Este protocolo describe una estrategia terapéutica potencialmente novedosa que se puede modificar fácilmente para aplicaciones humanas. Esta técnica mejora directamente la inducción de las células T reguladoras de la dirección intestinal en los tejidos linfoides periféricos y se puede implementar de forma estable incluso en entornos altamente proinflamatorios. Estas técnicas también se pueden utilizar para investigar el papel de la vitamina D activa y la vitamina A dentro del sistema inmunitario periférico.
Esta demostración visual proporcionará instrucciones paso a paso para la generación de células dendríticas de ingeniería de alta calidad que son fundamentales para el éxito de esta técnica. Comience por sembrar una vez 10 a las siete células 293T en 20 mililitros de medio de cultivo celular CM-10-D en placas de cultivo de 150 por 25 milímetros para una incubación de 24 horas a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono. Al día siguiente, añadir 1,62 mililitros de solución de HBS recién preparada, 9,5 microgramos de plásmido de envolvente, 17,5 microgramos de plásmido de envasado y 27 microgramos del plásmido LENTI-CYP-ALDH a un tubo cónico de 50 mililitros.
Lleve el volumen final del contenido del tubo hasta 3.0375 mililitros con agua seguido de la adición de 202,5 microlitros de dos molares de cloruro de calcio por gotas. Deje la mezcla de precipitación de ADN a temperatura ambiente durante 20 minutos con una mezcla ocasional antes de añadir 3,24 mililitros de la solución por gotas según el cultivo 293T mientras gira suavemente el plato. Coloque las placas en la incubadora durante 24 horas antes de lavar suavemente cada plato con PBS y alimentar las células con un medio de cultivo CM-4-D.
Después de otras 24 horas de cultivo, cosecha los sobrenadantes en botellas estériles para su almacenamiento a cuatro a ocho grados centígrados y alimenta las células con un medio CM-4-D fresco durante otras 24 horas. En el cuarto día, cosecha los sobrenadantes de nuevo y colar los sobrenadantes de ambos días tres y cuatro a un filtro de 0,45 micrómetros. Luego, concentra el virus pseudotipo VSV-G por centrifugación durante 24 horas.
Al día siguiente decantar a los sobrenadantes. Deje que los tubos drene sobre una toalla de papel en un gabinete de biosecuerpo estéril durante varios minutos, luego resuspender los pellets en 33.3 microlitros de PBS estéril que contiene 5% de glicerol por plato de cultivo. Para la generación de células dendríticas derivadas de la médula ósea, coloque las tibias y fémures, cosechados de ratones BALB/c, en un plato de cultivo de 100 por 20 milímetros que contenga un medio de cultivo fresco.
Usa tijeras y fórceps diseccionados para eliminar cualquier tejido de los huesos. Cuando se hayan limpiado todos los huesos, utilice las tijeras para cortar ambos extremos de cada hueso para exponer las cavidades de la médula ósea. Utilice una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja de calibre 30 para lavar cada hueso con 10 mililitros de medio de cultivo fresco, recogiendo la médula ósea en un tubo de 15 mililitros.
Cuando se ha recogido toda la médula ósea, sedimentar la médula ósea por centrifugación y resuspend el pellet en dos mililitros de tólizar de lysis de glóbulos rojos. Después de cuatro a cinco minutos a temperatura ambiente con temblores ocasionales, detenga la reacción con 10 mililitros de medio de cultivo celular y recoja las células por centrifugación. Resuspender el pellet en 10 mililitros de medio de cultivo CM-10-R para el recuento y ajustar las células por una por 10 a las seis células por mililitro de concentración media de cultivo CM-10-R.
A continuación, agregue 100 unidades por mililitro de GM-CSF murino recombinante y 10 unidades por mililitro de IL-4 a las células. Placa de cuatro mililitros de células en pozos individuales de una placa de cultivo de seis pozos para su incubación a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono durante 48 horas. Al final de la incubación, aspira suavemente las células no adherentes.
Añadir medio fresco complementado con GM-CSF e IL-4 a los cultivos antes de devolver las células a la incubadora de cultivo celular por un adicional de 48 horas. Al final de la segunda incubación, cosecha las células dendríticas derivadas de la médula ósea no adherente en un tubo cónico de 50 mililitros para su centrifugación. Para generar células BMDC-CYP-ALDH, resuspendir los cultivos a una vez diez a las sextas células dendríticas por cada 500 microlitros de medio CM-10-R por concentración de pozo, y placa 500 microlitros de células en cada pozo de una nueva placa de cultivo de seis pozos.
Añadir 50 microlitros del virus LENTI-CYP-ALDH y 8 microgramos por mililitro de protamina a cada pozo, luego colocar la placa en la incubadora durante 24 horas. Al día siguiente, sustituya los sobrenadantes por un medio de cultivo fresco y devuelva las placas a la incubadora de cultivo celular durante otras 24 horas. Al final de la segunda incubación, las células se pueden activar con 100 nanogramos por mililitro de lipopolisacárido por pozo durante 24 horas antes de la cosecha para análisis funcionales.
En comparación con las células dendríticas derivadas de la médula ósea parental, las células BMDC-CYP-ALDH muestran una expresión mejorada de 1-alfa-hidroxilasa. Las concentraciones de la forma activa de vitamina D en el cultivo de sobrenadantes de BMDC-CYP y BMDC-CYP-ALDH son aproximadamente 20 veces más altas que las observadas en la célula dendrítica derivada de la médula ósea parental y los cultivos celulares BMDC-ALDH. Las intensidades fluorescentes medias de las células BMDC-CYP-ALDH tratadas con el sustrato son aproximadamente seis veces superiores a las de las células dendríticas derivadas de la médula ósea parental tratadas con el sustrato.
Esto sugiere que las células BMDC-CYP-ALDH expresan actividad enzimática de la deshirogenasa de la retina significativamente mejorada. Las células DC2.4 tratadas con vitamina D y retin retinidad 25-hidroxi no inducen un cambio significativo en la abundancia de células T positivas CD4 CD4 DE CCR9 ccR9 foxp3. Por el contrario, las células DC2.4 CYP-ALDH tratadas con vitamina D de 25-hidroxi y retina inducen un número significativamente mayor de células T reguladoras que insiguían en una manera dependiente de la concentración.
Además, en comparación con las células de control inyectadas intraperitonealmente, las células DC CYP-ALDH también inducen un aumento significativo en el número de células T positivas de FOXP3 CCR9 CD4 positivas después de la inyección intraperitoneal en animales receptores BALB/c. El éxito del procedimiento depende de la preparación de células T sanas y una mezcla de ADN correctamente preparada.
