The authors acknowledge all colleagues who made this work possible; Ann Demarr&#233;, Veerle Laurysens, Jan De Jonge and Erik Quartier for technical assistance. Financial support was from the VUB Research Council, the Institute for the Promotion of Innovation by Science and Technology in Flanders (IWT), the Beta Cell Biology Consortium (BCBC), the Fund for Scientific Research Flanders (FWO), Diabetes Onderzoek Nederland (DON) and Interuniversity Attraction Pole (IAP).

Todas las manipulaciones siguen las directrices emitidas por el Convenio Europeo para la Protección de los animales vertebrados utilizados para experimentación y otros fines científicos (ETS 123 y y 2010/63 / UE). 1. Preparación del área de trabajo <ol><li> Proporcionar un área de preparación dedicado, un área quirúrgica y un área de recuperación. </li><li> Llevar a cabo todo el procedimiento quirúrgico en una cabina de flujo laminar para reducir al mínimo los contaminantes ambientales. </li><li> Montar los suministros (como se indica en Materiales y Métodos) necesarios en el área de preparación, quirúrgica y la recuperación, utilizando una técnica aséptica adecuada. </li><li> Asegúrese de que los instrumentos quirúrgicos se esterilizan en autoclave antes de la cirugía. </li><li> Proporcionar una almohadilla de calefacción de agua recirculante a una temperatura de 38 ° C para estabilización de la temperatura durante la cirugía. Cubra la almohada eléctrica con un protector impermeable estéril. </li><li> Proporcionar un microscopio con un aumento de al menos 6.3x. </li><li> Utilice un instrumento sterilizer, tal como un esterilizador de cuentas caliente, para esterilizar los instrumentos en entre procedimientos quirúrgicos. </li><li> Prepare un área de recuperación que consiste en una gran jaula, bordeado por las camas papel plano </li></ol> 2. Preparación de los animales para la cirugía <ol><li> Para PDL y cirugía simulada, utilizar 8 semanas de edad ratones machos, alojados en jaulas estándar y mantenidos en un 12 horas de luz / 12 h oscuridad ciclo y alimentados con una dieta ad libitum roedores estándar. Nota: Aquí, utilizamos ratones BALB / cJrJ pero también hemos utilizado con éxito otras cepas y varias cepas transgénicas. </li><li> Utilice buprenorfina como analgesia preventiva (desde 0,05 hasta 0,1 mg / kg) 30 min antes de la cirugía. </li><li> Anestesiar a los ratones por inyección intraperitoneal de 100 mg / kg de ketamina y de 5 - 10 mg / kg de xilazina. </li><li> Evaluar anestesia adecuada mediante la observación de pérdida gradual del movimiento voluntario y la relajación muscular. Prueba de la pérdida de los reflejos por pinzamiento toe. </li><li> Aplicar pomada oftálmica de prevsequedad ent de los ojos, mientras que bajo anestesia. </li></ol> 3. Preparación del sitio quirúrgico <ol><li> Desinfectar tórax y el abdomen con una solución de clorhexidina antiséptico. </li><li> Afeitarse un área de 2,5 cm x 1,5 cm del abdomen. </li><li> Desinfectar la zona afeitada con una gasa empapada con una solución de clorhexidina, a continuación, solución de alcohol y una aplicación final de la solución de clorhexidina. </li><li> Coloque el animal en el área quirúrgica para que el sitio quirúrgico preparado esté orientado hacia arriba el cirujano. </li><li> Coloque el ratón usando un paño quirúrgico a prueba de agua con una abertura que deja la región abdominal desinfectada expuesta al tiempo que cubre el resto del cuerpo para crear un campo de trabajo estéril. Monitorear el ratón antes del procedimiento para la profundidad de la anestesia. </li></ol> 4. Conducto pancreático Ligadura <ol><li> La laparotomía <ol><li> Hacer una incisión en la línea media superior en la piel que se extiende desde la apófisis xifoides hasta el ombligo usando un estérilcuchilla quirúrgica. Separar la línea alba subyacente y el peritoneo con unas tijeras estériles con el fin de exponer el cuadrante abdominal superior. </li><li> Prevenir desecación de los órganos internos por aspersión regular con cloruro de sodio estéril al 0,9%. </li><li> El uso de pinzas o hisopo estéril, retraer el estómago superiormente, exponiendo el bazo y el lóbulo esplénica (la región de la cola) del páncreas. </li><li> Retraer suavemente el duodeno y parte de la parte superior del yeyuno al cuadrante abdominal superior derecha para exponer la cabeza, el cuello y la región cuerpo del páncreas cubiertos por el peritoneo visceral. </li></ol></li><li> Ligadura <ol><li> Busque la posición anatómica del conducto pancreático principal en la región del cuello del páncreas. </li><li> Incisión del peritoneo visceral y el ligamento gastrocólico, la concesión del acceso al retroperitoneo, la exposición de la región del cuerpo y la cola del páncreas. Con el fin de exponer la región del cuello, realizar una maniobra de Kocher. Levante el duodeno y el jefe deel páncreas fuera del retroperitoneo elevándolos de la vena cava y la aorta por debajo inferior. </li><li> Coloque cuidadosamente la espátula debajo de la región del cuello. Ligar el conducto pancreático con 6-0 Prolene hilo en el lado izquierdo de la vena porta que separa los lóbulos gastro-duodenal y esplénicas. </li><li> Realizar una segunda ligadura en estrecha proximidad a la primera ligadura para asegurar que los lóbulos están separados adecuadamente. </li><li> Ligar con mucho cuidado a fin de no dañar los vasos sanguíneos subyacentes, a saber, la arteria pancreaticoduodenal superior, la arteria pancreaticoduodenal inferior y la parte de páncreas de la arteria esplénica. </li><li> Coloca los órganos en la cavidad abdominal. </li><li> Cierre la incisión utilizando 4-0 poliglicol hilo filamentoso en un patrón de sutura continuo para la / capa peritoneal muscular y en un patrón de sutura discontinua para la piel. </li></ol></li></ol> 5. Sham Cirugía <ol><li> Realice todos los pasos como dedescribe en los pasos 1 a 4.1.4. Mientras que el páncreas está expuesta, no realice la ligadura del conducto pancreático. </li><li> Al final de la etapa 4.1.4, colocar los órganos internos en la cavidad abdominal. </li><li> Cierre de la incisión como se describe en 4.2.7. </li></ol> Cuidado 6. Post-operativa y Vigilancia <ol><li> Después de la intervención quirúrgica es completa, coloque el ratón en el área de recuperación. Este consiste en una jaula colocada sobre una almohadilla térmica y forrado con ropa de cama de papel plano con el fin de mantener la temperatura corporal normal. </li><li> Brindar apoyo nutricional para evitar la hipoglucemia post-operatorio por el alimento humedecido colocado en la parte inferior de la jaula. Para este propósito, utilizar gránulos de dieta estándar para roedores remojadas en agua hasta que se ablanden. </li><li> Proporcionar apoyo fluido por el alimento humedecido y proporcionar agua a voluntad. </li><li> Utilice buprenorfina como la analgesia (0,05-0,1 mg / kg) dos veces al día durante 2 días después de la cirugía. Durante todo el experimental, el seguimiento, observe los ratones durante la ocurrencia de posibles signos de infección, incluyendo la secreción de líquido o pus de la herida, o por el deterioro físico que se caracteriza por la reducción en el comportamiento de acicalamiento y nivel de actividad, menor apetito y pérdida de peso corporal. </li></ol> 7. Evaluación del éxito PDL y Cosecha de PDL cola y Sham cola de páncreas <ol><li> La eutanasia a los ratones por dislocación cervical. </li><li> Vuelva a afeitarse la región abdominal para evitar el arrastre de la piel. </li><li> Abra la capa de la piel y el músculo abdominal y eliminar una gran área de piel y músculo para obtener un buen acceso al páncreas. </li><li> El uso de pinzas o hisopo estéril, el estómago se retrae superiormente, exponiendo el bazo y el lóbulo esplénica (la región de la cola) del páncreas. </li><li> Retire con cuidado el duodeno y parte del yeyuno superior para exponer el lóbulo gastroduodenal (región de la cabeza) del páncreas. Nota: La porción ligada del páncreas PDL ahora se ha reducido en tamaño y se ha convertido en casitraslúcido para que los islotes son visibles como pequeños puntos blancos. La parte de la cabeza del páncreas es de color rosa opaco y distinta exocrina lobuli se puede observar. </li><li> Usando tijeras estériles, separar la parte de la cola del páncreas se ligó a partir del bazo, cortando a lo largo del bazo. Cortar perder el tejido conectivo que conecta la región de la cola del páncreas a los órganos internos. </li><li> Cortar la región de la cola PDL justo en frente de la ligación, con exclusión de la ligadura y el tejido inmediatamente adyacente a la misma desde el tejido cosechado. </li><li> Para aislar el tejido cola farsa, siga los pasos 7.1 a 7.5. Usando tijeras estériles separan la región de la cola del páncreas farsa del bazo por el corte a lo largo del bazo. Aislar la región de la cola por el corte en la región del cuello del páncreas y el corte soltar el tejido conectivo que conecta el páncreas cola a los órganos internos Nota: Tanto la cola y región de la cabeza del páncreas simulados son de color rosa opaco, para aislar las dos partes por separado,cortar el páncreas en la región del cuello. </li></ol>

<ol>
	<li>Shaw, J. E., Sicree, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+estimates+of+the+prevalence+of+diabetes+for.">Global estimates of the prevalence of diabetes for.</a> Diabetes Res Clin Pract. 87, 4-14 (2010).</li><li>Danaei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=National,+regional,+and+global+trends+in+fasting+plasma+glucose+and+diabetes+prevalence+since+1980:+systematic+analysis+of+health+examination+surveys+and+epidemiological+studies+with+370+country-years+and+2&#183;7+million+participants.">National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2&#183;7 million participants.</a> Lancet. 378, 31-40 (2011).</li><li>Borowiak, M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+beta+cells.">How to make beta cells.</a> Current opinion in Cell Biology. 21, 727-732 (2009).</li><li>Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=neurogenin3+is+required+for+the+development+of+the+four+endocrine+cell+lineages+of+the+pancreas.">neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 1607-1611 (2000).</li><li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+the+pancreatic+lineage:+NGN3++cells+are+islet+progenitors+and+are+distinct+from+duct+progenitors.">Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors.</a> Development. 129, 2447-2457 (2002).</li><li>Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+pancreatic+beta-cells+are+formed+by+self-duplication+rather+than+stem-cell+differentiation.">Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation.</a> Nature. 429, 41-46 (2004).</li><li>Teta, M., Rankin, M. M., Long, S. Y., Stein, G. M., Kushner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+regeneration+of+adult+beta+cells+does+not+involve+specialized+progenitors.">Growth and regeneration of adult beta cells does not involve specialized progenitors.</a> Dev Cell. 12, 817-826 (2007).</li><li>Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspective:+Postnatal+pancreatic+beta+cell+growth.">Perspective: Postnatal pancreatic beta cell growth.</a> Endocrinology. 141, 1926-1929 (2000).</li><li>Brennand, K., Huangfu, D., Melton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+beta+cells+contribute+equally+to+islet+growth+and+maintenance.">All beta cells contribute equally to islet growth and maintenance.</a> PLoS Biol. 5, e163 (2007).</li><li>Salpeter, S. J., Klein, A. M., Huangfu, D., Grimsby, J., Dor, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+and+aging+control+the+quiescence+period+that+follows+pancreatic+beta+cell+replication.">Glucose and aging control the quiescence period that follows pancreatic beta cell replication.</a> Development. 137, 3205-3213 (2010).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+cells+can+be+generated+from+endogenous+progenitors+in+injured+adult+mouse+pancreas.">Beta cells can be generated from endogenous progenitors in injured adult mouse pancreas.</a> Cell. 132, 197-207 (2008).</li><li>Wang, R. N., Kloppel, G., Bouwens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duct-+to+islet-cell+differentiation+and+islet+growth+in+the+pancreas+of+duct-ligated+adult+rats.">Duct- to islet-cell differentiation and islet growth in the pancreas of duct-ligated adult rats.</a> Diabetologia. 38, 1405-1411 (1995).</li><li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+expression+and+induction+of+acinar+cell+apoptosis+after+pancreatic+duct+ligation+in+mice.">Cytokine expression and induction of acinar cell apoptosis after pancreatic duct ligation in mice.</a> Journal of interferon, &amp; cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 19, 637-644 (1999).</li><li>Van Gassen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+dynamics+are+regulated+by+local+macrophage+proliferation+and+monocyte+recruitment+in+injured+pancreas.">Macrophage dynamics are regulated by local macrophage proliferation and monocyte recruitment in injured pancreas.</a> European journal of immunology. , (2015).</li><li>Van de Casteele, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin+3++cells+contribute+to+beta-cell+neogenesis+and+proliferation+in+injured+adult+mouse+pancreas.">Neurogenin 3+ cells contribute to beta-cell neogenesis and proliferation in injured adult mouse pancreas.</a> Cell Death Dis. 4, e523 (2013).</li><li>Xiao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+evidence+for+beta+cell+neogenesis+in+murine+adult+pancreas.">No evidence for beta cell neogenesis in murine adult pancreas.</a> The Journal of clinical investigation. 123, 2207-2217 (2013).</li><li>Ackermann Misfeldt, A., Costa, R. H., Gannon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+proliferation,+but+not+neogenesis,+following+60%+partial+pancreatectomy+is+impaired+in+the+absence+of+FoxM1.">Beta-cell proliferation, but not neogenesis, following 60% partial pancreatectomy is impaired in the absence of FoxM1.</a> Diabetes. 57, 3069-3077 (2008).</li><li>Lee, C. S., De Leon, D. D., Kaestner, K. H., Stoffers, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+pancreatic+islets+after+partial+pancreatectomy+in+mice+does+not+involve+the+reactivation+of+neurogenin-3.">Regeneration of pancreatic islets after partial pancreatectomy in mice does not involve the reactivation of neurogenin-3.</a> Diabetes. 55, 269-272 (2006).</li><li>Bonner-Weir, S., Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+stem+cells.">Pancreatic stem cells.</a> The Journal of pathology. 197, 519-526 (2002).</li><li>Nir, T., Melton, D. A., Dor, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+from+diabetes+in+mice+by+beta+cell+regeneration.">Recovery from diabetes in mice by beta cell regeneration.</a> The Journal of clinical investigation. 117, 2553-2561 (2007).</li><li>Bouwens, L., Rooman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pancreatic+beta-cell+mass.">Regulation of pancreatic beta-cell mass.</a> Physiol Rev. 85, 1255-1270 (2005).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurog3+gene+dosage+regulates+allocation+of+endocrine+and+exocrine+cell+fates+in+the+developing+mouse+pancreas.">Neurog3 gene dosage regulates allocation of endocrine and exocrine cell fates in the developing mouse pancreas.</a> Developmental biology. 339, 26-37 (2010).</li><li>Pan, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+patterns+of+multipotentiality+in+Ptf1a-expressing+cells+during+pancreas+organogenesis+and+injury-induced+facultative+restoration.">Spatiotemporal patterns of multipotentiality in Ptf1a-expressing cells during pancreas organogenesis and injury-induced facultative restoration.</a> Development. 140, 751-764 (2013).</li><li>Kopp, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9++ductal+cells+are+multipotent+progenitors+throughout+development+but+do+not+produce+new+endocrine+cells+in+the+normal+or+injured+adult+pancreas.">Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas.</a> Development. 138, 653-665 (2011).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+Neurog3+expression+in+hormone-expressing+islet+cells+is+required+for+endocrine+maturation+and+function.">Sustained Neurog3 expression in hormone-expressing islet cells is required for endocrine maturation and function.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 9715-9720 (2009).</li><li>Kopinke, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+reveals+the+dynamic+contribution+of+Hes1++cells+to+the+developing+and+adult+pancreas.">Lineage tracing reveals the dynamic contribution of Hes1+ cells to the developing and adult pancreas.</a> Development. 138, 431-441 (2011).</li><li>Rankin, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Cells+are+not+generated+in+pancreatic+duct+ligation-induced+injury+in+adult+mice.">beta-Cells are not generated in pancreatic duct ligation-induced injury in adult mice.</a> Diabetes. 62, 1634-1645 (2013).</li><li>Solar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+exocrine+duct+cells+give+rise+to+insulin-producing+beta+cells+during+embryogenesis+but+not+after+birth.">Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth.</a> Dev Cell. 17, 849-860 (2009).</li><li>Furuyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cell+supply+from+a+Sox9-expressing+progenitor+zone+in+adult+liver,+exocrine+pancreas+and+intestine.">Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine.</a> Nat Genet. 43, 34-41 (2011).</li><li>Van de Casteele, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+duct+ligation:+beta-cell+proliferation+and+beyond.">Partial duct ligation: beta-cell proliferation and beyond.</a> Diabetes. 63, 2567-2577 (2014).</li><li>Zhang, J., Rouse, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathology+and+pathogenesis+of+caerulein-,+duct+ligation-,+and+arginine-induced+acute+pancreatitis+in+Sprague-Dawley+rats+and+C57BL6+mice.">Histopathology and pathogenesis of caerulein-, duct ligation-, and arginine-induced acute pancreatitis in Sprague-Dawley rats and C57BL6 mice.</a> Histology and histopathology. 29, 1135-1152 (2014).</li><li>Martinez-Romero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epigenetic+regulators+Bmi1+and+Ring1B+are+differentially+regulated+in+pancreatitis+and+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">The epigenetic regulators Bmi1 and Ring1B are differentially regulated in pancreatitis and pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> The Journal of pathology. 219, 205-213 (2009).</li><li>Prevot, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+ductal+transcription+factors+HNF6+and+Sox9+in+pancreatic+acinar-to-ductal+metaplasia.">Role of the ductal transcription factors HNF6 and Sox9 in pancreatic acinar-to-ductal metaplasia.</a> Gut. 61, 1723-1732 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

In the present study, we describe in detail the methodology behind PDL, a mouse injury model to study beta cell neogenesis and proliferation and transdifferentiation of pancreatic non-beta cells. Ambiguity in data on PDL among labs stimulates the need for a standardized protocol for PDL surgery.
Critical steps in the PDL protocol include the selection of healthy, young mice for surgery. Preferably male mice should be used since unpublished data from our lab suggest that estrogen receptor signa...

El aumento de la prevalencia de la diabetes, que afecta a más de 300 millones de personas en todo el mundo 1,2 ha impulsado la búsqueda de nuevas fuentes de células beta productoras de insulina, tanto in vitro como in vivo, para reponer la masa de células beta deficiente. 3 Identificar clave mecanismos y factores que regulan la proliferación de células beta y beta neogénesis de células, es decir, la diferenciación de las células beta a partir de una célula o células progenitoras no beta, pueden proporcionar nuevas dianas para el desarrollo de terapias regenerativas en la diabetes. En el páncreas de roedores en desarrollo, todos los tipos de células endocrinas diferenciar de una población transitoria de células progenitoras endocrino, que expresa el factor de transcripción Neurogenin3 (Ngn3) 4,5. En el páncreas roedor adulto, en condiciones fisiológicas normales, la masa de células beta es se mantiene a un número óptimo para satisfacer las demandas metabólicas. Los cambios en el tamaño de las células beta,apoptosis y la replicación constituyen los principales mecanismos para la expansión de células beta y turn-over. 6-8 Mientras que el potencial de las células beta a proliferar en condiciones fisiológicas normales es homogénea en toda la población, 9 su tasa de proliferación es baja y re-replicación está restringida por un período dinámico de quiescencia o período refractario 6,7, influenciado por la edad y el metabolismo de la glucosa. 10 Dado que las células progenitoras endocrinas hasta ahora no han sido identificados en el páncreas adulto normal, se cree neogénesis de no contribuir al crecimiento normal de las células beta del adulto. 8 Por lo tanto, la identificación de una célula progenitora endocrino facultativa en el páncreas adulto que es expandible y capaz de producir nuevas células beta podría proporcionar una novela, posiblemente fuente ilimitada de las células beta. Parcial ligadura del conducto (PDL) es un modelo de lesión de animal que ha sido descrito para inducir neogenesi célula betas en el páncreas adulto. 11,12 En este modelo, el conducto pancreático principal drenaje de la cola del páncreas se une quirúrgicamente. La obstrucción resultante de drenaje exocrino induce importante remodelación del tejido, acompañado por la inflamación y atrofia acinar distal a la ligadura. 12-14 Dentro de este entorno inflamatorio, re-expresión del marcador progenitor endocrino Ngn3 se induce y el volumen de las células beta aumenta de dos veces . Esta duplicación en beta resultados del volumen celular de la generación de nuevas células beta a partir de un Ngn3 expresan de tipo embrionario de células progenitoras endocrino y de la proliferación de las células beta pre-existentes y recién formados que son propensos a volver a la duplicación sin &quot;período de inactividad&quot;. 11,15 Neogénesis de células beta y replicación en modelos de lesión, tales como la pancreatectomía 6,7,16-19 y la ablación selectiva de las células beta 20 se han descrito ampliamente. Sin embargo, el resultado regenerativa en thesmodelos e está influenciada por la magnitud de los daños causados ​​y se asocia con una masa de células beta inicial disminuido 21. PDL es un modelo quirúrgico en el que no se ve afectada la masa inicial de las células beta y la neogénesis de células beta y la proliferación se activan robusta. De hecho, en el páncreas de ratones que se sometieron a PDL, las células que expresan Ngn3 se identifican cerca del revestimiento epitelial del conducto. Estas células se pueden aislar a partir de los páncreas de ratones transgénicos ligados Ngn3-GFP usando células activadas por fluorescencia (FACS) y son capaces de diferenciarse hacia células beta funcionales siguiente en el injerto y la cultura ex vivo del páncreas de E12.5 Ngn3 - / - . ratones 11 Del mismo modo, en Ngn3 CreERT;. ratones R26 YFP en el que las células que activan el gen Ngn3 están etiquetados de forma permanente después de la inyección tamoxifeno, las células derivadas de células beta Ngn3 etiquetas positivas se detectan después de PDL 15 Por otra parte, las células beta recién formadas diluir pre -existing células beta y preferentemente localizar en pequeños islotes en el que las células beta muestran un alto potencial de proliferación. 15 Ngn3 es importante para la expansión de las células beta después de PDL ya la disminución de la expresión Ngn3 usando específica de la diana de ARN corto horquilla disminuye significativamente la masa de células beta y la proliferación de las células beta después PDL. 11 En particular, la fracción de células derivadas de células beta Ngn3 y la masa de células beta después de PDL depende críticamente del nivel de Ngn3 inducción 15. Esto está de acuerdo con la observación de que el alto nivel de expresión Ngn3 es un paso fundamental para el compromiso endocrina del páncreas progenitores multipotentes durante el desarrollo de páncreas 22 Además, la ablación selectiva de células que expresan Ngn3 por la administración de la difteria-toxina para Ngn3 CreERT;. Ratones R26 IDTR resultados en el contenido de insulina disminuida y la proliferación de células beta reducido, especialmente en pequeños islotes. 15 <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Aunque la inducción de la expresión Ngn3 en células de los conductos después de PDL ha sido confirmado por muchos 11,15,16,23,24, Ngn3 expresión en células de islotes 24,25 y discrepancias en el resultado de PDL desafió nuestras observaciones iniciales del aumento de la masa de células beta 26,27, aparición de Ngn3 expresando progenitores conducto derivado endocrinas 24,26,28,29, y aumento de la proliferación de las células beta 27 después de PDL. 30 Estos resultados contradictorios podrían, al menos en parte, atribuirse a una combinación de factores, incluyendo variaciones en los puntos de tiempo post-quirúrgicas de análisis, el peso corporal, el sexo y la edad de los ratones, condiciones fisiológicas y ambientales postoperatorias y, lo más importante, diferencias en la técnica quirúrgica. 30 En nuestras manos, la proliferación de células beta, contenido de insulina, el volumen de las células beta y el número de pequeños islotes se incrementan constantemente después de PDL. TambiénNgn3 ARNm aumenta constantemente, pero hay grandes diferencias en la expresión de ARNm Ngn3 entre PDL páncreas cola, para los que no tenemos explicación directa. La hipótesis de que el nivel de ARNm Ngn3 podría correlacionar con el grado de neogénesis de células beta a partir de células no beta 15, pero esto requiere de mayor fundamentación. A pesar de que no elimina todas las variaciones experimentales, un método estandarizado para la realización de la cirugía PDL permite una mejor uniformidad en los resultados y abre nuevas vías en el estudio de la proliferación de células beta y neogénesis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Supplies for preparation area&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibiscrub&#160;</td>
			<td>Regent Medical</td>
			<td>5601IE5F11</td>
			<td>Chlorhexidin diglucon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin</td>
			<td>Ceva</td>
			<td>BE-V202526</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun(2%) (Xylazin)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>BE-V041815</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duratears</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>34335-8</td>
			<td>ointment for eyes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies for surgical area&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Operating microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10446320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>18000-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoclaved surgical instruments</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recirclulating water heating pad</td>
			<td>Gaymar Industries, Inc.</td>
			<td>TP702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive OP-towel</td>
			<td>BARRIER</td>
			<td>706500-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP-tape</td>
			<td>BARRIER</td>
			<td>381035-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stella 3/5 Compresse de gaze (Sterile)</td>
			<td>Lohmann&#38;Rauscher International</td>
			<td>35968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Plasco 0,9% NaCl solution</td>
			<td>B.BRAUN</td>
			<td>3521680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 prolene suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8706H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 polyglycol suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>SL-607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies for recovery area</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper bedding (paper towel)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetergesic</td>
			<td>ecuPhar</td>
			<td>BE-V342955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman Ngn3 primer</td>
			<td>Integrated DNA technologies</td>
			<td>Mm.PT.56a.33574796.gs</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman CycloA primer</td>
			<td>Integrated DNA technologies</td>
			<td>Mm.PT.39a.2.gs</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rabbit Cleaved Caspase 3 antibody (D175)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5A1E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse/rat Ki67 antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-5698-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal anti-actin alpha-Smooth muscle-Cy3 (mouse)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>085K4889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat Cytokeratin 19&#160;</td>
			<td>DSHB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal Mouse anti-BrdU</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgical injury to the mouse pancreas through ligation of the pancreatic duct as a model for endocrine and exocrine reprogramming and proliferation

Expansión de las células beta pancreáticas in vivo o ex vivo, o la generación de las células beta por la diferenciación de una célula madre embrionaria o un adulto, puede proporcionar nuevas fuentes expandibles de las células beta para aliviar la escasez de donantes en el trasplante de islotes humanos como terapia para la diabetes. Aunque los avances recientes se han hecho hacia este objetivo, los mecanismos que regulan la expansión de las células beta y la diferenciación de una célula madre / progenitoras aún no se han caracterizado. Aquí, se describe un protocolo para un modelo de lesión en el páncreas de ratón adulto que puede funcionar como una herramienta para estudiar los mecanismos de la remodelación tisular y proliferación de las células beta y la diferenciación. Parcial ligadura del conducto (PDL) es una lesión inducida experimentalmente del páncreas roedor que implica la ligadura quirúrgica del conducto pancreático principal que resulta en una obstrucción del drenaje de los productos exocrinas fuera de la región de la cola del páncreas. El daño infligido induce atrofia acinar, infilt célula inmuneración y la remodelación tisular grave. Hemos informado anteriormente de la activación de Neurogenina (NGN) 3 que expresan las células progenitoras como endógenos y un aumento en la proliferación de las células beta después de PDL. Por lo tanto, PDL proporciona una base para estudiar señales implicadas en la dinámica de las células beta y las propiedades de un progenitor endocrino en páncreas adulto. Dado que, todavía sigue siendo en gran medida poco clara, que los factores y las vías contribuyen a la neogénesis de células beta y la proliferación en PDL, un protocolo estandarizado para PDL permitirá la comparación entre laboratorios.

PDL induce atrofia acinar y la inflamación, pero no afecta el peso corporal y la glucemia En 8 semanas de edad BALB / c ratones, el conducto de drenaje de las enzimas exocrinas de la cola del páncreas se liga mientras que la cabeza del órgano, situado adyacente al estómago y el duodeno, no se ve afectado. Edad, sexo y machos BALB / c ratones con peso se someten a cirugía simulada recapitular todas las medidas de la cirugía parcial ligadura del conducto, a excepción de...

Watch this Scientific Journal Video about Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation at JoVE.co

Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation

This protocol describes an injury model involving the surgical ligation of the pancreatic duct in the adult mouse pancreas, resulting in severe injury that establishes an environment that allows beta cell neogenesis and proliferation. This model can be used as a tool to study mechanisms involved in beta cell formation.

Lesión quirúrgica del páncreas del ratón a través de la ligadura del conducto pancreático como un modelo para el endocrino y exocrino Reprogramación y proliferación

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide ...

surgical-injury-to-mouse-pancreas-through-ligation-pancreatic-duct-as

Research

JoVE Journal

Medicine

16.0K vistas.  Vrije Universiteit Brussel. This protocol describes an injury model involving the surgical ligation of the pancreatic duct in the adult mouse pancreas, resulting in severe injury that establishes an environment that allows beta cell neogenesis and proliferation. This model can be used as a tool to study mechanisms involved in beta cell formation. 

Video: Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation