We thank Dr. John Risinger and Memorial Health University Medical Center, Inc. for generously providing the ACI-23 cell line. The authors acknowledge financial support through the Postdoctoral Research Training (PRAT) Award to C. House from The National Institute for General Medical Sciences.

卵巣癌細胞株の1伝統文化（接着条件） 注：細胞および培地の全ての処理は、無菌の組織培養フード内で行われるべきである<ol><li>従来の細胞培養培地を準備します。 1 DMEM：1使用F12（+ L-グルタミン+ 15mMのHEPES）を、10％熱不活化ウシ胎児血清および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補足する。 0.45μmの真空フィルターを使用してフィルタソリューション。 </li><li>名前、日付、およびinterest.Removeの細胞株超低冷凍庫または液体窒素からの細胞のバイアルの継代数で標識された伝統的なポリスチレン75センチメートル2組織培養フラスコを準備します。 5分間37℃の水浴中に置くことによって、除霜。 </li><li> 3ミリリットルの伝統的な細胞培養培地（上記で調製）を含む15ml遠心管にバイアルから転送サスペンション。 400×gで5分間4℃で遠心サスペンション。一方、フラスコに16ミリリットルの伝統的な細胞培養培地を加える。 </li><li>上清を吸引。フラスコにペレットと転写懸濁液を緩め上下2ミリリットル、伝統的な細胞培養培地をピペット細胞を使用して。穏やかにロックフラスコに均等に37℃、5％CO 2に設定した加湿細胞培養インキュベーター中cells.Placeフラスコを配布する。 80％のコンフルエンスに達するまで、毎日の細胞を監視します。 </li><li> 2細胞培養フード内：細胞は一旦80％コンフルエント培養物1を分割する。上清を吸引し（カルシウムおよびマグネシウムを含まない）、温かいリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄する。 1.5ミリリットルトリプシン0.25％-EDTAを追加し、室温で3〜5分間インキュベートする。 </li><li> 2新しいポリスチレン75センチメートル2フラスコを準備し、各フラスコに16ミリリットルの伝統的な細胞培養培地を追加。新しいフラスコのそれぞれに4ミリリットル従来の細胞培養培地と等量のアリコートでトリプシン処理した細胞を再懸濁する。 </li><li>加湿細胞培養インキュベーター内の場所フラスコを37℃、5％CO 2に設定する。 80％のコンフルエンスに達するまで、毎日の細胞を監視します。細胞を分割し続け、-80または液体窒素中で文化や凍結して保存。 </li></ol>フローティングまたは接着細胞を用いた卵巣癌細胞株から多細胞スフェロイドの2世代注：細胞および培地の全ての処理は、無菌の組織培養フード内で行われるべきである。 2のための伝統的な培養法の下で細胞株を培養した後 - 3継代（セクション1）は、次の手順に進みます。 <ol><li>幹細胞のメディアを準備します。 1 DMEM：F12（+ L-グルタミン+ 15mMのHEPES）と、1％のノックアウト血清代替物（100 U / mlの最終濃度のペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシン）、1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補足1を使用0.4％ウシ血清アルブミン、および0.1％のインスリン - トランスフェリン - セレニウム。 0.45μmの真空フィルターを使用してフィルタソリューション。 </li><li> 20ng / mlのと10のn最終濃度のヒト組換え上皮成長因子（EGF）およびヒト組み換え塩基性線維芽細胞増殖因子（FGF）と補足幹細胞培地G / mlで、それぞれ。 NOTE：成長因子は、使用直前に、幹細胞培地を新鮮な添加すべきである。 </li><li>フローターTIC文化を作成します。伝統的な接着性の培養条件で成長させた80％のコンフルエント細胞のフラスコを削除します。背後に付着した人口を残して、メディア、すべての浮遊細胞（単一および凝集）を収集し、50ミリリットルのポリプロピレン遠心管に移す。 400×gで5分間4℃で遠心サスペンション。 注：浮遊細胞および凝集体は明らかである24から72時間後に付着細胞が伝統文化の下でフラスコに取り付けされた後。約1.0〜80％コンフルエントのプレートから検索- 5.0×10 5生存浮遊細胞は、細胞株に依存して、期待することができる。 TGS-ための5×10 5.0 5 ACI-23のために、4.8×10 5 OVCAR5ために、3.5×10 5 CAOV3ための、および1.0×10：この研究では、80％のコンフルエント接着培養から収集した浮遊細胞の平均数であった3。転送の際に、マルチセル伝統的でウラルスフェロイド形成とTIC文化をフローター、これはやや依存性細胞株であるが、数日以内に発生します。例えば、ACI-23細胞は、より容易にCAOV3細胞よりも凝集体を形成する。 </li><li>一方、名前、日付、および細胞株の継代数で標識された超低取付面ポリスチレン75cm 2の組織培養フラスコを調製する。フラスコに成長因子を添加した細胞メディア幹ミリリットル10を追加します。 </li><li>遠心分離が完了したら、6を追加することによって、低付着フラスコに培地を吸引し、転送ペレットを細胞培地とピペットアップ幹ミリリットルダウンペレットを緩める。加湿細胞培養インキュベーター内の場所フラスコを37℃、5％CO 2に設定する。回転楕円体の形成を観察するために3日間 - ごとに2細胞を監視します。 </li><li>伝統的なTIC文化を作成します。伝統的な接着性の培養条件で成長させた80％のコンフルエント細胞のフラスコを削除します。吸引し、メディアと温かいPBSで洗浄する。 1.5ミリリットルトリプシン0.25％EDTAを加え、インキュベート3から5RTで分。 </li><li>名前、日付、および細胞株の継代数で標識された超低接着表面ポリスチレン75cm 2の組織培養フラスコを調製する。フラスコに、説明したように、EGFおよびFGFを補充した細胞培地を、ステム10ミリリットルを加える。 </li><li>トリプシンでフラスコに細胞媒体幹ミリリットル6を追加します。上下にピペット細胞溶液とフラスコ表面から細胞を緩めしよう。 10を含有する超低付着フラスコに細胞のボリューム全体を転送する細胞培地幹ミリリットル。加湿細胞培養インキュベーター内の場所フラスコを37℃、5％CO 2に設定する。 </li><li>それぞれ、ミリリットル/ 20ng / mlのおよび10ngの最終濃度のための細胞培地と新鮮なEGFとFGF幹mlの追加の2で72時間 - TICの文化ごとに48を補足する。 </li><li> 80％のコンフルエンスに達した - 60までのセルを監視します。 2新しい超低付着フラスコに等しい体積を配置し、18 mlの最終容積を達成するために、新鮮な幹細胞培地を添加することにより、分割培養。代替案LY、400×gで5分間4℃で遠心全体サスペンション。幹細胞培地中で細胞を再懸濁は、EGFとFGFを補充し、新しい超低付着フラスコに均等に分配する。細胞は、継代のために、単一細胞懸濁液に解離される必要はない。 注：この時点で培養を分割し、培養し、凍結、または実験的に解析するために操作し続けることができる。フローターTIC培養のための伝統的な接着性、伝統TICのために4.0×10 6 8.0×10 6、および5.0×10 6：80％の細胞の以下の濃度は、ACI-23のために検索された合流- 60。 10日、と再び減少 - CD133 + ALDH +細胞の割合は、最初の3日以内に5位のピークは低いとしてTIC濃縮に最適な培養液中で10日間 - それは細胞株に依存するかもしれませんが、私たちは5ことを見出した14日。 </li></ol>初代上皮卵巣癌細胞株および多スフェロイドの3世代化学療法抵抗性患者の腹水から注：治験審査委員会の承認が、このプロトコルが得られた。細胞および培地の全ての取扱いは無菌の組織培養フード内で行われるべきである。 <ol><li>従来の細胞培養培地との1：1液体プレート腹水。セクション1で説明したようにメディアを準備し、いくつかの伝統的なポリスチレン75cm 2の組織培養フラスコに10ミリリットルを追加します。 </li><li>腹水は、通常は1 Lの滅菌真空ボトルで提供されている。真空キャップを外す。慎重に37℃、5％CO 2に設定した加湿細胞培養インキュベーター中で10ミリリットル従来のメディアと場所を含むフラスコする流体を10mlの腹水を追加する。完全なメディアの変更を行う前に、96時間 - 72静かにしておきます。 80％のコンフルエンス - 細胞が60に達するまで3日間 - すべての2メディアを変更</li><li>項1. TIC培養で説明したようにセクション2で説明したように2： - 細胞が60に達すると、80％コンフルエントに、1分割。 注：ascitに存在する赤血球それらは非接着性であるようにesが最初の培地交換の後に除去される。存在するいずれの線​​維芽細胞は、主に、彼らはより敏感であり、トリプシンに最小限の露出で持ち上げるようにトリプシンで処理した後に削除されます。卵巣癌細胞の純度は、CA-125（MUC16）に対する抗体を用いたフローサイトメトリー分析により決定した。 </li></ol> TICマーカーのフローサイトメトリ確認のための細胞の4染色<ol><li> TICの文化を収集します。を50mlのポリプロピレン遠心管にフラスコの内容物を移す。 400×gで5分間遠心懸濁液。吸引し、メディアと温かいPBSで洗浄する。 2mlのに非酵素的細胞解離溶液を加えインキュベート3 - 37°Cで5分間、そしてピペッティング上下塊を破壊し、単細胞に解離する。細胞媒体幹ミリリットル4を追加します。 </li><li>接着培養を収集します。吸引し、メディアと温かいPBSで洗浄する。 3ミリリットルの非酵素的細胞解離溶液を加え、インキュベート3 - 37°Cで5分間。従来のセル3ミリリットルを追加します。培養培地およびフラスコから細胞を剥離し、遠心管に収集するために繰り返して上下にピペッティング。 </li><li>遠心TIC 400×gで5分間付着懸濁液両方。上清を捨て、3％のウシ胎児血清を含む1mlのPBSで各ペレットを再懸濁。 RTで30分インキュベートする。一方、トリパンブルーを用いて生存細胞の数を数える。スフェロイドは、単一の細胞に分離されている確認するために、顕微鏡で細胞を観察します。 </li><li>以下の培養条件のそれぞれのラベル5×1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブ：1）未染色（補正用の非染色対照）、2）ALDH（補償のための単一の染色陽性対照）、3）、CD133（補償のための単一の染色陽性対照）、4 ）ALDH + CD133（実験試験サンプル）、および5）DEAB + ALDH（FL-1、FL-4チャンネルにおけるバックグラウンド蛍光のためのネガティブコントロール、それぞれ）。 </li><li> 400×gで5分間4.遠心懸濁液-チューブに約5×10 5細胞それぞれの＃1を配布します。吸引しsupernata500μlのALDEFLUORアッセイバッファーでNTおよび再懸濁ペレット。実験的な負の制御のためのチューブ＃5に10μlのDEAB（ALDH阻害剤）を追加します。 </li><li>補償ミックスするポジティブコントロールとフリックのためのチューブ＃2にALDEFLUOR試薬を活性化した5μlを添加する。実験的な分析のためのチューブ＃4にALDEFLUOR試薬を活性化した5μlを添加する。フリック管が混在し、すぐにDEABが含まれているチューブ＃5（250μL）にチューブ＃4からの細胞の半分のボリュームを転送します。 </li><li>フリックチューブはよく混合する。光から保護し、37℃で45分間 - 30すべてのチューブをインキュベートします。細胞が底に沈むようフリック管は、潜伏期間の途中で。 400×gで5分間遠心操作は、すべてのチューブ。 500μlのALDEFLUORアッセイ緩​​衝で吸引し上清および再懸濁細胞。 </li><li> CD133染色でチューブ用（＃3、＃4）、直接ALDEFLUORアッセイバッファーにCD133-APC 1時11分を追加します。光から保護氷上で15分間インキュベートします。 400×gで5分間遠心CD133管。 1回洗浄アッセイ緩​​衝ALDEFLUOR 500μL。それぞれ500μlのALDEFLUORアッセイバッファー、で細胞を再懸濁。 </li><li>セルストレーナーキャップを有する個々のポリスチレン丸底チューブにフィルタ懸濁液。ボリューム全体がキャップを介して濾過されていることを確認。 </li><li>細胞集団を分析するためにフローサイトメーターを使用する。補償制御を設定するためのチューブを＃1-3を使用してください。フォワードの使用及び側方散乱パラメータ、ゲート細胞、細胞破片を除外するようにしてくださいという。それぞれ、ALDH +およびCD133 +ダブルFL-1を用いて細胞およびFL-4チャネルを確立します。 </li><li>フローサイトメトリー分析プログラムを用いて、培養条件は、これらの二つのマーカーのためのより高い染色を有するべきであるTIC富む培養物TIC細胞の割合を高め確認する。 NOTE：CD133およびALDHに加えて、他のmarkersof卵巣癌のTICは、フローサイトメーターの能力に依存するいずれかのサンプルで使用されるマーカーの数を分析することができる。 </li></ol> 5. インビボ </eM&gt;皮下注射細胞集団の腫瘍形成性を確認するために、 注：治験審査委員会の承認が、このプロトコルが得られた。 3のケージでの実験群に8週齢と注射前に数日間順応できるようにする - 6胸腺欠損雌ヌードマウスを配布します。 NIH動物実験委員会に従って人道的な実験的なガイドラインの下でマウスに従ってください。体重、体重減少などの物理的な外観を監視したり、20％を超える、衰弱外観、下痢または皮膚炎を得て、CO 2窒息によってこれらの基準を当てはめたマウスを安楽死させる。 <ol><li> 1mlのPBSに再懸濁部2の各細胞集団に記載のように培養物を収集する。パンブルーアッセイを用いて生細胞を数える。 </li><li> 15ミリリットル遠心管を準備します。三重の対策について（0.5ミリリットルの容量で5×10 5個の細胞を皮下右Fに注入され、各チューブに2mlのPBSで希釈した1.5×10 6生細胞を追加各マウスの痩せ細った）。唯一の対照マウスのために0.5mlのPBSを準備します。 </li><li> 27 G針を使用して、群あたり3匹のマウスのそれぞれの右脇腹にTIC培養フロータ、またはPBS、従来の付着培養、従来のTIC培養から0.5ミリリットルの細胞懸濁液をsubcutaneouslyinject。オリジナルのケージ、注射後にマウスを返します。 </li><li>マウスを秤量し、ノギスweeklyby回二次元で任意の触知可能な腫瘍を測定し、長さと幅を設定する。 注： - 細胞株に応じて50日腫瘍待ち時間通常20である。 </li><li>標準的な方法（V =（幅）2×長さ/ 2）による腫瘍湿潤体積を計算します。 注：この研究は、最初の世代のために、接着性細胞対のTICの腫瘍形成を比較したが、同様の条件下で成長したのTIC のin vivoでの連続継代は他人11,20によって完成されたものである。 </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+human+aldehyde+dehydrogenase+in+normal+and+cancer+stem+cells.">The role of human aldehyde dehydrogenase in normal and cancer stem cells.</a> Stem Cell Rev. 7, 292-306 (2011).</li><li>McLean, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ovarian+carcinoma&#8211;associated+mesenchymal+stem+cells+regulate+cancer+stem+cells+and+tumorigenesis+via+altered+BMP+production.">Human ovarian carcinoma&#8211;associated mesenchymal stem cells regulate cancer stem cells and tumorigenesis via altered BMP production.</a> J Clin Invest. 121, 3206-3219 (2011).</li><li>Amara, I., Touati, W., Beaune, P., de Waziers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+as+cellular+vehicles+for+prodrug+gene+therapy+against+tumors.">Mesenchymal stem cells as cellular vehicles for prodrug gene therapy against tumors.</a> Biochimie. , (2014).</li><li>Brabletz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMT+and+MET+in+metastasis:+where+are+the+cancer+stem+cells.">EMT and MET in metastasis: where are the cancer stem cells.</a> Cancer Cell. 22, 699-701 (2012).</li><li>Latifi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+tumor+cells+from+the+ascites+of+ovarian+cancer+patients:+molecular+phenotype+of+chemoresistant+ovarian+tumors.">Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors.</a> PLoS One. 7, e46858 (2012).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+Cancer+Stem+Cells+Transition+between+Epithelial+and+Mesenchymal+States+Reflective+of+their+Normal+Counterparts.">Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts.</a> Stem Cell Reports. 2, 78-91 (2014).</li><li>Malecki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRA-1-60(+),+SSEA-4(+),+Oct4A(+),+Nanog(+)+Clones+of+Pluripotent+Stem+Cells+in+the+Embryonal+Carcinomas+of+the+Ovaries.">TRA-1-60(+), SSEA-4(+), Oct4A(+), Nanog(+) Clones of Pluripotent Stem Cells in the Embryonal Carcinomas of the Ovaries.</a> J Stem Cell Res Ther. 2, (2012).</li><li>Malecki, M., Tombokan, X., Anderson, M., Malecki, R., Beauchaine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> TRA-1-60(+), SSEA-4(+), POU5F1(+), SOX2(+), NANOG(+) Clones of Pluripotent Stem Cells in the Embryonal Carcinomas of the Testes. J Stem Cell Res Ther. 3, 10-4172 (2013).</li><li>Rajasekhar, V. K., Studer, L., Gerald, W., Socci, N. D., Scher, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-initiating+stem-like+cells+in+human+prostate+cancer+exhibit+increased+NF-&#954;B+signalling.">Tumour-initiating stem-like cells in human prostate cancer exhibit increased NF-&#954;B signalling.</a> Nat Commun. 2, 162 (2011).</li><li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Oct4+and+Nanog+transcription+network+regulates+pluripotency+in+mouse+embryonic+stem+cells.">The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells.</a> Nat Genet. 38, 431-440 (2006).</li><li>Tay, Y., Zhang, J., Thomson, A. M., Lim, B., Rigoutsos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+to+Nanog,+Oct4+and+Sox2+coding+regions+modulate+embryonic+stem+cell+differentiation.">MicroRNAs to Nanog, Oct4 and Sox2 coding regions modulate embryonic stem cell differentiation.</a> Nature. 455, 1124-1128 (2008).</li><li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+impact+of+the+cancer+stem+cell-related+marker+NANOG+in+ovarian+serous+carcinoma.">Prognostic impact of the cancer stem cell-related marker NANOG in ovarian serous carcinoma.</a> Int J Gynecol Cancer. 22, 1489-1496 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ここで説明するプロトコルは、確立された卵巣癌細胞株由来の幹細胞の特徴を有する細胞を培養液を濃縮するための効率的かつ一貫した方法を提供し、一次患者試料に適用可能である。このメソッドは、成功した種々の細胞株全体でのTICのために豊かにします。これは、物理的に集団内の非のTICからのTICのソートに時間をかけずに、TICおよび/または腫瘍形成表現型を濃縮するための条件を適時に同定を可能にする。このようにして、異なるシグナル伝達経路の相対的レベルは、機能的な種々のアッセイを用いてTIC培養物に従来の付着培養物を比較することによって、TICの表現型への寄与について評価することができる。純粋TIC集団が所望される場合、単離が容易にプロトコル、フローサイトメトリーで蛍光アシストや磁気選別工程を組み込むことによって達成することができる。 しかし、心に留めておくことが重要であるTICマーカーの発現そのようなCD133、CD44、またはALDHなどsは、細胞株または同じ腫瘍タイプの患者サンプル間で変化してもよい。例えば、我々は逆ACI-23についても同様であるのに対し、OVCAR-5細胞は、CD133へのCD44の相対的な高い発現を持っていることがわかった。これは、マウスでの腫瘍の開始に依存しており、TICの存在の決定的なようにフローサイトメトリー分析することが適切である。卵巣癌細胞、幹細胞条件で​​成長させた場合に、このプロトコルに従って、高いALDH活性が一貫して観察された。 ALDHはフローターTIC条件で最高であるのに対して、興味深いことには、CD133の発現は、伝統的なTIC培養条件下で増殖したACI-23細胞において一貫して高い。これとは対照的にTGS-3主要腹水細胞はフローターTICの条件でCD133陽性のわずかな増加が、従来のTIC条件下でのALDH活性の著しい増加を表示する。これらの知見は、卵巣癌細胞の不均一性と一般のTICに関連した可塑性を強調表示します。さらにCLAをサポートするために、これらの方法はのTICを高めるイムは、TRA-1-60陽性細胞の富化はまた、観察された。 TRA-1-60多能性のマーカーであり、胚性卵巣および精巣の癌、ならびに前立腺癌TICS 30-32を識別するために使用されている。我々の方法は、多数の細胞株を用いて成功しているが、それは修正されたフローター条件が良い他の卵巣癌細胞集団でのTICを富化しながら、標準TIC条件は、いくつかの卵巣癌細胞に対してより適しているかもしれない可能性がある。これは再び患者由来の両方の卵巣癌細胞株を確立中で予想される不均一性を強調している。 細胞表面マーカーに加えて、これらのマーカーは、卵巣癌のTICに固有のものではなく、むしろ、胚性幹細胞の多能性のための重要な要素を表しているが、Nanog遺伝子、Sox2が、Oct-4の11を含む卵巣癌のTICを特徴付けることが示されているいくつかの転写因子であるとDIFferentiation 33,34。我々は、これらの因子のタンパク質レベルの変化を調べ、Nanogのレベルは、他13,35並びにCD133、TRA-1-60、およびCD117と一致して、TIC培養条件下で増加することを見出した。ヒト幹細胞マーカーのcDNA配列はさらに、伝統的な付着条件と比較してTIC条件におけるCD133、Nanogは、メルク、及びPODXL遺伝子の増加を示した。重要なことには、細胞表面マーカーと同様に、卵巣のTICに関連付けられた転写因子は、細胞株および患者サンプル間で変化してもよいことに留意すべきである。 我々は、in vitroで本質的に非接着性である場合、細胞がより腫瘍形成性であること、および幹細胞マーカーの高いレベルを発現することができることを観察した（ すなわち、容易に接着性プレートに付着しない浮遊細胞）。培養中に、そのようなACI-23のような細胞株は、通常、従来の培養コンディット下スタッキング方式で垂直に成長し、多くの実行可能な浮遊細胞および/または細胞を有するイオン。浮遊細胞凝集体からのTICの成功した濃縮が本研究とOVCAR-3 12を含め、比較的少数の細胞株に適用できるかもしれないが、我々の調査結果がこの腫瘍形成性集団である可能性が示唆された。したがって、商業幹細胞培地にあまり適応細胞を、TIC濃縮の代替方法として機能することができる標準的な組織培養プレートおよび培地で増殖させた細胞の「浮動」集団を採取する。 この原稿で提示異なる培養方法の使用はTIC集団の迅速な濃縮および異なる細胞におけるこの表現型をサポートしてどのような要因をより良く理解できるようになります。この方法の現在のアプリケーションは、シグナル伝達経路は、細胞のこのユニークな人口の伝播をサポートするために不可欠な特徴があります。これらの研究からの結果は、腫瘍の進行および再発のメカニズムを解明するのに役立つ。

卵巣癌は、罹患率および死亡率の主な原因は、この疾患の高度に再発性、化学療法抵抗性の特徴であると、米国で最も致死的な婦人科悪性腫瘍である。ネオアジュバント療法は、いくつかのケース1に有益であるかもしれないことを示唆するいくつかの証拠があるが、一次治療は、通常、最大の腫瘍縮小手術とその後の白金系療法を含む。大多数の患者は、一次治療に良好に反応するが、残念ながら半分は18ヶ月2以内に再発します。 ほとんどの卵巣の悪性腫瘍は、上皮癌であると卵巣や卵管3,4の表面上皮に由来することがあります。いくつかの研究は、おそらく排卵5,6以下に必要とされる組織の修復を支援する女性生殖器系における体性幹細胞の存在をサポートしています。 ovul中の卵巣と卵管の両方で高い増殖活性ationが卵巣癌の開発における重要な要因であるかもしれません（Gharwan ら提出された原稿）。腫瘍形成細胞の誘導は不明であるが、それらは分裂または運命を調節することができ、それらをレンダリングする突然変異を通して正常な幹細胞、前駆細胞、または分化細胞から生じ得る。これらの細胞はまた、「癌開始細胞」、「癌幹細胞」、またはと呼ばれており、低接着条件下での腫瘍形成、多細胞スフェロイドへと成長することができる。 TIC開発の階層モデルは、動的であってもよいが、のTICは、静止、化学療法に対する耐性、長期自己再生および様々な細胞系統7,8に分化する能力を含め正常な幹細胞と同じ特徴の多くを共有しない。 いくつかの研究は、卵巣癌でのTICの存在を支持し、現在の努力は、これらの細胞が腫瘍形成9-11をサポートする機構（単数または複数）を明確にするために進行中である。各マーカーの正確な寄与は不明であり、11〜16の特定の細胞型であってもよいが、いくつかのマーカーは、CD133、ALDH1A1、CD117、CD44、およびMyD88を含む強化された腫瘍形成性卵巣のTICを識別するために提案されている。ユニバーサルマーカーまたはマーカーセットが明確に卵巣のTICのために確立されていないが、別のグループは、高いアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ALDH）活性13,17-21でCD44 +、のためにCD133 +および/ ​​または細胞を選択することによって、より一般的に卵巣のTICを単離した。 CD44は、ヒアルロン酸の受容体として作用し、接着、増殖、遊走、血管新生および分化22を含む、腫瘍の進行に重要ないくつかのプロセスを調節する膜貫通糖タンパク質である。 CD133は、その機能はまだ不明であるが、研究では、それは形質膜トポロジー23を編成を示唆している膜貫通糖タンパク質である。 ALDH、アルデヒドの酸化を触媒する細胞内酵素は、ほとんどのユニバースとすることができる高活性としてのTICの他のマーカーは、正常な幹細胞とのTIC 24をサポートするALDHに起因している組織および複数の役割の多様から単離された幹細胞で同定されている。今のところ、CD133とALDH1は、卵巣のTIC 13,21の最も再現性のマーカーであると思われる。 のTICの特性を理解することに加えて、特にこの亜集団を標的とする薬剤を同定するために大きな努力もある。卵巣癌に伴う高い再発率は正常に目盛りを根絶するための現行の化学療法の失敗に起因する可能性がある。腫瘍の大部分は、既存の治療に感受性であるが、のTICは、抵抗性の標準的な方法により検出できない濃度であると考えられる。治療抵抗性及び腫瘍再発のメカニズムの解明は、応答および卵巣癌患者の全生存率を改善することが不可欠である。 ここで、培養技術は、目に記載されている確立からのTICおよび原発性卵巣癌細胞株についてエンリッチた。本明細書に記載の培養条件は、幹細胞の性質11,12,14,16,20でのTICまたはスフェロイド細胞の増殖を誘導するために、いくつかのグループによって使用されてきた。一般のTIC /スフェロイドを濃縮するために使用されるいくつかの幹細胞培養のマスコミとサプリメントがあるが、我々はEGFとFGFとの無血清培地式を用いたが、B27またはN-2補充物を添加しない。これらのサプリメントは、一般に幹細胞の神経細胞培養および富化のために使用間葉表現型25,26を促進することが示されており、フィールドのいくつかの不確実性は、間葉または上皮表現型を有するのTICは27-29、より腫瘍形成性であるか否かが依然として存在する。不確実性と変数を最小限に抑えるために、我々は、上皮性卵巣癌細胞を扱っているため、最も一般的な計算式を使用することにしました。 低付着フラスコ中の無血清培地中で細胞を維持する回転楕円体の形成を促進し、CD133の発現と高いALDH活性を有する細胞の増殖をサポートしています。私たちの仕事は、さらに通常の接着性の条件下では、浮遊細胞はまた、より多くの腫瘍形成TIC集団を表現できることを示したている。無胸腺ヌードマウスにこれらの条件下で増殖した細胞の注入は、血清の存在下で結合条件で培養した細胞と比較して、より高い腫瘍形成能をもたらす。卵巣癌の開始、進行、治療応答、及び疾患再発中のTICの役割に関する多くの情報は、これらの技術を用いて得ることができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1066">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:104px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:308px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">75 cm2 Ultra - Low Attachment Flask</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:104px;">3814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">75 cm2 Tissue Culture Flask</td>
			<td style="width:191px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:104px;">83.1813.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Aldefluor Kit</td>
			<td style="width:191px;">Stemcell Technologies</td>
			<td align="right" style="width:104px;">1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">CD133-APC</td>
			<td style="width:191px;">Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td style="width:104px;">130-090-826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Fibroblast Growth Factor - Basic human recombinant</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">F0291</td>
			<td>Prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Epidermal Growth Factor - human recombinant</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">E9644</td>
			<td>Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">DMEM:F12 (+L-Glutamine, +5 mM HEPES)</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">1X Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (Without Calcium and Magnesium)</td>
			<td style="width:191px;">Corning cellgro</td>
			<td style="width:104px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">0.25% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution</td>
			<td style="width:191px;">Corning cellgro</td>
			<td style="width:104px;">25-056-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A9418-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Insulin-Transferrin-Selenium</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:104px;">10828010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated)</td>
			<td style="width:191px;">Gemini</td>
			<td style="width:104px;">100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 micron)</td>
			<td style="width:191px;">Nalgene</td>
			<td style="width:104px;">450-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:104px;">430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube</td>
			<td style="width:191px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:104px;">352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl</td>
			<td style="width:191px;">Lonza</td>
			<td style="width:104px;">17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro enrichment of ovarian cancer tumor-initiating cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

確立された卵巣癌細胞株および添付の血清ショーの存在下で、従来の接着培養条件下で増殖させた一次腹水細胞株、玉石の形態、TIC培養条件下で増殖させた同じ細胞は、TICの集団において、共通のフローティングスフェロイドの形態を表示するのに対し。 図1のAに表示された明視野画像は、明らかに、培養条件の形態学的な違いを示す。 図1Bは、従来の接着性の条件でACI-23およびTGS-3 TIC文化を再播種後に達成差別形態を示している。典型的な接着細胞に似ている、ちょうど24時間付着した条件には播種後、多細胞スフェロイドの大半は解離して、表面に付着する。 CD133 expressio - 幹細胞マーカーは、フローサイトメトリー分析でTICの条件は細胞を濃縮することを確認するには、卵巣のTIC 2つの一般的なマーカーを用いて行ったnおよびALDHの活動。 図2のAに示すドットプロットは、低付着、無血清条件でCD133 +細胞の割合の増加を強調する。同様に、ALDH酵素の活性は、従来の接着培養条件と比較して、これらの条件で高い。なお、従来の接着性培養物は、CD133 +細胞が、スフェロイド形成を増強する条件下で増加割合を含む。多能性マーカーの分析は、TRA-1-60は、TICの条件はチック、 図2のBを濃縮することをさらに支持を与える。 図2 Cでの定量化は、二重陽性（CD133 + ALDH +）ACI-23細胞は、主にTIC強化する条件の下で増殖させた培養物に限定されていることを示している。 TICの条件で5日間の培養後のACI-23細胞において生じる異なる転写因子のタンパク質レベルの変化も調べた。マーカーの各々の漸進的増加sは、接着培養で見られる比較的低いレベルの、 図2のDに比べTIC条件をフロータするために、従来から見られる。興味深いことに、様々な条件で増殖させたヒト腹水細胞株は、フローターTIC条件、 図2のEに存在していない染色に少ないとの伝統的なTIC条件の下で最高のマーカー表現型を表示します。 TIC培養条件の腫瘍形成性無胸腺ヌードマウスのコホートに、全ての条件から得られた生存細胞の等しい数の皮下注射によって検証した。3実証するACI-23（A、B）およびOVCAR-5（C）細胞を図伝統的な接着培養は、TICの文化からのものよりも小さい腫瘍形成した。フローターTIC文化は伝統的な接着性や伝統的なTIC培養よりも短い時間でより大きな腫瘍を生成したことに注意してください。これらのDアタも卵巣TICマーカーの適度な増加で、劇的な表現型の変化があることを示唆している。しかしながら、他の細胞系（図示せず）を有する従来のTIC培養物は、伝統的な接着性とフロータTIC培養細胞よりも腫瘍形成性であった。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52446/52446fig1highres.jpg" /> 異なる培養条件下における図1スフェロイド開発。（A）を設立卵巣癌細胞株（ACI-23、OVCAR-5及びCAOV3）および無血清低付着フラスコ中で増殖させ、一次患者由来の腹水細胞（TGS-3）幹細胞培地を容易に多細胞スフェロイドを形成する。画像は、同じ細胞がTIC条件で96時間以内に、スフェロイドを形成し、一方、従来の接着培養条件は、ACI-23上皮敷石状形態、OVCAR-5、CAOV3およびTGS-3細胞を維持示す。スケールバーは100μm。 24時間の曝露すると（B）従来の接着培養条件に、TIC文化形態は、元の接着性の形態学に似た分化した表現型を表示する。スケールバーは100μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52446/52446fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52446/52446fig2highres.jpg" /> 図2.低付着、無血清条件下でTICマーカーを有する細胞を濃縮する。（A）APC結合CD133抗体を用いたACI-23細胞のフローサイトメトリー分析は、無血清ステムと低付着フラスコでCD133 +細胞の割合の増加を実証細胞培地。 ALDEFLUORアッセイショーを使用してフローサイトメトリー分析は、血清を含まない幹細胞培地と低接着フラスコで培養した細胞においてALDH活性を増加させた。 CD133陰性コントロールは、抗体およびALDH負の詐欺が含まれていませんコントロールは、ALDH阻害剤（DEAB）の存在下で活性化された基板である。 FITC結合TRA-1-60抗体を用いた（B）の分析は、ACI-23細胞でのフローターTIC条件でのTRA-1-60 +細胞の最も高い割合を示しています。陰性コントロールには抗体が含まれていません。 （C）CD133 + ALDH +細胞は、従来のTICに最高であり、ACI-23細胞株におけるTIC条件フロータ。エラーバー：SEM、N = 6、*はp &lt;0.05。 （D）5日間TIC条件下で培養されたACI-23細胞における幹細胞の転写マーカーのタンパク質レベルの増加を示すウエスタンブロット分析。全細胞溶解物（50μgの）はローディングコントロールとしてGAPDHを用いて分析した。 （E）のように分析したTGS-3主要腹水細胞の代表的なドットプロット。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52446/52446fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図3.低付着、無血清条件下で増加した腫瘍形成能を有する細胞を濃縮する。（A）5×10 5生存ACI-23細胞を皮下に三重に無胸腺ヌードマウスに注射した。マウスの体重を測定し、腫瘍を週に2回キャリパーで測定した。 =伝統接着培養、F =フローターTIC文化、S =伝統TIC文化。 *はp &lt;0.05。 （B）は、異なる培養条件下で増殖させた細胞を用いて25日後のACI-23から形成された腫瘍の代表的な画像。 （C）5×10 5実行可能なOVCAR-5細胞を皮下に三重で無胸腺ヌードマウスに注射し、Aのように監視した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52446/52446fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

卵巣がんの腫瘍開始細胞の体外富化

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

13.7K ビュー.  National Cancer Institute. Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

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An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

アンインビトロ</em転移性増殖に腫瘍の休眠とスイッチを研究する>システム

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

医学

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

in vitroで中皮クリアランスアッセイでそのモデルの卵巣がんの転移の初期段階を

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical treatments and improved platinum-based chemotherapies, there has been little improvement in EOC survival rates for more than four decades 1,2. Whilst stage I tumors have 5-year survival rates &gt;85%, survival rates for stage III/IV disease are &lt;40%. Thus, the high rates of mortality for EOC could be significantly decreased if tumors were detected at earlier, more treatable, stages 3-5. At present, the molecular genetic and biological basis of early stage disease development is poorly understood. More specifically, little is known about the role of the microenvironment during tumor initiation; but known risk factors for EOCs (e.g. age and parity) suggest that the microenvironment plays a key role in the early genesis of EOCs. We therefore developed three-dimensional heterotypic models of both the normal ovary and of early stage ovarian cancers. For the normal ovary, we co-cultured normal ovarian surface epithelial (IOSE) and normal stromal fibroblast (INOF)&nbsp;cells, immortalized by retrovrial transduction of the catalytic subunit of human telomerase holoenzyme (hTERT) to extend the lifespan of these cells in culture. To model the earliest stages of ovarian epithelial cell transformation, overexpression of the CMYC oncogene in IOSE cells, again co-cultured with INOF cells. These heterotypic models were used to investigate the effects of aging and senescence on the transformation and invasion of epithelial cells. Here we describe the methodological steps in development of these three-dimensional model; these methodologies aren't specific to the development of normal ovary and ovarian cancer tissues, and could be used to study other tissue types where stromal and epithelial cell interactions are a fundamental aspect of the tissue maintenance and disease development.

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

We describe methodologies for establishing in vitro heterotypic three-dimensional models comprising ovarian fibroblasts and normal ovarian surface or ovarian cancer epithelial cells. We discuss the use of these models to study stromal-epithelial interactions that occur during ovarian cancer development.

三次元異<em&gt; in vitroで</em卵巣がんの発生と進行中に間質相互作用の上皮&gt;モデリング

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to direct the motion of microparticles in a surface marker-independent manner. Traditionally, DEP devices include planar metallic electrodes patterned in the sample channel. This approach can be expensive and requires a specialized cleanroom environment. Recently, a contact-free approach called contactless dielectrophoresis (cDEP) has been developed. This method utilizes the classic principle of DEP while avoiding direct contact between electrodes and sample by patterning fluidic electrodes and a sample channel from a single polydimethylsiloxane (PDMS) substrate, and has application as a rapid microfluidic strategy designed to sort and enrich microparticles. Unique to this method is that the electric field is generated via fluidic electrode channels containing a highly conductive fluid, which are separated from the sample channel by a thin insulating barrier. Because metal electrodes do not directly contact the sample, electrolysis, electrode delamination, and sample contamination are avoided. Additionally, this enables an inexpensive and simple fabrication process.
cDEP is thus well-suited for manipulating sensitive biological particles. The dielectrophoretic force acting upon the particles depends not only upon spatial gradients of the electric field generated by customizable design of the device geometry, but the intrinsic biophysical properties of the cell. As such, cDEP is a label-free technique that avoids depending upon surface-expressed molecular biomarkers that may be variably expressed within a population, while still allowing characterization, enrichment, and sorting of bioparticles.
Here, we demonstrate the basics of fabrication and experimentation using cDEP. We explain the simple preparation of a cDEP chip using soft lithography techniques. We discuss the experimental procedure for characterizing crossover frequency of a particle or cell, the frequency at which the dielectrophoretic force is zero. Finally, we demonstrate the use of this technique for sorting a mixture of ovarian cancer cells and fluorescing microspheres (beads).

Contactless dielectrophoresis (cDEP) achieves sorting and enrichment of particles via their intrinsic dielectric properties. Fluidic electrode channels replace metallic electrodes traditional to DEP, suiting cDEP to non-damaging sterile characterization and sorting of biological particles. We demonstrate how to prepare a cDEP microdevice and conduct cell characterization and sorting experiments.

非接触型誘電泳動によりラベルフリーの単離と細胞の濃縮

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

ソリッド検体からの原発性卵巣癌細胞を得る方法

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

リアルタイムで中皮細胞の卵巣癌スフェロイドアタッチメントおよび浸潤の評価

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

ヒト細胞株から化学療法抵抗性の卵巣がん幹細胞の濃縮

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

がん薬感の有効性を評価<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

生体内および生体外では腹膜脂肪にミルキースポット構造の卵巣がん転移性コロニー形成を研究するためのアプローチで

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.