We thank Dr. John Risinger and Memorial Health University Medical Center, Inc. for generously providing the ACI-23 cell line. The authors acknowledge financial support through the Postdoctoral Research Training (PRAT) Award to C. House from The National Institute for General Medical Sciences.

1. Traditionelle Kultur von Eierstockkrebs-Zelllinien (Adherent AGB) HINWEIS: Alle Umgang mit Zellen und Medien sollte in einem sterilen Gewebekultur Haube nehmen <ol><li> Bereiten traditionellen Zellkulturmedien. Verwenden Sie 1: 1 DMEM: F12 (+ L-Glutamin, + 15 mM HEPES) und ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum und 1% Penicillin / Streptomycin. Filter-Lösung mit 0,45 um-Vakuumfilter. </li><li> Bereiten Sie eine traditionelle Polystyrol 75cm 2 Zellkulturflasche mit dem Namen, Datum beschriftet und Durchgang Nummer der Zelllinie interest.Remove die Ampulle von Zellen aus ultra low Gefrierschrank oder flüssigem Stickstoff. Tauen Sie, indem Sie im 37 ° C Wasserbad für 5 min. </li><li> Transfer-Suspension aus dem Fläschchen in die 15-ml-Zentrifugenröhrchen, das 3 ml traditionellen Zellkulturmedien (vorstehend hergestellt). Zentrifuge Suspension bei 4 ° C für 5 min bei 400 x g. Inzwischen werden 16 ml traditionellen Zellkulturmedien zu Kanne. </li><li>Überstand entfernen. Mit 2 ml traditionellen Zellkulturmedien Pipetten Zellen nach oben und unten zu lockern Pellets und Übertragung Suspension Kanne. Gently Rock Kolben gleichmäßig cells.Place Kolben in befeuchteten Zellkulturbrutschrank auf 37 ° C und 5% CO 2 zu verteilen. Überwachen Zellen täglich bis 80% Konfluenz erreicht ist. </li><li> Sobald die Zellen 80% konfluent spaltete die Kultur 1: 2 in der Zellkultur Kapuze. Überstand wird abgesaugt und mit warmem phosphatgepufferter Salzlösung (ohne Calcium und Magnesium) (PBS). 1,5 ml 0,25% Trypsin-EDTA und Inkubation 3-5 min bei RT. </li><li> Bereiten Sie 2 neue Polystyrol 75 cm 2-Kolben und fügen Sie 16 ml traditionellen Zellkulturmedien zu jedem Kolben. Resuspendieren der trypsinierten Zellen in 4 ml traditionellen Zellkulturmedien und Aliquots gleichen Volumina an jede der neuen Kolben. </li><li> Platz Kolben in befeuchteten Zellkulturbrutschrank auf 37 ° C und 5% CO 2 eingestellt. Überwachen Zellen täglich bis 80% Konfluenz erreicht ist. Weiter zu spalten Zellen undKultur oder einfrieren und bei -80 oder in flüssigem Stickstoff. </li></ol> 2. Erzeugung von vielzelligen Sphäroide von Eierstockkrebs-Zelllinien mithilfe der schwebenden oder adhärenter Zellen HINWEIS: Alle Umgang mit Zellen und Medien sollte in einem sterilen Gewebekultur Haube nehmen. Nach Kultivierung Zelllinien unter herkömmlichen Kulturmethoden für 2 - 3 Passagen (Abschnitt 1) ​​fahren Sie mit den folgenden Schritten. <ol><li> Bereiten Stammzellmedien. Anwendung 1: 1 DMEM: F12 (+ L-Glutamin, + 15 mM HEPES) und ergänzt mit 1% Penicillin / Streptomycin (bis zu einer Endkonzentration von 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin), 1% Serumersatz knockout , 0,4% Rinderserumalbumin und 0,1% Insulin-Transferrin-Selen. Filter-Lösung mit 0,45 um-Vakuumfilter. </li><li> Supplement Stammzellenmedium mit humanem rekombinantem epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und humaner rekombinanter basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) für eine Endkonzentration von 20 ng / ml und 10 ng / ml betrugen. HINWEIS: Wachstumsfaktoren sollten unmittelbar vor Gebrauch frisch auf die Stammzellmedien hinzugefügt werden. </li><li> Erstelle Floater TIC Kultur. Kolben von 80% konfluenten Zellen in traditionellen adhärenten Kulturbedingungen gewachsen entfernen. Sammeln Medien und alle schwebenden Zellen (Einzel- und Aggregate), hinter dem Verlassen des haftenden Bevölkerung, und Transfer zum 50-ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge Suspension bei 4 ° C für 5 min bei 400 x g. HINWEIS: Schwimmzellen und Aggregate offensichtlich sind 24-72 h nach adhärenten Zellen werden in den Kolben unter traditionellen Kultur verbunden ist. Aus einer 80% konfluenten Platte Abruf von ca. 1.0 - 5.0 x 10 5 lebensfähige Schwimmzellen erwartet werden kann, abhängig von der Zelllinie. In dieser Studie wurde die durchschnittliche Anzahl der schwebenden Zellen aus einer 80% konfluenten adhärenten Kultur gewonnen wurde: 5,0 x 10 5 für ACI-23, 4,8 x 10 5 für OVCAR5, 3,5 x 10 5 für Caov3 und 1,0 x 10 5 für TGS- 3. Bei der Übertragung multicelldere Sphäroidbildung in traditionellen und Schwimmer TIC Kultur erfolgt innerhalb weniger Tage, obwohl dies etwas Zelllinie abhängig. Beispielsweise ACI-23 Zellen bilden Aggregate leichter als Caov3 Zellen. </li><li> Unterdessen bereiten ein ultra low Befestigungsfläche Polystyrol 75 cm 2 Zellkulturflasche mit dem Namen, das Datum und Gang Anzahl der Zelllinie gekennzeichnet. 10 ml Zellmedium mit Wachstumsfaktoren in den Kolben ergänzt einzudämmen. </li><li> Nach Zentrifugation abgeschlossen ist, absaugen Medien und Übertragungs Pellets zu geringen Anbau Kolben durch Zugabe von 6 ml Zellmedien stammen und Auf-und Abpipettieren zur Pellet zu lösen. Platz Kolben in befeuchteten Zellkulturbrutschrank auf 37 ° C und 5% CO 2 eingestellt. Monitor-Zellen alle 2-3 Tage, um Sphäroidbildung beobachten. </li><li> Erstellen traditionelle TIC Kultur. Kolben von 80% konfluenten Zellen in traditionellen adhärenten Kulturbedingungen gewachsen entfernen. Absaugen Medien und warmem PBS. 1,5 ml Trypsin 0,25% EDTA und Inkubation 3-5min bei RT. </li><li> Bereiten Sie ein Ultra-Low-Befestigungsfläche Polystyrol 75 cm 2 Zellkulturflasche mit dem Namen, das Datum und die Anzahl der Durchgangszelllinie gekennzeichnet. 10 ml Zellmedium, ergänzt mit EGF und FGF, wie beschrieben, in den Kolben herrühren. </li><li> 6 ml Zellmedium in den Kolben mit dem Trypsin einzudämmen. Pipettieren Zelllösung auf und ab und versuchen, Zellen von der Flaschenoberfläche zu lösen. Übertragen gesamte Volumen der Zellen, um Ultra-Low-Anlage der Kolben mit 10 ml Zellmedien stammen. Danach wird der Kolben in befeuchteten Zellkulturbrutschrank auf 37 ° C und 5% CO 2 eingestellt. </li><li> Ergänzen TIC Kulturen jedes 48-72 h mit einer zusätzlichen 2 ml Zellmedium und frische EGF und FGF für Endkonzentrationen von 20 ng / ml und 10 ng / ml Stamm sind. </li><li> Monitor-Zellen, bis 60-80% Konfluenz erreicht ist. Split Kulturen, indem gleiche Volumina in 2 neue Ultra Low Befestigung Kolben und Zugabe von frischem Stammzellmedien, um ein Endvolumen von 18 ml zu erzielen. Alternatively, zentrifugieren Sie das gesamte Suspension bei 4 ° C für 5 min bei 400 x g. Die Zellen in der Stammzellmedien mit EGF und FGF ergänzt und gleichmäßig verteilt in die neue Ultra-Low Befestigung Kolben. Die Zellen müssen nicht in Einzelzellsuspensionen für das Passagieren getrennt werden. HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt werden die Kulturen weiter zu spalten und kultiviert werden, eingefroren oder experimentell für die Analyse bearbeitet. Bei 60-80% Konfluenz wurden die folgenden Konzentrationen an Zellen für ACI-23 abgerufen: 8.0 x 10 6 für traditionelle Adhärente, 4,0 x 10 6 für traditionelle TIC und 5,0 x 10 6 für Schwimmer TIC Kulturen. Obwohl es Zellinie abhängig zu sein, haben wir festgestellt, dass 5 - 10 Tagen in Kultur optimal für TIC Anreicherung als Prozentsatz der CD133 + ALDH + Zellen niedrig ist innerhalb der ersten 3 Tage, Peaks bei 5 - 10 Tagen, und nimmt wieder 14 Tage. </li></ol> 3. Erzeugung von Primär epithelialen Ovarialkarzinom-Zelllinien und vielzelligen Sphäroidevon chemoresistenten Patienten Aszites HINWEIS: Institutional Review Board Genehmigung wurde für dieses Protokoll erhalten. Alle Umgang mit Zellen und Medien sollte in einem sterilen Gewebekultur Haube nehmen. <ol><li> Platte Ascitesflüssigkeit 1: 1 mit herkömmlichen Zellkulturmedien. Bereiten Medien, wie in Kapitel 1 beschrieben, und 10 ml bis zu mehreren traditionellen Polystyrol 75 cm 2 Gewebekulturflaschen. </li><li> Aszites-Flüssigkeit ist in der Regel in 1 l steriles Vakuumflaschen vorgesehen ist; entfernen Vakuumkappe. Vorsichtig 10 ml Aszitesflüssigkeit zu Kolben, die 10 ml traditionellen Medien und in befeuchteten Zellkulturbrutschrank auf 37 ° C und 5% CO 2 eingestellt. Lassen Sie ungestört für 72 bis 96 Stunden, bevor Sie eine komplette Medienwechsel. Ändern Medien alle 2-3 Tage bis Zellen erreichen 60-80% Konfluenz </li><li> Sobald Zellen erreichen 60-80% Konfluenz im Verhältnis 1: 2, wie in Abschnitt 1. Starten TIC Kulturen beschrieben, wie in Kapitel 2 beschrieben. HINWEIS: in ascit vorhanden Erythrozytenes wird nach dem ersten Medienwechsel entfernt werden, da sie nicht-adhärenten. Eventuell vorhandene Fibroblasten weitgehend nach Trypsinbehandlung entfernt werden, da sie empfindlicher sind und mit minimaler Einwirkung von Trypsin zu heben. Reinheit von Eierstockkrebszellen wurde durch Durchflusszytometrie-Analyse unter Verwendung von Antikörpern für die CA-125 (MUC16) bestimmt. </li></ol> 4. Die Färbung der Zellen für die Durchflusszytometrie Bestätigung der TIC-Marker <ol><li> Sammeln TIC Kulturen. Übertragen Sie Inhalte der Kolben in 50 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge Suspensionen 5 min bei 400 x g. Absaugen Medien und warmem PBS. 2 ml nicht-enzymatische Zelldissoziationslösung, Inkubation 3-5 Minuten bei 37 ° C, und pipettieren nach oben und unten, um Klumpen aufzubrechen und distanzieren in einzelne Zellen. 4 ml Zellmedien stammen. </li><li> Sammeln adhärenten Kulturen. Absaugen Medien und warmem PBS. 3 ml nicht-enzymatischen Zelldissoziationslösung inkubieren 3-5 min bei 37 ° C. 3 ml traditionellen ZellKulturmedien und pipettieren nach oben und unten mehrmals, um Zellen aus Kolben lösen und sammeln in Zentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifuge sowohl TIC und haftSuspensionen 5 min bei 400 x g. Überstand verwerfen und Resuspendieren jedes Pellet in 1 ml PBS, das 3% fötales Rinderserum. Inkubation bei RT 30 min. Inzwischen zählen Anzahl lebensfähiger Zellen mit Trypanblau. Beachten Zellen unter dem Mikroskop, um zu bestätigen Sphäroide in einzelne Zellen dissoziiert. </li><li> Label 5 x 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen für jede der folgenden Kulturbedingungen: 1) Ungefärbte (ungefärbten Kontrolle auf Schadensersatz), 2) ALDH (Einzel Fleck Positivkontrolle für die Vergütung), 3) CD133 (Einzel Fleck Positivkontrolle für die Entschädigung), 4 ) ALDH + CD133 (experimentelle Testprobe), und 5) DEAB + ALDH (negative Kontrolle für die Hintergrundfluoreszenz im FL-1 und FL-4-Kanäle bezeichnet). </li><li> Verteilen Sie ca. 5 x 10 5 Zellen je nach Rohre # 1 - 4. Zentrifugieren Suspensionen für 5 Minuten bei 400 x g. Saugen Sie supernatant und resuspendieren Pellets in 500 ul Aldefluor Assaypuffer. In 10 ul DEAB (ALDH-Hemmer) zur Rohr # 5 für experimentelle Negativkontrolle. </li><li> In 5 ul aktiviert Aldefluor Reagenz Rohr # 2 auf Ersatz positive Kontrolle und Streifen zu mischen. In 5 ul aktiviert Aldefluor Reagenz Rohr # 4 für die experimentelle Analyse. Röhrchen klopfen, um zu mischen und sofort übertragen die Hälfte des Volumens von Zellen aus Rohr # 4 in Rohr # 5 (250 ul), die die DEAB enthält. </li><li> Flick Röhrchen gut mischen. 45 min bei 37 ° C vor Licht geschützt - Alle Röhrchen für 30 inkubiert. Flick Rohre Hälfte Inkubationszeit wie Zellen am Boden absetzen. Zentrifuge alle Röhrchen für 5 min bei 400 x g. Überstand entfernen und Zellen in 500 ul Aldefluor Assaypuffer. </li><li> Bei Rohren mit einem CD133-Färbung (# 3 und # 4), fügen CD133-APC 01.11 direkt in Aldefluor Assay-Puffer. Inkubieren Sie 15 Minuten auf Eis vor Licht geschützt. Zentrifuge CD133 Rohre für 5 min bei 400 x g. Einmal mit Waschen500 ul Aldefluor Assay-Puffer. Zellen in 500 ul Aldefluor Assaypuffer auf. </li><li> Filter Suspensionen in einzelne Polystyrol Rundbodenröhrchen mit Zellsieb Kappe. Sicherzustellen, dass das gesamte Volumen wird durch die Kappe filtriert. </li><li> Nutzen Sie ein Durchflusszytometer, die Zellpopulation zu untersuchen. Verwenden Rohre # 1-3 zur Einstellung Entschädigung Kontrollen. Mit Vor- und Nebenstreuparameter, Tor die Zellen, sicher zu sein, um Zelltrümmer aus. Stellen ALDH + und CD133 + Doppelzellen mit FL-1 und FL-4 Kanäle auf. </li><li> Mit einem zytometrische Analyse-Programm, bestätigen die Kulturbedingungen verbessert den Prozentsatz der TIC-Zellen als die TIC-reichen Kulturen sollte höher Färbung für diese beiden Marker haben. HINWEIS: Neben CD133 und ALDH andere markersof Ovarialkarzinom TIC kann mit der Anzahl von Markierungen in einem Proben abhängig von den Fähigkeiten des Durchflusszytometer verwendet analysiert werden. </li></ol> 5. In vivo </em&gt; subkutane Injektionen, um Tumorigenität von Zellpopulationen bestätigen HINWEIS: Institutional Review Board Genehmigung wurde für dieses Protokoll erhalten. Verteilen athymischen weiblichen Nacktmäusen 6-8 Wochen alt in experimentellen Gruppen in Käfigen von 3 und lassen Sie sie für ein paar Tage vor Injektionen akklimatisieren. Folgen Sie Mäusen unter humanen Versuchsrichtlinien nach NIH Animal Care und Verwenden Committee; Körpergewicht, körperliche Erscheinung wie Gewichtsverlust oder gewinnen mehr als 20%, ausgemergelten Erscheinungsbild, Durchfall oder Hautentzündung überwachen und einschläfern Mäuse Montage diese Kriterien durch CO 2 Ersticken. <ol><li> Sammeln Kulturen, wie in Abschnitt 2. Resuspendieren jedes Zellpopulation in 1 ml PBS beschrieben. Graf lebensfähigen Zellen unter Verwendung von Trypanblau-Assay. </li><li> Bereiten Sie 15 ml Zentrifugenröhrchen. Für Dreifach Maßnahmen fügen 1,5 x 10 6 lebensfähigen Zellen in 2 ml PBS verdünnt, in jede Röhre (5 x 10 5 Zellen in einem Volumen von 0,5 ml wird subkutan in die rechte f injiziert werdenlank jeder Maus). Bereiten Sie 0,5 ml PBS nur für Kontrollmäuse. </li><li> Mit 27 G Nadeln subcutaneouslyinject 0,5 ml Zellsuspension aus traditionellen adhärenten Kulturen, traditionelle TIC Kulturen, Schwimmer TIC Kulturen oder PBS in die rechte Flanke von jedem der drei Mäuse pro Gruppe. Zurück Mäuse auf das Original Käfige nach der Injektion. </li><li> Wiegen und messen Mäuse keine tastbaren Tumoren in zwei Dimensionen zweimal weeklyby Messschieber, zur Schaffung Länge und Breite. HINWEIS: Tumorlatenzzeit ist in der Regel 20 bis 50 Tage, je nach Zelllinie. </li><li> Berechnen Tumornassvolumen nach Standardverfahren (V = (Breite) 2 x Länge / 2). Hinweis: Obwohl diese Studie verglichen Tumorigenität TIC gegen adhärenten Zellen für die erste Generation nur in vivo serielle Passagierung TIC unter ähnlichen Bedingungen gezüchtet durch andere 11,20 abgeschlossen. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Das hier beschriebene Protokoll stellt eine effiziente und konsistente Methode zur Anreicherung von Kulturen für Zellen mit Stammzelleigenschaften von etablierten Ovarialkrebs-Zelllinien und ist an die Primärpatientenproben. Diese Methode erfolgreich bereichert für TIC in einer Vielzahl von Zellinien. Es ermöglicht die rechtzeitige Identifikation von Bedingungen, die für eine TIC und / oder tumorerzeugenden Phänotyp zu bereichern, ohne die Zeit nehmen, körperlich sortieren die TICs aus Nicht-TICs in der Bevölkerung. Auf diese Weise kann eine relative Niveaus verschiedener Signalwege für ihren Beitrag zu dem TIC Phänotyp durch Vergleichen traditionellen adhärenten Kulturen Kulturen mit einer Vielzahl von funktionellen Tests TIC beurteilen. Wenn ein reines TIC Population gewünscht ist, kann Isolierung leicht durch Einbau eines Fluoreszenz-unterstützte oder magnetischen Sortierschritt in der Durchflusszytometrie-Protokoll erreicht werden. Es ist wichtig zu beachten Sie jedoch, dass der Ausdruck der TIC-Markers wie CD133, CD44 oder ALDH kann unter Zelllinien oder Patientenproben sogar aus dem gleichen Tumor-Typ variieren. Zum Beispiel haben wir festgestellt, dass die OVCAR-5-Zellen haben eine höhere Expression von CD44 in Bezug auf CD133, während der umgekehrte gilt für ACI-23. Insofern ist konkret auf Tumorinitiation bei Mäusen verlassen und Durchflusszytometrie-Analyse als endgültig von TIC Präsenz. Nach diesem Protokoll wurde Hoch ALDH Aktivität konsequent beobachtet, wenn Eierstockkrebszellen wurden in der Stammzellbedingungen angezogen. Interessant ist, dass CD133-Expression in ACI-23-Zellen in der traditionellen TIC Kulturbedingungen gewachsen durchweg höher, während ALDH ist am höchsten in Floater TIC Bedingungen. Im Gegensatz dazu die TGS-3 primären Aszites-Zellen zeigen einen geringen Anstieg der CD133 Positivität unter Floater TIC Bedingungen, aber eine bemerkenswerte Zunahme ALDH Aktivität unter traditionellen Bedingungen TIC. Diese Ergebnisse unterstreichen die Heterogenität der Eierstockkrebszellen und die Plastizität häufig mit TICs verbunden. Zur weiteren Unterstützung der claim, die diese Methoden verbessern TICs wurde die Anreicherung von TRA-1-60-positiven Zellen beobachtet. TRA-1-60 ist eine Pluripotenz Marker und verwendet wurde, um die embryonale Karzinome der Eierstöcke und Hoden identifizieren sowie Prostatakrebs TICS 30-32. Obwohl unsere Methoden sind erfolgreich mit zahlreichen Zelllinien ist es möglich, dass die Standard-TIC Bedingungen möglicherweise besser zu einigen Eierstockkrebszellen geeignet sein, während die modifizierten Schwimmer Bedingungen besser für TIC in anderen Eierstockkrebszellpopulationen anzureichern. Dies unterstreicht erneut die erwartete Heterogenität innerhalb der beiden Patienten stammende und etablierte Eierstockkrebszelllinien. Zusätzlich zu Zelloberflächenmarker sind mehrere Transkriptionsfaktoren, die gezeigt haben, Ovarialkarzinom TIC einschließlich Nanog Sox2, Oct-4 11 zu charakterisieren, wobei diese Marker sind nicht spezifisch für Ovarialkrebs Tics und eher Faktoren, die für die embryonale Stammzelle Pluripotenz darstellen und difzierung 33,34. Wir untersuchten die Veränderungen in der Protein-Ebene dieser Faktoren und festgestellt, dass Nanog Spiegel erhöhen in TIC Kulturbedingungen im Einvernehmen mit anderen 13,35 sowie CD133, TRA-1-60 und CD117. Ein menschlicher Stammzellmarker cDNA-Array gezeigt weiter eine Erhöhung der CD133, Nanog, Melk und PODXL Gene in den TIC Bedingungen im Vergleich zu herkömmlichen haftenden Bedingungen. Wichtig ist, darauf hinzuweisen, daß, wie mit Zelloberflächenmarkern, Transkriptionsfaktoren mit Eierstock TIC verbunden kann unter Zelllinien und Patientenproben variieren. Wir haben beobachtet, dass Zellen können tumorigener sein und Express höhere Stammzellmarker, wenn sie von Natur aus nicht haft in vitro (dh, schwimmende Zellen, die nicht leicht zu befestigen, um eine haftende Platte). In Kultur, Zelllinien, wie ACI-23 haben in der Regel viele lebensfähige Schwimmzellen und / oder Zellen, die vertikal in einer Stapel Mode unter traditionellen Kultur condit wachsenIonen. Obwohl erfolgreiche Anreicherung von TICs von schwimmenden Zellen und Aggregate können für relativ wenige Zelllinien sein, einschließlich der in der vorliegenden Studie und OVCAR-3-12, unsere Ergebnisse deuten darauf könnte dies eine tumorigene Bevölkerung. Daher Ernte der &quot;schwebenden&quot; Population von Zellen in Standardgewebekulturplatten und Medien gezüchtet kann als alternative Methode zur TIC Bereicherung für Zellen, die schlecht zu kommerziellen Stammzellmedien anzupassen dienen. Die Nutzung der verschiedenen Kulturmethoden in dieser Handschrift vorgestellt wird ermöglichen eine schnelle Bereicherung der TIC Bevölkerung und ein besseres Verständnis für welche Faktoren unterstützen diese Phänotyp in verschiedenen Zellen. Gegenwärtige Anwendungen dieser Methode sind kennSignalWege sind entscheidend, um die Ausbreitung dieser einzigartigen Zellpopulation zu unterstützen. Die Ergebnisse dieser Studien werden dazu beitragen, zu klären Mechanismen der Tumorprogression und Rückfall.

Eierstockkrebs ist die tödlichste gynäkologischen Malignomen in den Vereinigten Staaten mit der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität als die hochwiederkehrenden, chemoresistenten Merkmale dieser Krankheit. Primäre Behandlung besteht in der Regel maximal onkologischer Chirurgie und anschließender Platin basierende Therapie, allerdings gibt es einige Hinweise auf eine neoadjuvante Therapie nahelegen könnten, in einigen Fällen vorteilhaft 1 sein. Die Mehrzahl der Patienten reagieren positiv auf primäre Behandlung, aber leider die Hälfte wird innerhalb von 18 Monaten 2 Rückfall. Meist Eierstockmalignitäten epitheliale Karzinome und in der Oberfläche Epithelien des Ovars oder Eileiter 3,4 stammen. Mehrere Studien belegen die Existenz von somatischen Stammzellen in der weiblichen Fortpflanzungsorgane, die vermutlich in die Reparatur von Gewebe, das nach dem Eisprung 5,6 benötigt wird helfen. Die hohe Proliferationsaktivität sowohl am Eierstock und Eileiter während Övülation könnte ein wichtiger Faktor bei der Entwicklung von Eierstockkrebs sein (Gharwan, et al. Manuskript eingereicht). Die Ableitung der tumorbildenden Zellen ist unklar, aber sie durch Mutationen, die sie nicht in der Lage Teilung oder Schicksal zu regulieren machen aus normalen Stammzellen, Vorläuferzellen oder differenzierten Zellen entstehen können. Diese Zellen sind auch &quot;Krebsstammzellen&quot; oder genannt worden &quot;krebsauslösenden Zellen,&quot; und kann in tumorigenen, vielzelligen Sphäroide unter niedrigen Anbaubedingungen wachsen. Obwohl das hierarchische Modell der TIC Entwicklung können dynamisch sein, nicht TICs teilen viele der gleichen Funktionen wie normale Stammzellen einschließlich Ruhe, Resistenz gegen Chemotherapie, langfristige Selbsterneuerung und Fähigkeit, sich in verschiedenen Zelllinien 7,8 unterscheiden. Mehrere Studien belegen die Existenz TICs bei Eierstockkrebs und die derzeitigen Bemühungen sind im Gange, um den Mechanismus (n), mit der diese Zellen unterstützt Tumorgenese 9-11 klären. Mehrere Marker wurden vorgeschlagen, um Eierstock TIC mit verbesserten Tumorigenität einschließlich CD133, ALDH1A1, CD117, CD44 und MyD88 identifizieren, obwohl der genaue Beitrag jeder Marker ist unklar und möglicherweise zelltypspezifische 11-16 sein. Während eine universelle Marker oder ein Satz von Markern wurde nicht eindeutig für Eierstock TIC eingerichtet, verschiedene Gruppen haben ovarian TIC häufiger durch Selektion auf CD44 +, CD133 + und / oder Zellen mit hoher Aldehyddehydrogenase (ALDH) -Aktivität 13,17-21 isoliert. CD44 ist ein Transmembran-Glykoprotein, das als Rezeptor für Hyaluronsäure wirkt und reguliert verschiedene Prozesse wichtig für Tumorprogression, einschließlich Adhäsion, Proliferation, Migration, Angiogenese und Differenzierung 22. CD133 ist ein Trans Glykoprotein, deren Aufgabe es ist noch unklar, aber Studien legen nahe, sie organisiert Plasmamembran-Topologie 23. ALDH, ein intrazelluläres Enzym, das die Oxidation von Aldehyden katalysiert, können die meisten univers seinal Marker TIC hohe Aktivität in Stammzellen, die aus einer Vielzahl von Geweben und mehrere Rollen getrennt haben ALDH unterstützen normale Stammzellen und TIC 24 zurückgeführt identifiziert. Ab sofort CD133 und ALDH1 scheinen die reproduzierbare Markierungen von Eierstock-TICs 13,21 sein. Zusätzlich zum Verständnis der Merkmale der TIC, gibt es auch einen großen Aufwand, um Medikamente, die speziell auf diese Subpopulation zu identifizieren. Die hohe Rückfallrate mit Eierstockkrebs verbunden kann durch den Ausfall des aktuellen Chemotherapien erfolgreich auszurotten TICs sein. Obwohl der Großteil der Tumor empfänglich ist, um den bestehenden Therapien, werden TIC gedacht beständig und in einer Dichte nachweisbar durch Standardverfahren zu sein. Aufklärung Mechanismen der Therapieresistenz und Tumorrezidiv sind entscheidend für die Reaktion und die allgemeine Überlebensrate von Patienten mit Eierstockkrebs zu verbessern. Dabei werden Kulturmethoden th beschriebenbei bereichern für TICs von etablierten und primären Eierstockkrebszelllinien. Die hierin beschriebenen Kulturbedingungen wurden von mehreren Gruppen verwendet worden, um die Ausbreitung von Tics oder Sphäroid Zellen mit Stammzelleigenschaften 11,12,14,16,20 induzieren. Obwohl es mehrere Stammzellkultur-Medien und Ergänzungen üblicherweise zur Anreicherung TIC verwendet / Sphäroide verwendeten wir eine serumfreie Medien Formel mit EGF und FGF, jedoch ohne Zusatz von B27 oder N-2 ergänzt. Diese Zusätze, die üblicherweise für die neuronale Zellkultur und Anreicherung von Stammzellen verwendet werden, haben gezeigt, dass eine mesenchymale Phänotyp 25,26 fördern und es verbleibt eine gewisse Unsicherheit im Bereich, ob TIC mit einem mesenchymalen oder epithelialen Phänotyp tumorigener 27-29 . Um Unsicherheiten und Variablen zu minimieren wir entschieden, die häufigste Formel zu verwenden, da es sich um epithelialen Eierstockkrebszellen zu tun haben. Aufrechterhalten Zellen in serumfreiem Medium in einem Niedrigbefestigungskolbenerleichtert Sphäroid Bildung und unterstützt die Ausbreitung der Zellen mit CD133-Expression und hohe ALDH Aktivität. Unsere Arbeit hat sich weiter gezeigt, dass Zellen unter normalen Schwimm adhärenten Bedingungen können auch eine tumorerzeugende TIC Bevölkerung. Injektion von Zellen unter diesen Bedingungen in athymischen Nacktmäusen gewachsen zu höheren tumorigenes Potential verglichen mit Zellen in entsprechenden Bedingungen in Anwesenheit von Serum gezüchtet. Viel Information über die Rolle des TIC bei Ovarialkarzinom Initiation, Progression, therapeutische Reaktion und Krankheitsrückfall kann durch die Verwendung dieser Techniken gewonnen werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1066">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:104px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:308px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">75 cm2 Ultra - Low Attachment Flask</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:104px;">3814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">75 cm2 Tissue Culture Flask</td>
			<td style="width:191px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:104px;">83.1813.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Aldefluor Kit</td>
			<td style="width:191px;">Stemcell Technologies</td>
			<td align="right" style="width:104px;">1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">CD133-APC</td>
			<td style="width:191px;">Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td style="width:104px;">130-090-826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Fibroblast Growth Factor - Basic human recombinant</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">F0291</td>
			<td>Prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Epidermal Growth Factor - human recombinant</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">E9644</td>
			<td>Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">DMEM:F12 (+L-Glutamine, +5 mM HEPES)</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">1X Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (Without Calcium and Magnesium)</td>
			<td style="width:191px;">Corning cellgro</td>
			<td style="width:104px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">0.25% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution</td>
			<td style="width:191px;">Corning cellgro</td>
			<td style="width:104px;">25-056-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A9418-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Insulin-Transferrin-Selenium</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:104px;">10828010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated)</td>
			<td style="width:191px;">Gemini</td>
			<td style="width:104px;">100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 micron)</td>
			<td style="width:191px;">Nalgene</td>
			<td style="width:104px;">450-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:104px;">430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube</td>
			<td style="width:191px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:104px;">352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl</td>
			<td style="width:191px;">Lonza</td>
			<td style="width:104px;">17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro enrichment of ovarian cancer tumor-initiating cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

Gegründet Eierstockkrebszelllinien und Primär Aszites-Zelllinie in der traditionellen adhärenten Kulturbedingungen in Gegenwart von Serum-Show befestigt, mit Kopfsteinpflaster Morphologie gewachsen, während die gleichen Zellen in TIC Kulturbedingungen gewachsen Display schwimm Sphäroid Morphologie, in TIC Bevölkerung verbreitet. Hellfeldbilder in Figur 1 A dargestellt zeigen deutlich die morphologischen Unterschiede in den Kulturbedingungen. 1B zeigt die differenzierten Morphologien nach Neubelegung ACI-23 und TGS-3 TIC Kulturen in herkömmlichen haftBedingungen erreicht. Nur 24 Stunden nach dem Aussäen zurück in adhärenten Bedingungen, die Mehrheit der mehrzelligen Sphäroiden distanzieren und heften sich an die Oberfläche, ähnlich typischen anhaftenden Zellen. Um zu überprüfen, dass die TIC Bedingungen bereichern für Zellen mit Stammzellmarker Durchflusszytometrie Analyse wurde mit zwei gemeinsamen Marker von Eierstock-TIC - CD133 expression und ALDH-Aktivität. Dot in Abbildung 2 dargestellt Parzellen A markieren Sie den erhöhten Anteil an CD133 + Zellen in geringen Anhaftung, serumfreien Bedingungen. Ebenso ist die Aktivität des Enzyms ALDH unter diesen Bedingungen im Vergleich zu herkömmlichen adhärenten Kulturbedingungen höher. Obwohl die traditionellen adhärenten Kulturen enthalten CD133 + Zellen unter Bedingungen, die Sphäroidbildung Verbesserung der Prozentsatz erhöht. Analyse eines Pluripotenz Marker, TRA-1-60, spricht ferner, dass die TIC Bedingungen bereichern für TIC, 2 B. Quantifizierung in Abbildung 2 C zeigt, dass doppelt positiven (CD133 + ALDH +) ACI-23-Zellen sind weitgehend auf Kulturen unter TIC fördernde Rahmenbedingungen gewachsen begrenzt. Veränderungen in den Proteinniveaus verschiedener Transkriptionsfaktoren, die in den ACI-23-Zellen nach fünf Tagen in Kultur in den TIC Bedingungen auftreten wurden ebenfalls untersucht. Eine fortschreitende Zunahme in jeder der Markers ist von der traditionellen gesehen im Vergleich zu den relativ niedrigen Niveau in der adhärenten Kultur gesehen, 2 D TIC Bedingungen Schwimmer. Interessanter ein Mensch Aszites-Zelllinie in den verschiedenen Bedingungen gewachsen zeigt den höchsten Markerphänotyps unter den traditionellen TIC Bedingungen mit wenig bis gar keine vorhanden Färbung in den Schwimmer TIC Bedingungen Abbildung 2 E. Die Tumorigenizität der TIC Kulturbedingungen wurde durch subkutane Injektionen von gleicher Zahl der lebensfähigen Zellen von allen Bedingungen in Kohorten von athymischen nackten Mäusen erhalten validiert, Fig. 3 zeigt, dass die ACI-23 (A, B) und OVCAR-5 (C) Zellen aus traditionellen adhärenten Kulturen waren weniger tumorigen als die aus den TIC Kulturen. Beachten Sie, dass die Schwimmer TIC Kulturen größeren Tumoren in einem kürzeren Zeitraum als die traditionellen anhaftenden oder traditionelle TIC Kulturen. Diese data legen nahe, dass selbst bei einem moderaten Anstieg der Eierstock-TIC Marker gibt es einen dramatischen phänotypischen Veränderungen. Jedoch mit anderen Zelllinien (nicht gezeigt) die traditionellen TIC Kulturen waren tumorigener als die herkömmlichen Anhänger und Schwimmer TIC Kulturzellen. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52446/52446fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. Spheroid Entwicklung in verschiedenen Kulturbedingungen. (A) Fest Ovarialkarzinomzellen (ACI-23 OVCAR-5 und Caov3) und Primär Patienten stammende Aszites-Zellen (TGS-3) Nebenbefestigungs Kolben mit serumfreien gezüchtet Stammzell-Medien bilden leicht mehrzelligen Sphäroiden. Bilder zeigen traditionelle adhärenten Kulturbedingungen halten epithelialen Kopfsteinpflastermorphologie in ACI-23, OVCAR-5, Caov3 und TGS-3-Zellen, während die gleichen Zellen in TIC Bedingungen gebildet Sphäroide innerhalb von 96 Stunden. Maßstabsbalken 100 um. (B) Bei der 24-Stunden-Expositionzu den traditionellen adhärenten Kulturbedingungen, zeigen die TIC Kultur Morphologien einen differenzierten Phänotyp ähnlich dem ursprünglichen adhärenten Morphologie. Maßstabsbalken 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52446/52446fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52446/52446fig2highres.jpg" /> Abbildung 2. Low-Anlage, serumfreien Bedingungen zu bereichern für Zellen mit TIC-Marker. (A) Durchflusszytometrie Analyse von ACI-23 Zellen mit APC konjugiert CD133-Antikörper zeigt einen erhöhten Anteil an CD133 + Zellen in niedrigen Befestigungsflaschen mit Serum-freien Stamm Zellmedien. Durchflusszytometrie-Analyse unter Verwendung Aldefluor Assay zeigt erhöhte ALDH-Aktivität in Zellen, die in niedrigen Befestigungs Kolben mit serumfreien Stammzellenmedium kultiviert. CD133 Negativkontrolle keine Antikörper und ALDH negativen con enthältSteuerung ist die aktivierte Substrat in der Gegenwart des ALDH-Inhibitor (DEAB). (B) Analyse mit FITC-konjugierten TRA-1-60 Antikörper zeigt höchsten Prozentsatz der TRA-1-60 + Zellen in den Schwimmer TIC Bedingungen in ACI-23-Zellen. Negativkontrolle enthält keine Antikörper. (C) CD133 + ALDH + Zellen am höchsten in der traditionellen TIC und Schwimmer TIC Bedingungen in der ACI-23-Zelllinie. Die Fehlerbalken: SEM, N = 6, * p &lt;0,05. (D) Westernblot-Analyse, die Erhöhung der Proteinspiegel von transkriptionalen Marker von Stammzellen in den ACI-23-Zellen in TIC Bedingungen 5 Tage lang kultiviert. Die gesamten Zellysate (50 ug) wurden mit GAPDH als Ladekontrolle analysiert. (E) Vertreter Dot-Plots von TGS-3 primären Asciteszellen wie in A analysiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52446/52446fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> Abbildung 3. Niederbefestigungs, serumfreien Bedingungen reichern für Zellen mit erhöhten Tumorigenität. (A) 5 x 10 5 lebensfähige ACI-23-Zellen wurden subkutan in athymische Nacktmäuse dreifach eingespritzt wird. Die Mäuse wurden gewogen und die Tumore mit einem Tastzirkel zweimal wöchentlich gemessen. A = Traditionelle adhärenten Kultur, F = Floater TIC Kultur, S = Traditionelle TIC Kultur. * P &lt;0,05. (B) Repräsentative Bilder von Tumoren nach 25 Tagen unter Verwendung von Zellen unter verschiedenen Kulturbedingungen gezüchtet von ACI-23 gebildet. (C) 5 × 10 5 lebensfähigen OVCAR-5-Zellen wurden subkutan in Nacktmäusen ohne Thymus dreifach injiziert und wie in A überwacht werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52446/52446fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a>

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In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

In vitro Anreicherung des Eierstockkrebs Tumor-initiierenden Zellen

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

13.7K Aufrufe.  National Cancer Institute. Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

Serie: In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Ein In Vitro System zur Tumor Vegetationsruhe und die Umstellung auf Metastasen Study

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Forschung

Medizin

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

In-vitro-Assay Mesothelzellen Ausverkauf, dass die Modelle der frühen Schritte der Metastasierung Eierstockkrebs

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical treatments and improved platinum-based chemotherapies, there has been little improvement in EOC survival rates for more than four decades 1,2. Whilst stage I tumors have 5-year survival rates &gt;85%, survival rates for stage III/IV disease are &lt;40%. Thus, the high rates of mortality for EOC could be significantly decreased if tumors were detected at earlier, more treatable, stages 3-5. At present, the molecular genetic and biological basis of early stage disease development is poorly understood. More specifically, little is known about the role of the microenvironment during tumor initiation; but known risk factors for EOCs (e.g. age and parity) suggest that the microenvironment plays a key role in the early genesis of EOCs. We therefore developed three-dimensional heterotypic models of both the normal ovary and of early stage ovarian cancers. For the normal ovary, we co-cultured normal ovarian surface epithelial (IOSE) and normal stromal fibroblast (INOF)&nbsp;cells, immortalized by retrovrial transduction of the catalytic subunit of human telomerase holoenzyme (hTERT) to extend the lifespan of these cells in culture. To model the earliest stages of ovarian epithelial cell transformation, overexpression of the CMYC oncogene in IOSE cells, again co-cultured with INOF cells. These heterotypic models were used to investigate the effects of aging and senescence on the transformation and invasion of epithelial cells. Here we describe the methodological steps in development of these three-dimensional model; these methodologies aren't specific to the development of normal ovary and ovarian cancer tissues, and could be used to study other tissue types where stromal and epithelial cell interactions are a fundamental aspect of the tissue maintenance and disease development.

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

We describe methodologies for establishing in vitro heterotypic three-dimensional models comprising ovarian fibroblasts and normal ovarian surface or ovarian cancer epithelial cells. We discuss the use of these models to study stromal-epithelial interactions that occur during ovarian cancer development.

Heterotypische Dreidimensionale<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellierung von Stromal-Epithelial Interaktionen beim Eierstockkrebs Initiation und Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to direct the motion of microparticles in a surface marker-independent manner. Traditionally, DEP devices include planar metallic electrodes patterned in the sample channel. This approach can be expensive and requires a specialized cleanroom environment. Recently, a contact-free approach called contactless dielectrophoresis (cDEP) has been developed. This method utilizes the classic principle of DEP while avoiding direct contact between electrodes and sample by patterning fluidic electrodes and a sample channel from a single polydimethylsiloxane (PDMS) substrate, and has application as a rapid microfluidic strategy designed to sort and enrich microparticles. Unique to this method is that the electric field is generated via fluidic electrode channels containing a highly conductive fluid, which are separated from the sample channel by a thin insulating barrier. Because metal electrodes do not directly contact the sample, electrolysis, electrode delamination, and sample contamination are avoided. Additionally, this enables an inexpensive and simple fabrication process.
cDEP is thus well-suited for manipulating sensitive biological particles. The dielectrophoretic force acting upon the particles depends not only upon spatial gradients of the electric field generated by customizable design of the device geometry, but the intrinsic biophysical properties of the cell. As such, cDEP is a label-free technique that avoids depending upon surface-expressed molecular biomarkers that may be variably expressed within a population, while still allowing characterization, enrichment, and sorting of bioparticles.
Here, we demonstrate the basics of fabrication and experimentation using cDEP. We explain the simple preparation of a cDEP chip using soft lithography techniques. We discuss the experimental procedure for characterizing crossover frequency of a particle or cell, the frequency at which the dielectrophoretic force is zero. Finally, we demonstrate the use of this technique for sorting a mixture of ovarian cancer cells and fluorescing microspheres (beads).

Contactless dielectrophoresis (cDEP) achieves sorting and enrichment of particles via their intrinsic dielectric properties. Fluidic electrode channels replace metallic electrodes traditional to DEP, suiting cDEP to non-damaging sterile characterization and sorting of biological particles. We demonstrate how to prepare a cDEP microdevice and conduct cell characterization and sorting experiments.

Markierungsfreie Isolierung und Anreicherung von Zellen durch Kontaktlose Dielektrophorese

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

Verfahren zur Gewinnung von Primäreierstockkrebszellen von Solid Proben

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

Beurteilung von Eierstockkrebs Sphäroid Bindung und Invasion von Mesothelzellen in Echtzeit

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

Bereicherung für chemoresistenten Eierstockkrebs Stammzellen aus menschlichen Zelllinien

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

Bewertung der Wirksamkeit der Krebsmedikament Sensibilisierung<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In-vivo-</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In vivo und ex vivo Ansätze für Eierstockkrebs Metastatische Colonization von Milky Punktstrukturen in Peritoneal Fettgewebe Studieren

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Methods Article

In vitro Anreicherung des Eierstockkrebs Tumor-initiierenden Zellen