The authors acknowledge all colleagues who made this work possible; Ann Demarr&#233;, Veerle Laurysens, Jan De Jonge and Erik Quartier for technical assistance. Financial support was from the VUB Research Council, the Institute for the Promotion of Innovation by Science and Technology in Flanders (IWT), the Beta Cell Biology Consortium (BCBC), the Fund for Scientific Research Flanders (FWO), Diabetes Onderzoek Nederland (DON) and Interuniversity Attraction Pole (IAP).

Todas as manipulações seguir as orientações emitidas pela Convenção Europeia para a Protecção dos Animais Vertebrados Utilizados para Fins Experimentais e outros Fins Científicos (ETS 123 e e 2010/63 / UE). 1. Preparação de Área de Trabalho <ol><li> Fornecer uma área de preparação dedicada, uma área cirúrgica e uma área de recuperação. </li><li> Conduzir todo o procedimento cirúrgico numa câmara de fluxo laminar, para minimizar os contaminantes ambientais. </li><li> Monte os suprimentos (conforme listado em Materiais e Métodos) necessários na área de preparação, cirúrgica e recuperação, utilizando uma técnica asséptica adequada. </li><li> Certifique-se de que as ferramentas cirúrgicas são autoclavados antes da cirurgia. </li><li> Fornecer uma almofada de aquecimento de água em recirculação, a uma temperatura de 38 ° C para estabilização da temperatura durante a cirurgia. Cubra a almofada de aquecimento com uma almofada impermeável estéril. </li><li> Fornecer um microscópio cirúrgico com uma ampliação de pelo menos 6.3x. </li><li> Use um instrumento sterilizer, tal como um esterilizador quente talão, para esterilizar instrumentos entre os procedimentos cirúrgicos. </li><li> Prepare uma área de recuperação consiste em uma gaiola grande, ladeada por cama plana de papel </li></ol> 2. Preparação dos Animais para Cirurgia <ol><li> Para PDL e cirurgia simulada, utilizar 8 semanas de idade, ratinhos machos, mantidos em gaiolas padrão e mantidos num ciclo luz / escuro de 12 horas 12 horas de luz e alimentados com uma dieta ad libitum roedor padrão. Nota: Aqui, usamos ratos BALB / cJrJ mas nós também têm utilizado com sucesso outras estirpes e várias cepas transgênicas. </li><li> Use Buprenophine como analgesia preventiva (0,05-0,1 mg / kg) 30 minutos antes da cirurgia. </li><li> Anestesiar os ratos por injecção intraperitoneal de 100 mg / kg de cetamina e 5 - 10 mg / kg de xilazina. </li><li> Avaliar anestesia adequada, observando a perda gradual de movimento voluntário e relaxamento muscular. Teste a perda de reflexos por beliscar dedo do pé. </li><li> Aplicar pomada oftálmica para prevent secura dos olhos, enquanto sob anestesia. </li></ol> 3. Preparação do Sítio Cirúrgico <ol><li> Desinfetar tórax e abdômen com solução de clorexidina anti-séptico. </li><li> Raspar uma área de 2,5 cm x 1,5 cm do abdômen. </li><li> Desinfetar a área de barbeado utilizando gaze embebida em solução de clorexidina, em seguida, solução de álcool e uma aplicação final da solução de clorexidina. </li><li> Posicionar o animal na área cirúrgica de modo que o local da cirurgia é preparado para cima voltado para o cirurgião. </li><li> Armar o rato utilizando um penso cirúrgico com uma abertura à prova de água que sai da região abdominal desinfectada exposta ao cobrir o restante do corpo para criar um campo estéril de trabalho. Monitorar o rato antes do procedimento para a profundidade de anestesia. </li></ol> 4. pâncreas ligadura de ducto <ol><li> Laparotomia <ol><li> Faça uma incisão na linha média superior na pele que se estende do processo xifóide ao umbigo usando um estérillâmina cirúrgica. Separe a linha alba subjacente e do peritoneu utilizando tesoura estéril, a fim de expor o quadrante abdominal superior. </li><li> Evitar a secagem-out dos órgãos internos por aspersão regular com estéril de cloreto de sódio a 0,9%. </li><li> Usando pinças estéreis ou zaragatoa, retrair o estômago superiormente, expondo o baço e o lóbulo esplénica (região da cauda) do pâncreas. </li><li> Suavemente retrair o duodeno e o jejuno parte superior para o quadrante superior direito abdominal para expor a cabeça, pescoço e na região do corpo do pâncreas abrangidos pelo peritoneu visceral. </li></ol></li><li> Ligadura <ol><li> Localizar a posição anatómica do ducto pancreático principal na região do pescoço do pâncreas. </li><li> Faça uma incisão na peritônio visceral eo ligamento gastrocolic, a concessão de acesso ao retroperitônio, expondo a região do corpo e cauda do pâncreas. A fim de expor a região do pescoço, executar uma manobra de Kocher. Levante o duodeno e cabeça deo pâncreas fora do retroperitônio elevando-os a partir da veia cava inferior e aorta abaixo. </li><li> Com cuidado, coloque a espátula debaixo região do pescoço. Ligadura do ducto pancreático com fio prolene 6-0 no lado esquerdo da veia porta que separa os lobos gastro-duodenais e esplênicas. </li><li> Executar uma segunda ligadura em estreita proximidade com a primeira ligadura para assegurar que os lóbulos são adequadamente separados. </li><li> Ligadura com muito cuidado para não danificar os vasos sanguíneos subjacentes, nomeadamente a artéria pancreaticoduodenal superior, a artéria pancreaticoduodenal inferior ea parte pancreático da artéria esplênica. </li><li> Colocar os órgãos de volta para a cavidade abdominal. </li><li> Fechar a incisão utilizando 4-0 poliglicol fio filamentoso em um padrão de sutura contínua para o músculo / camada peritoneal e com um padrão descontínuo de sutura para a pele. </li></ol></li></ol> 5. Sham Cirurgia <ol><li> Execute todas as etapas de comodescrito nas etapas 1 a 4.1.4. Enquanto o pâncreas está exposto, não realizar a ligadura do ducto pancreático. </li><li> No final do passo 4.1.4, colocar os órgãos internos de volta para a cavidade abdominal. </li><li> Fechar a incisão, tal como descrito em 4.2.7. </li></ol> 6. Cuidados Pós-operacional e Monitoramento <ol><li> Após o procedimento cirúrgico estiver concluída, coloque o mouse na área de recuperação. Este é constituído por uma gaiola colocada sobre uma almofada de aquecimento e forrado com papel de cama plana, a fim de manter a temperatura normal do corpo. </li><li> Fornecer suporte nutricional para evitar a hipoglicemia pós-operatório por alimentos umedecido colocado no fundo da gaiola. Para esta finalidade, utilizam pastilhas roedor dieta padrão embebidas em água até que amaciar. </li><li> Fornecer suporte de fluido com a comida umedecido e fornecer água ad libitum. </li><li> Use Buprenophine como analgesia (0,05-0,1 mg / kg) duas vezes ao dia durante 2 dias pós-cirurgia. Durante todo o experimental, acompanhamento, observe os ratos de ocorrência de possíveis sinais de infecção, incluindo a secreção de líquido ou pus da ferida, ou por deterioração física caracterizada pela redução na preparação comportamento e nível de atividade, menor apetite e perda de peso corporal. </li></ol> 7. Avaliação do PDL bem sucedido e Colheita de PDL cauda e Sham cauda do pâncreas <ol><li> Euthanize ratos por deslocamento cervical. </li><li> Re-raspar a região abdominal para evitar carry-over de pele. </li><li> Abra a camada de pele e músculo abdominal e remover uma grande área de pele e músculo para se obter um bom acesso para o pâncreas. </li><li> Usando pinças estéreis ou mecha, o estômago é retraído superiormente, expondo o baço e o lóbulo esplénica (região da cauda) do pâncreas. </li><li> Retire cuidadosamente o duodeno e parte do jejuno superior para expor o lobo gastro-duodenal (região da cabeça) do pâncreas. Nota: A porção ligada do pâncreas PDL tem agora reduzido em tamanho e se tornou quasetranslúcido para que ilhotas são visíveis como pequenos pontos brancos. A porção de cabeça do pâncreas é rosa opaco e exócrina distinta lobuli podem ser observados. </li><li> Com uma tesoura estéreis, separar a parte da cauda do pâncreas ligado a partir do baço, por corte ao longo do baço. Cortar o tecido conjuntivo solto ligação entre a região da cauda do pâncreas para os órgãos internos. </li><li> Cortar região da cauda do PDL bem na frente da ligação, excluindo a ligadura eo tecido imediatamente adjacente a ela a partir do tecido colhido. </li><li> Para isolar o tecido cauda sham, siga os passos 7.1 a 7.5. Usando uma tesoura estéreis separar região da cauda do pâncreas simulada a partir do baço por corte ao longo do baço. Isolar a região da cauda por corte na região do pescoço do pâncreas e corte solta do tecido conjuntivo que liga o pâncreas cauda para os órgãos internos Nota: Tanto a cauda e região da cabeça do pâncreas sham são rosa opaco, para isolar as duas partes separadamente,cortar o pâncreas na região do pescoço. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

In the present study, we describe in detail the methodology behind PDL, a mouse injury model to study beta cell neogenesis and proliferation and transdifferentiation of pancreatic non-beta cells. Ambiguity in data on PDL among labs stimulates the need for a standardized protocol for PDL surgery.
Critical steps in the PDL protocol include the selection of healthy, young mice for surgery. Preferably male mice should be used since unpublished data from our lab suggest that estrogen receptor signa...

O aumento da prevalência de diabetes, que afeta mais de 300 milhões de pessoas em todo o mundo 1,2 impulsionou a busca por novas fontes de células beta produtoras de insulina, tanto in vitro como in vivo, para reabastecer a massa de células beta deficiente. 3 Identificando chave mecanismos e factores que regulam a proliferação de células beta e beta neogénese célula, isto é, a diferenciação das células beta a partir de uma célula ou de células progenitoras não-beta, podem proporcionar novos alvos para o desenvolvimento de terapias de regeneração na diabetes. No pâncreas de roedores em desenvolvimento, todos os tipos de células endócrinas diferenciar a partir de uma população transitória de células progenitoras endócrino, que expressa o factor de transcrição Neurogenin3 (Ngn3) 4,5. No pâncreas roedor adulto, sob condições fisiológicas normais, a massa de células beta é mantido a um número ideal para atender às demandas metabólicas. Alterações na dimensão da célula beta,apoptose e replicação constituem os principais mecanismos para a expansão de células beta e turn-over. 6-8 Embora o potencial de células beta para proliferar sob condições fisiológicas normais não é homogénea em toda a população, 9 a sua taxa de proliferação é baixo e re-replicação é restrito por um período dinâmico quiescência ou período refractário 6,7, influenciada pela idade e o metabolismo da glicose. 10 Uma vez que as células progenitoras endócrina não têm até agora sido identificados no pâncreas adulto normal, neogénese Pensa-se que não contribuem para o crescimento das células beta adulto normal. 8 Portanto, a identificação de uma célula progenitora endócrino facultativa no pâncreas adulto que é expansível e capaz de produzir novas células beta iria proporcionar um novo, possivelmente fonte ilimitada de células beta. Parcial ligadura adesiva (PDL) é um modelo de lesão animal que tem sido descrito para induzir neogenesi célula betas no pâncreas adulto 11,12 Neste modelo., o ducto pancreático principal de drenagem da cauda do pâncreas é ligado cirurgicamente. A obstrução resultante da drenagem exócrina induz maior remodelação de tecidos, acompanhados de inflamação e atrofia acinar distal à ligadura 12-14. Dentro deste ambiente inflamatório, re-expressão do marcador endócrino progenitoras Ngn3 é induzido e o volume da célula beta aumenta duplo . Esta duplicação em beta resultados de volume de células a partir da geração de novas células beta de um Ngn3 expressar-tipo embrionário de células endócrino progenitor e da proliferação de células beta pré-existentes e recém-formados que são propensas a re-duplicação sem &quot;período de quietude&quot;. 11,15 Neogénese células beta e replicação em modelos de lesão, como pancreatectomy 6,7,16-19 e ablação seletiva das células beta 20 têm sido amplamente descrito. No entanto, o resultado regenerativo em these modelos é influenciada pela extensão do dano infligido e está associada com uma massa celular beta inicial diminuiu 21. PDL representa um modelo cirúrgico em que a massa de células beta inicial não é afectado e a neogénese e proliferação das células beta são activados de forma robusta. Com efeito, no pâncreas de ratinhos que foram submetidos a PDL, células que expressam Ngn3 são identificados perto do forro epitelial do ducto. Estas células podem ser isoladas a partir do pâncreas de ratinhos transgénicos ligados Ngn3-GFP usando fluorescência de células activadas (FACS) e são capazes de se diferenciar em relação a células beta funcionais seguinte enxerto em cultura ex vivo e do pâncreas de E12.5 Ngn3 - / - . Ratinhos com 11 Do mesmo modo, em Ngn3 CreERT;. 15 ratinhos R26 YFP em que as células activadas que o gene Ngn3 são permanentemente marcadas após injecção tamoxifeno, Ngn3 células derivadas de células beta do rótulo-positivo são detectados após PDL Além disso, as células beta recém-formados diluir pré -existing células beta e localizar preferencialmente em pequenas ilhotas dentro de células beta que apresentam um elevado potencial de proliferação. Ngn3 15 é importante para a expansão das células beta após PDL desde diminuição da expressão Ngn3 utilizando ARN-gancho de cabelo curto específico para o alvo diminui significativamente a massa de células beta e proliferação das células beta depois PDL. 11 Em particular, a fracção de células derivadas de células beta Ngn3 e a massa celular beta após PDL depende criticamente do nível de indução Ngn3 15. Isto está de acordo com a observação de que o alto nível de expressão Ngn3 é um passo crítico para o compromisso endócrino do pâncreas progenitores multipotentes durante o desenvolvimento do pâncreas 22 Além disso, de ablação seletiva das células que expressam Ngn3 por administração difteria, toxina para Ngn3 CreERT;. Ratos R26 IDTR 15 resulta em diminuição do teor de insulina e reduziu a proliferação das células beta, especialmente em pequenas ilhotas. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Embora a indução da expressão Ngn3 em células do duto após PDL foi confirmada por muitos 11,15,16,23,24, expressão Ngn3 em ilhotas células 24,25 e discrepâncias nos resultados de PDL desafiou nossas observações iniciais do aumento da massa de células beta 26,27, aparecimento de Ngn3 expressar progenitores derivados do ducto da glândula endócrina 24,26,28,29 e aumento da proliferação de células beta após 27 PDL 30. Estes resultados conflitantes poderia, pelo menos parcialmente, ser atribuída a uma combinação de factores, incluindo as variações nos pontos de análise, o peso corporal, sexo e idade dos ratinhos, condições fisiológicas e ambientais pós-operatórias, e tempo de pós-cirúrgicos, mais importante, diferenças na técnica cirúrgica. 30 Em nossas mãos, a proliferação de células beta, o conteúdo de insulina, o volume da célula beta e o número de pequenas ilhotas são consistentemente aumentou após PDL. TambémNgn3 mRNA aumenta constantemente, mas há grandes diferenças na expressão de mRNA Ngn3 entre pancreases cauda PDL, para os quais temos nenhuma explicação direta. Colocámos a hipótese de que o nível de ARNm Ngn3 pode correlacionar-se com o grau de neogénese das células beta a partir de células não-beta 15, mas este necessita de mais comprovação. Apesar de não remover todas as variações experimentais, um método padronizado para realização de cirurgia de PDL permite uma melhor uniformidade de resultados e abre novos caminhos para estudar a proliferação de células beta e neoformação.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Supplies for preparation area&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibiscrub&#160;</td>
			<td>Regent Medical</td>
			<td>5601IE5F11</td>
			<td>Chlorhexidin diglucon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin</td>
			<td>Ceva</td>
			<td>BE-V202526</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun(2%) (Xylazin)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>BE-V041815</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duratears</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>34335-8</td>
			<td>ointment for eyes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies for surgical area&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Operating microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10446320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>18000-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoclaved surgical instruments</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recirclulating water heating pad</td>
			<td>Gaymar Industries, Inc.</td>
			<td>TP702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive OP-towel</td>
			<td>BARRIER</td>
			<td>706500-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP-tape</td>
			<td>BARRIER</td>
			<td>381035-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stella 3/5 Compresse de gaze (Sterile)</td>
			<td>Lohmann&#38;Rauscher International</td>
			<td>35968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Plasco 0,9% NaCl solution</td>
			<td>B.BRAUN</td>
			<td>3521680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 prolene suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8706H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 polyglycol suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>SL-607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies for recovery area</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper bedding (paper towel)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetergesic</td>
			<td>ecuPhar</td>
			<td>BE-V342955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman Ngn3 primer</td>
			<td>Integrated DNA technologies</td>
			<td>Mm.PT.56a.33574796.gs</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman CycloA primer</td>
			<td>Integrated DNA technologies</td>
			<td>Mm.PT.39a.2.gs</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rabbit Cleaved Caspase 3 antibody (D175)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5A1E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse/rat Ki67 antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-5698-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal anti-actin alpha-Smooth muscle-Cy3 (mouse)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>085K4889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat Cytokeratin 19&#160;</td>
			<td>DSHB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal Mouse anti-BrdU</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgical injury to the mouse pancreas through ligation of the pancreatic duct as a model for endocrine and exocrine reprogramming and proliferation

Expansão de células beta pancreáticas in vivo ou ex vivo, ou a geração de células beta por diferenciação de uma célula estaminal embrionária ou adulto, pode proporcionar novas fontes de células expansíveis beta para aliviar a escassez doador em transplante de ilhéus humanos como terapia para a diabetes. Apesar de recentes avanços têm sido feitos no sentido de este objectivo, os mecanismos que regulam a expansão das células beta e diferenciação de uma célula-tronco / progenitoras continuam a caracterizar-se. Aqui, nós descrevemos um protocolo para um modelo de lesão no rato adulto pâncreas que pode funcionar como uma ferramenta para estudar os mecanismos de remodelação tecidual e proliferação de células beta e diferenciação. Parcial ligadura adesiva (PDL) é uma lesão induzida experimentalmente do pâncreas roedor envolvendo ligadura cirúrgica do ducto pancreático principal, resultando em obstrução da drenagem de produtos exócrinas para fora da região da cauda do pâncreas. O dano infligido induz atrofia acinar, infilt células imunitáriasração e remodelação do tecido grave. Descrevemos previamente a activação de neurogenin (NGN) 3 expressando células progenitoras endógenas semelhantes e um aumento na proliferação das células beta após PDL. Portanto, PDL fornece uma base para estudar sinais envolvidos na dinâmica das células beta e as propriedades de um progenitor pâncreas endócrino em adulto. Desde então, ele ainda permanece em grande parte não está claro, quais fatores e vias de contribuir para a neoformação de células beta e proliferação no PDL, um protocolo padronizado para PDL irá permitir a comparação entre laboratórios.

PDL induz atrofia acinar e inflamação, mas não afeta o peso corporal ea glicemia Em oito semanas de idade do sexo masculino ratinhos BALB / c, a conduta de drenagem das enzimas exócrinas da cauda do pâncreas é ligado, enquanto a cabeça do órgão, localizada adjacente ao estômago e duodeno, permanece inalterada. Idade, sexo e do sexo masculino camundongos BALB / c da mesma peso submeter à cirurgia sham recapitulando todas as etapas da cirurgia ligadura dos ductos pa...

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Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation

This protocol describes an injury model involving the surgical ligation of the pancreatic duct in the adult mouse pancreas, resulting in severe injury that establishes an environment that allows beta cell neogenesis and proliferation. This model can be used as a tool to study mechanisms involved in beta cell formation.

Lesão cirúrgica para o mouse Pâncreas através da ligadura da pâncreas Duct como um modelo para endócrina e exócrina Reprogramação e Proliferação

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

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