We thank Dr. John Risinger and Memorial Health University Medical Center, Inc. for generously providing the ACI-23 cell line. The authors acknowledge financial support through the Postdoctoral Research Training (PRAT) Award to C. House from The National Institute for General Medical Sciences.

난소 암 세포주 1. 전통 문화 (점착 조건) 참고 : 세포와 미디어의 모든 처리는 멸균 조직 문화 후드에서 개최한다 <ol><li> 기존의 세포 배양 배지를 준비합니다. 한 DMEM : 1 사용 F12 (+ L 글루타민, 15 mM의 HEPES +)를 10 % 열 불 활성화 소 태아 혈청과 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 보충. 0.45 μm의 진공 필터를 사용하여 필터 솔루션입니다. </li><li> interest.Remove의 세포주 매우 낮은 냉동 또는 액체 질소에서 세포의 유리 병의 전통적인 이름, 날짜 표시 폴리스티렌 75cm 두 조직 배양 플라스크와 통로 수를 준비합니다. 5 분 동안 37 ℃의 수욕에 놓아 제상. </li><li> 3 ㎖를 (상기 제조 됨) 기존의 세포 배양 배지를 함유하는 15 ml의 원심 분리 튜브에 바이알로부터 전송 현탁액. 400 x g에서 5 분 동안 4 ° C에서 원심 분리기 서스펜션. 한편, 플라스크에 16 ml의 전통적인 세포 배양 배지를 추가합니다. </li><li>대기음 뜨는. 펠렛 및 전송 현탁액 플라스크 데 풀어 위아래로 2 ml의에게 기존의 세포 배양 미디어 피펫 세포를 사용. 조심스럽게 바위 플라스크에 균등하게 37 ° C, 5 % CO 2로 설정 가습 세포 배양 인큐베이터에서 cells.Place 플라스크를 배포합니다. 80 % 합류에 도달 할 때까지 세포를 매일 모니터한다. </li><li> 이 세포 배양 후드 : 일단 세포가 80 % 컨 플루 언트 한 배양을 분할. 기음 뜨는 (칼슘과 마그네슘없이) 따뜻한 인산염 완충 생리 식염수로 씻어 (PBS). 1.5 ml의 트립신 0.25 %의 -EDTA를 추가하고, 실온에서 3 ~ 5 분을 품어. </li><li> 이 새로운 폴리스티렌 75cm 2 플라스크를 준비하고 각각의 플라스크에 16 ml의에게 기존의 세포 배양 배지를 추가합니다. 새로운 플라스크 각각에 4 ㎖의 전통적인 세포 배양 배지와 같은 부피의 분취 세포를 트립신으로 재현 탁. </li><li> 가습 세포 배양 인큐베이터에 넣어 플라스크는 37 ° C, 5 % CO 2로 설정. 80 % 합류에 도달 할 때까지 세포를 매일 모니터한다. 세포를 분리하기 위해 계속-80에서 액체 질소의 문화 또는 동결 및 저장. </li></ol> 부동 또는 부착 세포를 사용하여 난소 암 세포주에서 다세포 타원체의 2 세대 참고 : 세포와 미디어의 모든 처리는 멸균 조직 문화 후드에서 개최한다. 2 전통 문화 방법에서 세포주를 배양 한 후 - 3 통로 (섹션 1) 다음 단계를 진행합니다. <ol><li> 줄기 세포 미디어를 준비합니다. 한 DMEM : F12 (+ L 글루타민, + 15 mM의 HEPES) 및 1 % 녹아웃 혈청 교체 (100 U의 최종 농도 / ㎖ 페니실린 및 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신) 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 보충 한 사용 0.4 % 소 혈청 알부민 및 0.1 % 인슐린 - 트랜스페린 - 셀렌. 0.45 μm의 진공 필터를 사용하여 필터 솔루션입니다. </li><li> 20 NG / ml 내지 10 N의 최종 농도를위한 재조합 인간 상피 성장 인자 (EGF) 및 인간 재조합 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (FGF)와 보충 줄기 세포 매체g / ㎖, 각각. 주 : 성장 인자는 사용 전에 바로 줄기 세포에 신선한 미디어를 첨가한다. </li><li> 플로터 TIC 문화를 만듭니다. 전통 부착 배양 조건에서 재배 80 % 융합 세포의 플라스크를 제거합니다. 뒤에 부착 인구를 떠나, 미디어 및 모든 부동 세포 (단일 및 집계)를 수집, 50 ml의 폴리 프로필렌 원심 분리 관에 전송할 수 있습니다. 400 x g에서 5 분 동안 4 ° C에서 원심 분리기 서스펜션. 주 : 부동 세포 응집체 명백 24-72 시간을 접착 세포 배양은 전통적 하에서 플라스크 접합 후의. 약 1.0의 80 % 융합 성 플레이트 검색 최저 - 5.0 × 10 5 가능한 부유 세포 세포주에 따라 예상 될 수있다. 본 연구에서는 80 % 합류 접착 배양 물로부터 수집 부유 세포 수의 평균은하기와 같다 : OVCAR5 5.0 ACI-23, 4.8 대 × 105 × 105, CAOV3 3.5 × 105, 및 TGS- 1.0 × 105 3. 전송시, 멀티 셀이 다소 세포주에 의존하지만 전통과 플로터 TIC 문화 울라 회전 타원체의 형성은 몇 일 이내에 발생합니다. 예를 들어, ACI-23 세포 응집체보다 더욱 용이 CAOV3 세포를 형성한다. </li><li> 한편, 이름, 날짜 및 세포주의 통로 번호로 라벨링 초저 부착면 폴리스티렌 75cm 2 조직 배양 플라스크를 준비한다. 플라스크에 성장 인자 보충 세포 미디어 줄기 ㎖로 (10)를 추가합니다. </li><li> 원심 분리 펠렛을 풀어 아래로 세포 미디어 줄기 ㎖로 6를 추가하고 피펫 팅에 의해 낮은 부착 플라스크에 완료, 기음 미디어 및 전송 펠릿되면. 가습 세포 배양 인큐베이터에 넣어 플라스크는 37 ° C, 5 % CO 2로 설정. 회전 타원체 형성을 관찰 3 일 - 매 2 세포를 모니터링합니다. </li><li> 기존 TIC 문화를 만듭니다. 전통 부착 배양 조건에서 재배 80 % 융합 세포의 플라스크를 제거합니다. 기음 미디어와 따뜻한 PBS로 세척한다. 1.5 ml의 트립신 0.25 %의 EDTA를 추가하고 배양 3-5RT에서 분. </li><li> 이름, 날짜 및 세포주의 통로 번호로 라벨링 초저 부착면 폴리스티렌 75cm 2 조직 배양 플라스크를 준비한다. 플라스크에 설명 된 바와 같이, EGF와 FGF 보충 세포 미디어, 줄기, 10 ㎖를 추가합니다. </li><li> 트립신과 플라스크에 세포 미디어 줄기 ㎖로 추가 6. 피펫 셀 솔루션은 상하 플라스크 표면에서 세포를 풀어 시도합니다. 세포의 전체 볼륨을 이동 (10)는 세포 미디어 줄기 ㎖로 포함 된 초저 부착 플라스크에. 가습 세포 배양 인큐베이터에 넣어 플라스크는 37 ° C, 5 % CO 2로 설정. </li><li> 각각 ml의 20 NG / 최종 농도가 10 ng를 / ㎖에 대한 세포 매체와 신선한 EGF와 FGF 줄기 ㎖로 추가 2 72 시간 - TIC 문화마다 48 보충. </li><li> 80 %의 합류에 도달 - 60까지 셀을 모니터링합니다. 이 새로운 초저 부착 플라스크에 같은 부피를 배치하고 18 ㎖의 최종 부피를 달성하기 위해 신선한 줄기 세포 매체를 첨가하여 분할 배양. 선택적인LY, 원심 분리기 400 x g에서 5 분 동안 4 ° C에서 전체 서스펜션. 줄기 세포 미디어 재현 탁 세포는 EGF와 FGF 보충하고 새로운 초저 부착 플라스크에 동일하게 배포 할 수 있습니다. 세포는 계대에 대한 단일 세포 현탁액으로 해리 할 필요가 없습니다. 참고 :이 시점에서 문화는 분리 배양, 냉동, 또는 실험적으로 분석 조작을 계속할 수 있습니다. 60 - 80 %의 합류 세포의 다음과 같은 농도는 ACI-23에 대해 검색했다 : 8.0 전통 자기편에 대한 × 10 (6), 전통 TIC 4.0 × 10 6, 플로터 TIC 문화 5.0 × 10 (6). 이 세포주 의존 할 수 있지만, 우리는 5 것으로 나타났습니다 - 문화에서 10 일 CD133 + ALDH + 세포의 비율로 TIC 농축을위한 최적의 처음 3 일 이내에 낮고, 5 봉우리 - 10 일, 그리고 다시 감소 십사일. </li></ol> 차 상피 난소 암 세포주 및 다세포 회전 타원체의 3 세대Chemoresistant 환자 복수에서 참고 : 심사위원회 (Institutional Review Board)의 승인이 프로토콜에 대한 얻었다. 세포와 미디어의 모든 처리는 멸균 조직 문화 후드에서 개최한다. <ol><li> 기존의 세포 배양 배지와 1 : 1 유체 플레이트 복수. 1 절에 설명 된대로 미디어를 준비하고 여러 전통 폴리스티렌 75cm 두 조직 배양 플라스크에 10ml를 추가합니다. </li><li> 복수 액은 일반적으로 1 L 멸균 진공 병에 제공된다; 진공 캡을 제거합니다. 조심스럽게 37 ° C, 5 % CO 2로 설정 가습 세포 배양 인큐베이터에서 10 ml의 전통적인 미디어와 장소를 포함 플라스크에 액체 10 ml의 복수를 추가합니다. 전체 미디어의 변화를 수행하기 전에, 96 시간 - 72 방해받지 둡니다. 80 % 합류 - 세포가 60에 도달 할 때까지 3 일 - 매 2 미디어 변경 </li><li> 2 절에 설명 된대로 섹션 1. TIC 문화에 설명 된대로 2 : - 세포가 60에 도달하면 80 %의 합류, 1 분할. 참고 : ascit에 존재하는 적혈구그들은 비 부착만큼 ES는 최초의 미디어 변경 후 제거됩니다. 그들은 더 민감하고 트립신에 최소한의 노출로 올라옵니다으로 존재하는 섬유 아세포 크게 트립신 처리 후 제거됩니다. 난소 암 세포의 순도는 CA-125 (MUC16)에 대한 항체를 사용하여 유세포 분석으로 측정 하였다. </li></ol> TIC 마커의 유동 세포 계측법 확인을위한 세포의 4. 염색 <ol><li> TIC 문화를 수집합니다. 50 ml의 폴리 프로필렌 원심 분리 관에 플라스크의 내용을 전송합니다. 400 x g에서 5 분 동안 원심 분리기 현탁액. 기음 미디어와 따뜻한 PBS로 세척한다. 대단히 짧은 시간을 깨고 하나의 세포로 해리 아래로 37 ° C에서 5 분, 최대 피펫과 -, 2 ml의에게 비 효소 세포 분리 솔루션을 추가 3 품어. 세포 미디어 줄기 ㎖로 4를 추가합니다. </li><li> 자기편 문화를 수집합니다. 기음 미디어와 따뜻한 PBS로 세척한다. 3 ㎖에게 비 효소 세포 분리 솔루션을 추가하고 3 부화 - 37 ° C에서 5 분. 기존의 세포 3 ML을 추가문화 미디어는 최대 피펫 반복 아래 플라스크에서 세포를 분리하는 원심 분리기 튜브에 수집합니다. </li><li> 원심 분리기 TIC 400 x g에서 5 분 동안 부착 현탁액 모두. 상등액을 버리고 3 % 소 태아 혈청을 함유하는 1 ml의 PBS에 재현 탁 각 펠릿. RT 30 분에 품어. 한편, 트리 판 블루를 사용하여 가능한 세포의 수를 계산합니다. 타원체가 하나의 세포로 해리 확인하기 위해 현미경으로 세포를 관찰합니다. </li><li> 보상 1) 흠을 (흠없는 제어) 보상, 2) ALDH (단일 얼룩 양성 대조군) 보상, 3) CD133을 (단일 얼룩 양성 대조군), 4 : 다음 배양 조건의 각 라벨 5 X 1.5 에펜 도르프 튜브 ) ALDH + CD133 (실험 시료), 5) FL-1, FL-4 채널, 각각)에서 DEAB + ALDH (형광 배경에 대한 부정적인 제어합니다. </li><li> 400 × g으로 5 분 동안 원심 분리기 (4) 서스펜션 - 튜브 # 1~ 약 5 × 105 세포에 각각 분배. 기음 supernata500 μL Aldefluor 분석 버퍼에서 NT 및에 resuspend 펠렛. 실험 부정적인 제어 튜브 # 5에 10 μL의 DEAB (ALDH 억제제)를 추가합니다. </li><li> 보상 양성 대조군과 혼합하는 영화에 대한 관 # 2에 Aldefluor 시약 활성화 5 μl를 추가합니다. 실험 분석을 위해 튜브 # 4 Aldefluor 시약 활성화 5 μl를 추가합니다. 톡 튜브를 혼합하고 즉시 DEAB을 포함 튜브 # 5 (250 μL)에 튜브 # 4에서 세포의 절반 볼륨을 전송합니다. </li><li> 톡 튜브는 잘 혼합합니다. 빛으로부터 보호 37 ° C에서 45 분 - 30에 대한 모든 튜브를 품어. 톡 튜브의 중간 잠복기를 통해 세포가 바닥에 닿고있다. 원심 분리기 400 x g에서 5 분 동안 모든 튜브. 500 μL Aldefluor 분석 버퍼에 기음 뜨는에 resuspend 세포. </li><li> CD133 염색과 튜브 (# 3, # 4), 직접 Aldefluor 분석 버퍼에 CD133-APC 1:11 추가합니다. 빛으로부터 보호 얼음에 15 분을 품어. 400 x g에서 5 분 동안 원심 분리기 CD133 튜브. 한 번 세척분석 완충액 500 μL Aldefluor. 각각 500 μL Aldefluor 분석 완충액에 재현 탁 세포. </li><li> 셀 스트레이너 캡 개별 폴리스티렌 원형 바닥 튜브에 필터 현탁액. 전체 볼륨 캡을 통해 여과되어 있는지 확인합니다. </li><li> 세포 집단을 분석하는 플로우 사이토 미터를 사용한다. 보상 제어를 설정하는 튜브에게 # 1-3를 사용합니다. 세포 파편을 제외해야되고, 세포를 앞으로 사용 및 측면 산란 매개 변수, 게이트. ALDH +와 CD133 + 각각 FL-1, FL-4 채널을 사용하여 두 번 세포를 설정합니다. </li><li> 유세포 분석 프로그램을 사용하여 배양 조건이 두 마커 높은 염색 있어야 TIC 풍부한 배양 등 TIC 세포의 비율을 향상 확인. 참고 : CD133 및 ALDH 외에 다른 markersof 난소 암 틱은 유동 세포 측정기의 성능에 의존하는 임의의 하나의 샘플에 사용 된 마커들의 수와 분석 될 수있다. </li></ol> 5. 생체 내 </em&gt;는 피하 주사는 세포 인구의 발암을 확인하기 참고 : 심사위원회 (Institutional Review Board)의 승인이 프로토콜에 대한 얻었다. 3 케이지의 실험 그룹으로 세 8 주 및 주사하기 전에 며칠 동안 적응 할 수 있도록 - 흉선 여성 누드 마우스 (6)를 배포합니다. NIH 동물 관리 및 사용위원회에 따라 인도적인 실험 지침에 따라 마우스를 따라; 체중 감소 또는 20 % 이상을 확보, 수척 외관, 설사 피부염 체중, 신체적 외모를 모니터링 및 CO 2 질식에 의해 이러한 기준에 맞는 마우스를 안락사. <ol><li> 1 ml의 PBS에서 2 절 재현 탁 각각의 세포 집단에 설명 된대로 문화를 수집합니다. 트리 판 블루 분석법을 이용하여 가능한 세포를 계산합니다. </li><li> 15 ml의 원심 분리기 튜브를 준비합니다. 중으로 대책 각 튜브에 2 ml의 PBS 중에 희석 1.5 × 106 생세포를 추가 (0.5 ml의 부피의 5 × 105 세포를 피하 주입 F 오른쪽 될각 마우스의 여윈). 만 제어 마우스 0.5 ml의 PBS를 준비합니다. </li><li> 27 G 바늘을 사용하여, 그룹 당 3 마우스의 각각의 오른쪽 측면에 TIC 문화를 뜨는 또는 PBS, 전통 부착 문화, 전통 TIC 문화에서 0.5 ml의 세포 현탁액을 subcutaneouslyinject. 원래 케이지 포스트 분사에 마우스를 돌려줍니다. </li><li> 마우스 무게와 길이와 폭을 수립, 버니어 캘리퍼스 weeklyby 두 번 두 차원에서 어떤 만져서 알 수있는 종양을 측정한다. 주 : 종양 대기 시간은 일반적으로 20 - 세포주에 따라 50 일. </li><li> 표준 방법 (V = (폭) 2 × 길이 / 2)에 의해 종양 젖은 볼륨을 계산합니다. 참고 :이 연구는, 유사한 조건 하에서 성장 틱의 생체 시리얼 계대가 다른 11,20에 의해 완성 된 첫 번째 세대에 대한 부착 세포 대 틱의 발암를 비교하지만. </li></ol>

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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase+in+combination+with+CD133+defines+angiogenic+ovarian+cancer+stem+cells+that+portend+poor+patient+survival.">Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival.</a> Cancer Res. 71, 3991-4001 (2011).</li><li>Jaggupilli, A., Elkord, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+CD44+and+CD24+as+cancer+stem+cell+markers:+an+enduring+ambiguity.">Significance of CD44 and CD24 as cancer stem cell markers: an enduring ambiguity.</a> Clin Dev Immunol. 2012, 708036 (2012).</li><li>Irollo, E., Pirozzi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133:+to+be+or+not+to+be,+is+this+the+real+question.">CD133: to be or not to be, is this the real question.</a> Am J Transl Res. 5, 563-581 (2013).</li><li>Ma, I., Allan, A. 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J Stem Cell Res Ther. 3, 10-4172 (2013).</li><li>Rajasekhar, V. K., Studer, L., Gerald, W., Socci, N. D., Scher, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-initiating+stem-like+cells+in+human+prostate+cancer+exhibit+increased+NF-&#954;B+signalling.">Tumour-initiating stem-like cells in human prostate cancer exhibit increased NF-&#954;B signalling.</a> Nat Commun. 2, 162 (2011).</li><li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Oct4+and+Nanog+transcription+network+regulates+pluripotency+in+mouse+embryonic+stem+cells.">The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells.</a> Nat Genet. 38, 431-440 (2006).</li><li>Tay, Y., Zhang, J., Thomson, A. M., Lim, B., Rigoutsos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+to+Nanog,+Oct4+and+Sox2+coding+regions+modulate+embryonic+stem+cell+differentiation.">MicroRNAs to Nanog, Oct4 and Sox2 coding regions modulate embryonic stem cell differentiation.</a> Nature. 455, 1124-1128 (2008).</li><li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+impact+of+the+cancer+stem+cell-related+marker+NANOG+in+ovarian+serous+carcinoma.">Prognostic impact of the cancer stem cell-related marker NANOG in ovarian serous carcinoma.</a> Int J Gynecol Cancer. 22, 1489-1496 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

여기에 설명 된 프로토콜이 확립 난소 암 세포주에서 줄기 세포 기능과 세포 배양 물을 풍부하게 할 수있는 효과적이고 일관된 방법을 제시하고, 기본 환자 샘플에 적용 가능하다. 이 방법은 성공적 다양한 세포주 걸쳐 TICS위한 풍부. 그것은 물리적으로 인구 내에서 비​​ 틱에서 틱를 정렬하는 시간을 고려하지 않고, TIC 및 / 또는 종양 표현형에 대한 풍부 조건을 적시에 식별 할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 서로 다른 신호 경로의 상대 수준의 기능 분석을 사용하여 다양한 배양 TIC 전통적인 접착 배양을 비교하여 TIC 표현형 기여도에 대해 평가 될 수있다. 순수한 TIC 인구 원하는 경우, 분리 용이 프로토콜 유세포 형광의 보조 또는 자기 정렬 공정을 도입함으로써 달성 될 수있다. 그것은, 그러나, 명심하는 것이 중요하다 TIC 마커의 발현예컨대 CD133, CD44, 또는 같은 ALDH들, 세포주 또는 동일한 유형의 종양 샘플 환자마다 다를 수있다. 예를 들어 우리는 역이 ACI-23에 해당하는 반면, OVCAR-5 세포는 CD133에 CD44 상대적으로 높은 표현을 가지고 있음을 발견했다. 이 마우스에서 종양 개시에 의존 TIC 존재의 결정적인 등 유동 세포 계측법 분석하는 것이 적절하다. 난소 암 세포는 줄기 세포에서 성장 조건 때이 프로토콜에 따라, 높은 ALDH 활성을 일관되게 관찰 하였다. ALDH가 뜨는 TIC 조건에서 가장 높은 반면 흥미롭게 CD133의 발현은 기존 TIC의 배양 조건에서 배양 ACI-23 세포에서 높은 수치이다. 대조적 TGS -3- 차 전지는 복수 뜨는 TIC 조건 CD133 양성의 작은 증가하지만, 전통적인 TIC 조건 ALDH 활성의 현저한 증가를 표시. 이러한 연구 결과는 난소 암 세포의 이질성 일반적 TICS와 연관된 가소성 강조. 더 CIA 요원을 지원하기 위해이러한 방법은 틱을 향상 메신저, TRA-1-60 양성 세포의 농축도 관찰되었다. TRA-1-60 능성 마커 및 TICS 전립선 암 (30-32)뿐만 아니라 배아 난소 암종 및 고환을 식별하는 데 사용되어왔다. 우리의 방법은 다양한 세포주를 성공적으로 완료되었지만,이 변성 뜨는 조건이 더 좋은 다른 난소 암 세포 집단에서 틱 풍성 동안 표준 TIC 조건 일부 난소 암 세포에 더 적합 할 수도있다. 이는 다시 두 환자 유래의 확립 및 난소 암 세포주 내의 예상 이질성을 강조. 이러한 마커는 난소 암 틱 특정 아니며 오히려 배아 줄기 세포의 분화능에 중요한 인자들을 나타내지 만 세포 표면 마커에 더하여에 Nanog, SOX2, 10 월 4-11 포함 난소 암 틱을 특성화 도시 된 여러 전사 인자가 있는데 및 DIFferentiation (33, 34). 우리는 이러한 요소의 단백질 수준의 변화를 검사하고 Nanog를 수준이 다른 13,35뿐만 아니라 CD133, TRA-1-60, 및 CD117와 일치, TIC의 배양 조건에서 증가 할 것으로 나타났다. 인간 줄기 세포 마커의 cDNA 배열은 또한 기존에 비해 접착 조건 TIC 조건 CD133, Nanog를, 멜크 및 PODXL 유전자의 증가를 보였다. 중요한 것은,이 세포 표면 마커로서, 난소 TICS와 연관된 전사 인자 세포주 및 환자 샘플에 따라 다를 수 있음을 알아야한다. 우리는 그들이 시험관 내에서 본질적으로 비 - 부착 세포 인 경우보다 종양 형성하고 줄기 세포 마커의 발현 수준이 높은 것을 관찰 할 수있다 (즉, 용이하게 부착 판에 부착되지 않은 세포를 부유). 문화, 이러한 ACI-23 등의 세포주는 일반적으로 전통 문화 CONDIT에서 적층 방식으로 수직 성장 많은 가능한 부동 세포 및 / 또는 세포가이온. 부동 세포 집계에서 틱의 농축에 성공이 본 연구와 OVCAR-3 (12)을 포함하여 상대적으로 적은 수에 적용 세포주 수는 있지만, 우리의 연구 결과는이보다 종양 인구를 나타낼 수 좋습니다. 따라서, 상업적인 줄기 세포 매체 저조한 적응 셀, TIC 농축 다른 방법으로 작용할 수있다 표준 조직 배양 플레이트에서 성장 매체 세포 &quot;부동&quot;인구를 수확. 이 논문에서 제시된 다양한 배양 방법의 사용은 TIC 개체군 빠른 농축 및 다른 셀들에서이 표현형을 지원 요인을보다 잘 이해할 수있게된다. 이 방법의 현재 응용 프로그램은 신호 전달 경로는 세포의 독특한 인구의 전파를 지원하는 필수적인 특성화를 포함한다. 이러한 연구 결과는 종양 진행과 재발의 메커니즘을 명확히하는 데 도움이 될 것입니다.

난소 암은 이환율과 사망률이 질병의 높은 재발, chemoresistant 기능되는 주요 원인으로 미국에서 가장 치명적인 부인과 악성 종양이다. 어떤 경우에는 하나시킬 수있는 유용한 항암 요법을 제안 일부 증거가 있지만 차 처리는 일반적으로, 최대 환원성 수술 이후의 백금 계 요법을 포함한다. 대부분의 환자는 일차 치료에 호의적으로 반응하지만, 불행히도 반 18 개월이 내에 재발합니다. 대부분 난소 종양은 상피 암종 및 난소 또는 난관 3,4의 표면 상피에서 기원 할 수있다. 몇몇 연구는 아마도 배란 5,6- 다음 필요한 조직 복구에 도움 여성 생식 시스템의 체세포 줄기 세포의 존재를 지원한다. ovul 동안 난소 및 나팔관 모두에서 높은 증식 활동토 오크 (. Gharwan, 등 제출 원고) 난소 암의 발달에 중요한 요인이 될 수있다. 종양 형성 세포의 유래는 불분명하지만 그들은 분할 또는 운명을 통제 할 수없는 그들을 렌더링 돌연변이를 통해 정상 줄기 세포 전구 세포, 또는 분화 세포에서 발생할 수 있습니다. 이 세포는 또한 &quot;암 시작 세포&quot; &quot;암 줄기 세포,&quot;또는라고 한 낮은 첨부 조건 하에서 종양, 다세포 타원체로 성장할 수 있습니다. TIC 개발의 계층 모델은 동적 일 수 있지만, 틱 화학 요법, 장기간의 자기 갱신과 각종 세포 계통 7,8으로 분화하는 능력이 정지 된 저항을 포함하여 정상 줄기 세포와 같은 다양한 기능을 공유 않는다. 몇몇 연구 난소 암 틱의 존재를 지원하고 현재 노력이 종양 세포가 9-11을 지원하는 메커니즘 (들)을 명확하게 진행되고. 각 마커의 실제 기여도는 불분명 11-16 및 특정 세포 유형이 될 수 있지만, 몇몇 표식은, CD133, ALDH1A1, CD117, CD44 및 발암에서 MyD88 포함한 향상된 난소 TICS를 식별하기 위해 제안되었다. 보편적 마커 나 마커 세트가 명백하게 난소 틱 설립되지는 않았지만, 다른 그룹은 높은 알데히드 탈수소 효소 (ALDH) 활동 13,17-21와 CD44 +, 대한 CD133 + 및 / 또는 셀을 선택하여 더 일반적으로 난소 틱을 격리했다. CD44는 히알루 론산에 대한 수용체 역할을하며 부착, 증식, 이동, 혈관 신생 및 분화 (22)를 포함하는 종양 진행, 중요한 몇 가지 과정을 조절하는 횡단 당 단백질이다. CD133 누구 함수 여전히 불분명하지만 연구가 세포막 토폴로지 (23)를 구성 제안 경막 당 단백질이다. ALDH, 알데히드의 산화를 촉매하는 효소의 세포 내, 가장 UNIVERS 수있다고 활성 등의 알 틱 마커는 정상 줄기 세포 및 틱 (24)를지지 ALDH에 기인 된 여러 조직 및 다양한 역할로부터 단리 줄기 세포에서 발견되었습니다. 현재로서는, CD133 및 ALDH1 난소 틱 13,21의 가장 재현 마커로 나타납니다. 틱의 특성을 이해하는데에 더하여, 특히이 모집단을 대상으로 약물을 확인하는 큰 노력도있다. 난소 암과 관련된 높은 재발률이 성공적으로 틱을 근절하기 위해 현재 화학 요법의 실패 원인 일 수 있습니다. 종양의 부피가 기존 치료법에 민감하지만, 틱은 저항성 및 표준 방법에 의해 탐지 밀도 것으로 생각된다. 치료 내성 및 종양 재발의 메커니즘은 해명 응답 및 난소 암 환자의 생존율을 향상하는 것이 중요하다. 여기서, 배양 기술이 설명된다 번째설립 및 기본 난소 암 세포주에서 틱 풍성. 본원에 기재된 배양 조건은 줄기 세포와 자질 11,12,14,16,20 TICS 타원체 또는 세포 증식을 유도하는 여러 그룹에 의해 사용되어왔다. 일반적 틱 농축에 사용되는 여러 가지 줄기 세포 배양 매개체 보충제가 있지만 / 스페 로이드 우리는 EGF와 FGF와 혈청이없는 배지 수식을 사용하지만, B27 또는 N-2 보조제의 첨가없이. 일반적으로 신경 세포의 배양 및 줄기 세포 풍부하게 사용될 선택된 보조제, 중배엽 표현형 25,26 홍보 도시 간충직 또는 상피 표현형을 갖는 TICS 더 발암 여부에 관한 분야에서 불확실성이 남아있다 27-29 . 변수 불확실성을 최소화하기 위해, 우리는 우리가 상피 성 난소 암 세포를 처리하기 때문에, 일반적인 식을 사용하여 선택했다. 낮은 부착 플라스크에 무 혈청 배지에서 세포를 유지회전 타원체 형성을 용이하게하고 및 CD133의 발현 ALDH 높은 활성을 갖는 세포의 증식을 지원한다. 우리의 작업은 더 정상 부착 상태에서 떠있는 세포는 더 종양 TIC 인구를 나타낼 수 있음을 보여 주었다있다. 무 흉선 누드 마우스에서 이러한 조건에서 성장한 세포의 주입은 혈청의 존재하에 부가 된 조건에서 배양 세포에 비해 더 높은 전위에 발암 리드. 난소 암 개시, 진행, 치료 반응 및 질환의 재발 틱의 역할에 관한 많은 정보가이 기술의 사용을 통해 얻어 질 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1066">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:104px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:308px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">75 cm2 Ultra - Low Attachment Flask</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:104px;">3814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">75 cm2 Tissue Culture Flask</td>
			<td style="width:191px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:104px;">83.1813.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Aldefluor Kit</td>
			<td style="width:191px;">Stemcell Technologies</td>
			<td align="right" style="width:104px;">1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">CD133-APC</td>
			<td style="width:191px;">Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td style="width:104px;">130-090-826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Fibroblast Growth Factor - Basic human recombinant</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">F0291</td>
			<td>Prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Epidermal Growth Factor - human recombinant</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">E9644</td>
			<td>Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">DMEM:F12 (+L-Glutamine, +5 mM HEPES)</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">1X Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (Without Calcium and Magnesium)</td>
			<td style="width:191px;">Corning cellgro</td>
			<td style="width:104px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">0.25% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution</td>
			<td style="width:191px;">Corning cellgro</td>
			<td style="width:104px;">25-056-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A9418-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Insulin-Transferrin-Selenium</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:104px;">10828010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated)</td>
			<td style="width:191px;">Gemini</td>
			<td style="width:104px;">100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 micron)</td>
			<td style="width:191px;">Nalgene</td>
			<td style="width:104px;">450-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:104px;">430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube</td>
			<td style="width:191px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:104px;">352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl</td>
			<td style="width:191px;">Lonza</td>
			<td style="width:104px;">17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro enrichment of ovarian cancer tumor-initiating cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

TIC의 배양 조건에서 배양 동일한 세포 TIC 인구 공통 회전 타원체 형태를 떠 표시 할 반면, 난소 암 세포주 및 장착 혈청 쇼 조약돌 형태의 존재 하에서 전통적인 접착 배양 조건에서 배양 일차 복수 세포주를 설치했다. 그림 1에 표시 시야 화상이 선명 배양 조건의 형태 학적 차이를 보여줍니다. 그림 1B는 기존의 부착 상태에서 ACI-23 및 TGS-3 TIC 문화를 replating 후 달성 차별화 된 형태학을 보여줍니다. 전형적인 부착 세포를 닮은, 그냥 24 시간 부착 된 상태에서 다시 파종 후, 다세포 타원체의 대부분은 해리와 표면에 부착합니다. 분석은 난소 틱의 두 가지 일반적인 마커를 사용하여 수행 된 세포 계측법 TIC 조건이 흐름 줄기 세포 마커와 세포 풍부 있는지 확인하려면 - CD133의 expressio을n 및 ALDH 활동. 그림 2 점 플롯은 낮은 첨부, 무 혈청 조건에서 CD133 + 세포의 증가 비율을 강조 표시합니다. 마찬가지로, ALDH 효소의 활성은 전통적인 접착 배양 조건에 비해 다음과 같은 상태에서 더 높다. 전통적인 부착 배양 CD133 + 세포, 회전 타원체의 형성을 강화 조건 백분율 증가를 포함 않는다. 만능 마커 분석, TRA-1-60, TIC 조건 틱, 그림 2 B에 대해 풍부하게하는 것이 더 지원을 빌려 준다. 그림 2 C의 정량 더블 플러스 (CD133 + ALDH +) ACI-23 세포가 크게 TIC 강화 조건 하에서 성장 문화로 제한되어 있음을 보여줍니다. TIC 조건에서 배양 5 일 후 ACI-23 세포에서 발생하는 다른 전사 인자의 단백질 수준에서의 변화도 조사 하였다. 마커의 각 점진적 증가s는 자기편 문화에서 볼 수있는 상대적으로 낮은 수준, 그림 2 D에 비해 TIC 조건을 뜨는 전통에서 볼 수있다. 흥미롭게 다양한 조건에서 재배 복수 인간 세포주 뜨는 TIC 전혀 오염 조건의 존재도 2 E 거의없이 전통적인 TIC 조건 하에서 최고 표현형 마커를 표시한다. TIC의 배양 조건의 발암는 흉선 누드 마우스의 동료에 모든 조건에서 획득 가능한 세포 같은 수의 피하 주사를 통해 검증 하였다. (3)이 보여 그림이 ACI-23 (A, B)와 OVCAR-5 (C) 세포에서 전통 부착 문화 TIC 문화보다 덜 종양이었다. 뜨는 TIC 배양 전통적인 부착 또는 전통적인 TIC 배양보다 짧은 시간에 더 큰 종양을 유의 제조. 이 DATA는 심지어 난소 TIC 마커의 완만 한 증가, 극적인 표현형의 변화가 있음을 시사한다. 그러나 다른 세포주 (미도시)와 함께 기존의 TIC 배양 물은 전통적인 뜨는 TIC 및 접착 배양 세포보다 종양 형성했다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52446/52446fig1highres.jpg" /> 다른 배양 조건에서도 1 회전 타원체 개발. (A) 설립 난소 암 세포주 (ACI-23, OVCAR-5 및 CAOV3) 및 혈청이없는 낮은 부착 플라스크에서 성장 기본 환자 유래의 복수의 셀 (TGS-3) 줄기 세포 미디어는 쉽게 다세포 타원체를 형성한다. 이미지는 TIC 조건에서 96 시간 내에 구 상체를 형성 같은 세포 반면, 전통적인 부착 배양 조건은 ACI-23의 상피 조약돌 형태를 유지 OVCAR-5, CAOV3 및 TGS-3 세포 보여줍니다. 스케일 바 100 μm의. 24 시간 노출시 (B)전통 부착 배양 조건에, TIC 문화 모폴로지는 원래 부착 형태를 닮은 차별화 된 표현형을 표시합니다. 스케일 바 100 μm의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52446/52446fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52446/52446fig2highres.jpg" /> 그림 2. 낮은 부착, 무 혈청 조건 TIC 마커 세포 풍부. (A) CD133 항체 결합 APC를 사용하여 ACI-23 세포의 유동 세포 계측법 분석은 무 혈청 줄기 낮은 부착 플라스크에 CD133 + 세포의 증가 비율을 보여줍니다 세포 미디어. Aldefluor 분석 프로그램을 이용하여 분석 유동 세포 계측법은 무 혈청 줄기 세포 미디어 낮은 부착 플라스크에서 배양 세포에서 ALDH 활동을 증가했다. CD133 음성 대조군은 항체 및 ALDH 부정적인 사기꾼이 없습니다트롤 ALDH 억제제 (DEAB)의 존재 하에서 활성화 된 기판이다. FITC 복합 TRA-1-60 항체를 이용하여 (B) 분석 ACI-23 세포에서 뜨는 TIC 조건 TRA-1-60 + 세포의 가장 높은 비율을 보여줍니다. 음성 대조군은 항체를 포함하지 않는다. (C) + CD133 + 세포는 ALDH 전통적인 TIC에서 최고이고 ACI-23 세포주 TIC 조건 뜨는. 오차 막대 : SEM, N = 6, * P &lt;0.05. (D) 웨스턴 블롯 분석은 5 일간 배양 조건 TIC ACI-23 세포에서 줄기 세포의 전사 마커 단백질 수준에서의 증가를 도시. 전체 세포 용 해물 (50 μg의)을 로딩 대조군으로서 GAPDH 분석 하였다. (E)에서와 같이 분석 TGS-3 차 복수 세포의 대표 도트 플롯. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52446/52446fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 그림 3. 낮은 부착, 무 혈청 조건이 증가 발암와 세포 풍부. (A) 5 × 10 5 가능한 ACI-23 세포는 피하 세중를 누드 마우스에 주입했다. 마우스의 무게를 측정하고 종양은 일주일에 두 번 캘리퍼스로 측정. A = 전통 부착 문화, F = 플로터 TIC 문화, S = 전통 TIC 문화. * P &lt;0.05. (B) 다른 배양 조건에서 성장 된 세포를 사용 이십오일 후 ACI-23에서 형성된 종양의 대표적인 이미지. (C) 5 × 10 5 가능한 OVCAR-5 세포는 피하 세중를 누드 마우스에 주입과 같이 관찰 하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52446/52446fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

난소 암 종양 시작 세포의 생체 농축에

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

13.7K 조회수.  National Cancer Institute. Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

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An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

체외에서</em전이성 종양 성장에 휴면하고 스위치를 연구하기> 시스템

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

연구

의학

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

체외 Mesothelial 정리 분석에서는 그것이 난소 암 전이의 초기 단계 모델

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical treatments and improved platinum-based chemotherapies, there has been little improvement in EOC survival rates for more than four decades 1,2. Whilst stage I tumors have 5-year survival rates &gt;85%, survival rates for stage III/IV disease are &lt;40%. Thus, the high rates of mortality for EOC could be significantly decreased if tumors were detected at earlier, more treatable, stages 3-5. At present, the molecular genetic and biological basis of early stage disease development is poorly understood. More specifically, little is known about the role of the microenvironment during tumor initiation; but known risk factors for EOCs (e.g. age and parity) suggest that the microenvironment plays a key role in the early genesis of EOCs. We therefore developed three-dimensional heterotypic models of both the normal ovary and of early stage ovarian cancers. For the normal ovary, we co-cultured normal ovarian surface epithelial (IOSE) and normal stromal fibroblast (INOF)&nbsp;cells, immortalized by retrovrial transduction of the catalytic subunit of human telomerase holoenzyme (hTERT) to extend the lifespan of these cells in culture. To model the earliest stages of ovarian epithelial cell transformation, overexpression of the CMYC oncogene in IOSE cells, again co-cultured with INOF cells. These heterotypic models were used to investigate the effects of aging and senescence on the transformation and invasion of epithelial cells. Here we describe the methodological steps in development of these three-dimensional model; these methodologies aren't specific to the development of normal ovary and ovarian cancer tissues, and could be used to study other tissue types where stromal and epithelial cell interactions are a fundamental aspect of the tissue maintenance and disease development.

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

We describe methodologies for establishing in vitro heterotypic three-dimensional models comprising ovarian fibroblasts and normal ovarian surface or ovarian cancer epithelial cells. We discuss the use of these models to study stromal-epithelial interactions that occur during ovarian cancer development.

3 차원 Heterotypic<em&gt; 체외에서</em난소 암 개시 및 진행하는 동안 Stromal - 상피 조직의 상호 작용&gt; 모델링

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to direct the motion of microparticles in a surface marker-independent manner. Traditionally, DEP devices include planar metallic electrodes patterned in the sample channel. This approach can be expensive and requires a specialized cleanroom environment. Recently, a contact-free approach called contactless dielectrophoresis (cDEP) has been developed. This method utilizes the classic principle of DEP while avoiding direct contact between electrodes and sample by patterning fluidic electrodes and a sample channel from a single polydimethylsiloxane (PDMS) substrate, and has application as a rapid microfluidic strategy designed to sort and enrich microparticles. Unique to this method is that the electric field is generated via fluidic electrode channels containing a highly conductive fluid, which are separated from the sample channel by a thin insulating barrier. Because metal electrodes do not directly contact the sample, electrolysis, electrode delamination, and sample contamination are avoided. Additionally, this enables an inexpensive and simple fabrication process.
cDEP is thus well-suited for manipulating sensitive biological particles. The dielectrophoretic force acting upon the particles depends not only upon spatial gradients of the electric field generated by customizable design of the device geometry, but the intrinsic biophysical properties of the cell. As such, cDEP is a label-free technique that avoids depending upon surface-expressed molecular biomarkers that may be variably expressed within a population, while still allowing characterization, enrichment, and sorting of bioparticles.
Here, we demonstrate the basics of fabrication and experimentation using cDEP. We explain the simple preparation of a cDEP chip using soft lithography techniques. We discuss the experimental procedure for characterizing crossover frequency of a particle or cell, the frequency at which the dielectrophoretic force is zero. Finally, we demonstrate the use of this technique for sorting a mixture of ovarian cancer cells and fluorescing microspheres (beads).

Contactless dielectrophoresis (cDEP) achieves sorting and enrichment of particles via their intrinsic dielectric properties. Fluidic electrode channels replace metallic electrodes traditional to DEP, suiting cDEP to non-damaging sterile characterization and sorting of biological particles. We demonstrate how to prepare a cDEP microdevice and conduct cell characterization and sorting experiments.

비접촉식 유전을 통해 라벨이없는 분리 및 세포의 농축

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

고체 시편에서 기본 난소 암 세포를 얻는 방법

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

실시간으로 중피 세포의 난소 암 회전 타원체의 부착과 침략의 평가

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

인간 세포주에서 Chemoresistant 난소 암 줄기 세포에 대한 심화 학습

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

암 약물 과민 반응의 효과를 평가<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

생체 내 및 생체 외 복막 지방이에 밀키 스팟 구조의 난소 암 전이성 식민지를 연구하는 접근 방식

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.