmintos humanos prevalentes. H. polygyrus se ha estudiado ampliamente en el campo de la regulación inmune helmintos derivados y se ha encontrado para suprimir potentemente modelos experimentales de alergia y autoinmunidad (ambos con infección activa y productos secretados aislados). El protocolo se describe en este documento se describen la gestión de la H. ciclo de vida polygyrus para la producción constante de larvas L3, la recuperación de los parásitos adultos, y la recolección de sus productos de excreción-secreción (HES).

La susceptibilidad a la infección con H. polygyrus es controlada en gran medida por el fondo genético de la cepa de ratón (Tabla 1); Ratones C57BL / 6 y CBA son altamente susceptibles 21,22. Para el mantenimiento del ciclo de vida del parásito, el híbrido F1 entre estas dos cepas ha sido elegido por su capacidad para soportar cargas de gusano mucho más altas sin la morbilidad (daño epitelial intestinal excesiva) en comparación con cualquiera cepa parental. Sonda oral de 400 larvas L3 se utiliza para mantener el ciclo de vida en ratones F1 (que resulta en la carga de helmintos adultos que se muestran en la Figura 2), mientras que una dosis de 200 larvas L3 se utiliza generalmente para los experimentos en cepas puras homocigotos (por ejemplo, C57BL / 6 o BALBc). Sin embargo, puede ser necesario reducir la función de co-factores ambientales que pueden diferir entre las instalaciones de animales, tales como las variaciones en la flora intestinal esta dosis. Los lotes de HES han demostrado efi reproduciblecacia en ensayos funcionales y en la composición de proteína; Además, cuando se analizaron los sobrenadantes de cada semana sucesiva de cultivo y hasta un total de 4 semanas, se encontró que los perfiles de proteínas a ser muy similares (Figura 3). Cuando la concentración de HES se mide mediante el ensayo de Bradford (véase 5.5), el total proteína es generalmente aproximadamente 1 mg / ml (Figura 4). Un método alternativo de la concentración de HES es con un concentrador centrífugo (por ejemplo Vivaspin membrana de corte de 3 kDa), en el que las muestras se centrifugaron a 4000 g hasta en un rotor de la centrifugadora swing-out, la eliminación de las sales tampón y componentes de bajo peso molecular. Concentración centrífuga es el más adecuado para los volúmenes de procesamiento pequeños (1-10 ml) y se limita a un factor de concentración máximo de aproximadamente 30x. Cuando la recogida de HES, la evitación de la contaminación es crítica. Para evitar la contaminación con moléculas huésped, descartamos HES-containing medios de cultivo de las primeras 24 horas después de la cosecha gusano adulto en el intestino del ratón. También cuantificar el nivel de contaminación LPS en cada lote de HES con un ensayo cromogénico LAL (ver 5.7). 1 U de LPS equivale a ~ 100 pg LPS y niveles por debajo de esta se considera despreciable 23. En nuestras manos, la mayoría de los lotes de HES están significativamente por debajo de este límite, la concentración media de LPS en HES ser 0,23 U / mg (Figura 5). Los efectos de LPS en modelos in vivo de la patología (por ejemplo, la supresión de las respuestas asmáticas) requiere al menos 10 ng de LPS 23. De ahí que la administración in vivo de 5 mg HES de un lote con 100 pg LPS / g HES incluirá 500 LPS PG, muy por debajo de la concentración efectiva donde LPS se convierte en un problema. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig1highres.jpg" /> Figura 1: Aparato Baermann Baerconfiguración Aparato mann para la recolección de adultos H. polygyrus (como se describe en la sección 2). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig2highres.jpg" /> Figura 2: La media de Gusano Carga 14 días después de la infección con 400 larvas L3 Mean gusano agobia 14 días después de la infección con 400 larvas L3. Los puntos de datos que se muestran son de 19 rondas de infección de ratones C57BL / 6xCBA. Media ± SEM muestra. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig3highres.jpg" /> Figura 3: Perfiles proteicos de HES de las semanas sucesivas de Cultura perfil de SDS-PAGE de las proteínas de HES recogidos en sucesivas semanas de cultivo. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig4highres.jpg" /> Figura 4: </strong&gt; Cantidad final de HES de 500 ml ES que contiene el medio de rendimiento de proteína HES de 11 lotes diferentes derivados de aproximadamente 500 ml de sobrenadante de cultivo. Media ± SEM muestra. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig5highres.jpg" /> Figura 5: LPS contaminación de niveles de HES de contaminación LPS en 41 lotes de HES medidos por el ensayo de Limulus ameobocyte. LPS concentración mediana = 86 U por mg de HES. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig6highres.jpg" /> Figura 6: Animación esquemática de H. polygyrus Ciclo de Vida Resumen de las etapas clave del ciclo de vida de una sonda nasogástrica de larvas L3, a través de la recuperación de larvas y gusanos adultos al aislamiento de HES. Figura 7: Animación esquemática de SUH y sus Funciones efectos inmunomoduladores clave de mediadores solubles y exosomas contenidas dentro de HES. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Genotipo (y la tensión de fondo) </td><td> Fenotipo La infección primaria </td><td> Referencia </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Puras cepas </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A / J, CBA, C3H </td><td> Altamente susceptible </td><td> 22,29 </td></tr><tr><td> C57BL / 6 y ratones C57BL / 10 </td><td> Susceptible </td><td> 22,30 </td></tr><tr><td> BALB / c, DBA / 2, 129 / J </td><td> Intermedio </td><td> 22,31 </td></tr><tr><td> NIH, SJL, SWR </td&gt; <td> Inmune </td><td> 22,32 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgénicos para citocinas o receptores de citocinas </td><td></td></tr><tr><td> IL-1β - / - </td><td> Más susceptibles </td><td> 33 </td></tr><tr><td rowspan="2"> IL-1R - / - </td><td rowspan="2"> Menos susceptible (a); ningún cambio en la susceptibilidad, pero el aumento de granulomas (b) </td><td> (A) 33 </td></tr><tr><td> (B) 34 </td></tr><tr><td> IL-2Rβ transgénicos (C57BL / 6) </td><td> Resistente </td><td> 35 </td></tr><tr><td> IL-4 - / - </td><td> Fecundidad Superior </td><td> 36 </td></tr><tr><td> IL-4R - / - (C57BL / 6 o ratones BALB / c) </td><td> Altamente susceptible </td><td> 22 </td></tr><tr><td> IL-6 - / - (BALB / c o C57BL / 6) </td><td> Altamente Resistente </td><td> 37 </td></tr><tr><td> IL-9 transgénico(FVB) </td><td> Resistente </td><td> 38 </td></tr><tr><td> IL-21R - / - (C57BL / 6) </td><td> Deficiente Th2, disminución de gormation granuloma </td><td> 39,40 </td></tr><tr><td> IL-25 - / - (BALB / c) </td><td> Más susceptibles </td><td> 33 </td></tr><tr><td> IL-33R (T1 / ST2) - / - (BALB / c) </td><td> No hay cambios en la susceptibilidad </td><td> 33 </td></tr><tr><td> TGFβRIIdn (C57BL / 6) </td><td> Alta Th1, Aumento de la susceptibilidad </td><td> 41,42 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgénicos para marcadores de células T </td><td></td></tr><tr><td> CD28 - / - (BALB / c) </td><td> Marginalmente superior fecundidad </td><td> 43 </td></tr><tr><td> CD86 (B7-2) - / - (BALB / c) </td><td> Fecundidad Superior </td><td> 44 </td></tr><tr><td> OX40L - / - (BALB / c) </td><td> Fecundidad y Superior# 160; </td><td> 45 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgénicos para loci inmune innata </td><td></td></tr><tr><td> Interferón de tipo 1 receptor (IFNAR) - / - (C57BL / 6) </td><td> Fecundidad más alta, más granulomas </td><td> 34 </td></tr><tr><td> MyD88 - / - (C57BL / 6) </td><td> Más resistentes, más granulomas </td><td> 34 </td></tr><tr><td> C-KitW / Wv (WBB6) </td><td> Más susceptibles </td><td> 46,47 </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Las infecciones primarias con H. polygyrus en genéticamente diferentes y de genes targetted cepas de ratón.

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Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus es un nematodo murino con potentes capacidades inmunomoduladoras que se asemejan mucho a los de la infección por helmintos humano altamente prevalente. Aquí se describe un protocolo para el mantenimiento a largo plazo de la H. ciclo de vida polygyrus.

El cultivo de<em&gt; Heligmosomoides polygyrus:</em&gt; Un inmunomodulador nematodo parásito y sus productos secretados

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

18.0K vistas.  University of Edinburgh.  Heligmosomoides polygyrus es un nematodo murino con potentes capacidades inmunomoduladoras que se asemejan mucho a los de la infección por helmintos humano altamente prevalente. Aquí se describe un protocolo para el mantenimiento a largo plazo de la H. ciclo de vida polygyrus. 

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Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Microscopia intravital del bazo: Análisis cuantitativo de la movilidad del parásito y el flujo sanguíneo

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Investigación

Inmunología e Infección

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Leishmaniasis is one of the world's most neglected diseases, largely affecting the poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million people are considered at risk of contracting leishmaniasis, and approximately 2 million new cases occur yearly1. Leishmania donovani is the causative agent for visceral leishmaniasis (VL), the most fatal form of the disease. The choice of drugs available to treat leishmaniasis is limited 2;current treatments provide limited efficacy and many are toxic at therapeutic doses. In addition, most of the first line treatment drugs have already lost their utility due to increasing multiple drug resistance 3. The current pipeline of anti-leishmanial drugs is also severely depleted. Sustained efforts are needed to enrich a new anti-leishmanial drug discovery pipeline, and this endeavor relies on the availability of suitable in vitro screening models.
In vitro promastigotes 4 and axenic amastigotes assays5 are primarily used for anti-leishmanial drug screening however, may not be appropriate due to significant cellular, physiological, biochemical and molecular differences in comparison to intracellular amastigotes. Assays with macrophage-amastigotes models are considered closest to the pathophysiological conditions of leishmaniasis, and are therefore the most appropriate for in vitro screening. Differentiated, non-dividing human acute monocytic leukemia cells (THP1) (make an attractive) alternative to isolated primary macrophages and can be used for assaying anti-leishmanial activity of different compounds against intracellular amastigotes.
Here, we present a parasite-rescue and transformation assay with differentiated THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani for screening pure compounds and natural products extracts and determining the efficacy against the intracellular Leishmania amastigotes. The assay involves the following steps: (1) differentiation of THP1 cells to non-dividing macrophages, (2) infection of macrophages with L. donovani metacyclic promastigotes, (3) treatment of infected cells with test drugs, (4) controlled lysis of infected macrophages, (5) release/rescue of amastigotes and (6) transformation of live amastigotes to promastigotes. The assay was optimized using detergent treatment for controlled lysis of Leishmania-infected THP1 cells to achieve almost complete rescue of viable intracellular amastigotes with minimal effect on their ability to transform to promastigotes. Different macrophage:promastigotes ratios were tested to achieve maximum infection. Quantification of the infection was performed through transformation of live, rescued Leishmania amastigotes to promastigotes and evaluation of their growth by an alamarBlue fluorometric assay in 96-well microplates. This assay is comparable to the currently-used microscopic, transgenic reporter gene and digital-image analysis assays. This assay is robust and measures only the live intracellular amastigotes compared to reporter gene and image analysis assays, which may not differentiate between live and dead amastigotes. Also, the assay has been validated with a current panel of anti-leishmanial drugs and has been successfully applied to large-scale screening of pure compounds and a library of natural products fractions (Tekwani et al. unpublished).

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A parasite-rescue and transformation assay with THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani has been optimized for anti-leishmanial drug screening. The assay involves differentiation of THP1 cells, infection with promastigotes, treatment with test drugs, controlled lysis of the infected macrophages, rescue of amastigotes, transformation to promastigotes and monitoring promastigote growth and proliferation with a fluorometric assay.

A Parasite Rescate y Transformación de ensayo para la detección antileishmanial contra intracelular<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotes en THP1 Humanos aguda línea celular de leucemia monocítica

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on the amber suppression technology that was originally developed by Peter Schultz and colleagues1. An amber mutation is first introduced at a specific codon of the gene encoding the protein of interest. The amber mutant is then expressed in E. coli together with genes encoding an amber suppressor tRNA and an amino acyl-tRNA synthetase derived from Methanococcus jannaschii. Using this system, the photo activatable amino acid analog p-benzoylphenylalanine (Bpa) is incorporated at the amber codon. Cells are then irradiated with ultraviolet light to covalently link the Bpa residue to proteins that are located within 3-8 &#197;. Photocrosslinking is performed in combination with pulse-chase labeling and immunoprecipitation of the protein of interest in order to monitor changes in protein-protein interactions that occur over a time scale of seconds to minutes. We optimized the procedure to study the assembly of a bacterial virulence factor that consists of two independent domains, a domain that is integrated into the outer membrane and a domain that is translocated into the extracellular space, but the method can be used to study many different assembly processes and biological pathways in both prokaryotic and eukaryotic cells. In principle interacting factors and even specific residues of interacting factors that bind to a protein of interest can be identified by mass spectrometry.

This article illustrates the use of pulse-chase radio labeling in combination with site-specific photocrosslinking to monitor interactions between a protein of interest and other factors in E. coli. Unlike traditional chemical cross-linking methods, this approach generates high resolution &#8220;snapshots&#8221; of an ordered assembly pathway in a living cell.

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of immune-related diseases. Mechanisms involved are increasingly being elucidated and in this article, we describe the basic experiment to assess MSC immunomodulation by assaying for suppression of effector leukocyte proliferation. Representing activation, leukocyte proliferation can be assessed by a number of techniques, and we describe in this protocol the use of the fluorescent cellular dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) to label leukocytes with subsequent flow cytometric analyses. This technique can not only assess proliferation without radioactivity, but also the number of cell divisions that have occurred as well as allowing for identification of the specific population of proliferating cells and intracellular cytokine/factor expression. Moreover, the assay can be tailored to evaluate specific populations of effector leukocytes by magnetic bead surface marker selection of single peripheral blood mononuclear cell populations prior to co-culture with MSCs. The flexibility of this co-culture assay is useful for investigating cellular interactions between MSCs and leukocytes.

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs

The immunomodulatory properties of human mesenchymal stem cells (MSC) appear increasingly relevant for clinical application. Using a co-culture system of MSCs and peripheral blood leukocytes pre-stained with the fluorescent dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), we describe the in vitro assessment of MSC immunomodulation on effector leukocyte proliferation and specific subpopulations.

Evaluación de las propiedades inmunomoduladoras de las células madre mesenquimales humanas (MSC)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Establecimiento de un programa de instalación de alto rendimiento para la detección de pequeñas moléculas que modulan la c-di-GMP Señalización en el<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a fascinating approach to investigate immune modulation of cutaneous inflammation in mouse models of human diseases. Here we present a cost-effective protocol that delivered naked DNA in mouse skin and leads to transgene expression. The method is coined &#34;acufection&#34;, denoting acupuncture-mediated DNA transfection. To perform acufection, mouse skin was first infused with DNA in phosphate-buffered saline (PBS) and then pricked lightly with a bundle of acupuncture needles to facilitate the absorption of DNA and transfection into cells. The plasmid DNA is presumably taken up by the keratinocyte and dendritic cells (DCs) in the skin and expressed into protein. Mechanical prick with the needles per se did not cause skin damage or induce keratinocyte activation. The expression of the transfected genes was detected in the skin at both transcriptional and translational levels following acufection for 2 days and maintained up to 7 days. The primary goal for the development of this acufection method was to investigate a previously undefined isoform of IL-15. Using this method, an alternatively spliced IL-15 isoform with partially deleted exon 7 (IL-15&#916;E7) was expressed in the skin and subsequently treated with a Toll-like receptor 7 (TLR7) agonist, imiquimod (IMQ), to induce inflammation. Acufection-delivered IL-15&#916;E7 in skin suppressed keratinocyte proliferation, epidermal thickness and neutrophil recruitment in IMQ-induced cutaneous inflammation. With increasing interest in identifying the regulatory mechanisms of cutaneous inflammation, the protocol described here provides a cost effective and versatile alternative to the gene gun system or microseeding for DNA delivery in vivo. It may potentially allow discovery of the function of a novel gene in the skin or for investigating new treatment for cutaneous diseases.

Development of an Economical DNA Delivery System by &quot;Acufection&quot; and its Application to Skin Research

This protocol is a cost-effective alternative for expressing naked plasmid DNA in mouse skin. The overall goal of the protocol is to deliver immune-related genes into skin tissue to delineate the functional role of a specific gene in cutaneous inflammation.

Desarrollo de un sistema de entrega de ADN económico por &quot;Acufection&quot; y su aplicación a la investigación de la piel

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., immunosuppressive or immunostimulatory) chemical compounds and biologics. One of the earliest steps during mitogenesis is cell enlargement or blastogenic transformation, whereupon the cell volume increases before division. It is usually detectable in the first several hours of T-lymphocyte stimulation. Here, we describe a rapid method to quantify blastogenesis in T lymphocytes isolated from mouse spleens and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using an automated cell counter. Various commonly used proliferation assays for the most part are laborious and only reflect the overall population effect rather than individual cellular effects within a population. In contrast, the presented automated cell counter assay provides rapid, direct, and precise measurements of cell diameters that can be used for assessing the effectiveness of various mitogens and immunomodulatory drugs in vitro.

T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.

La cuantificación rápida de Blastogénesis inducida por mitógeno de linfocitos T para identificar fármacos inmunomoduladores

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

Evaluación de la citotóxica y efectos inmunomoduladores de sustancias en lonchas de pulmón humano de precisión de corte

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

Generación de anticuerpos monoclonales contra productos naturales

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

Cuantificación de basados en citometría de flujo multicolor de las mitocondrias y los lisosomas en las células T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...