Los autores agradecen a K. Kissa útil para los debates y para proporcionar lipo-clodronato y L. Ramakrishnan por el generoso regalo de pTEC27 y pTEC15 que permiten la expresión de tdTomato y Wasabi, respectivamente. Este trabajo forma parte de los proyectos de la Agencia Nacional de Investigación VII Programa Marco de la Comunidad Europea (ZebraFlam ANR-10-MIDI-009 y DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) y (FP7-PEOPLE-2011-ITN) en virtud de acuerdo de subvención no. PITN-GA-2011-289209 por Marie-Curie de Formación Inicial Red FishForPharma. También queremos agradecer a la Asociación de Gregory Lemarchal y Vaincre La Mucoviscidose (RF20130500835) para la financiación de CM Dupont.

The authors have nothing to disclose.

El pez cebra ha surgido recientemente como un excelente sistema modelo vertebrado para estudiar la dinámica de la infección bacteriana usando amplio campo y la imagen confocal en tiempo real 36. La combinación de suspensiones dispersas de micobacterias (protocolo 2.2), junto con los métodos de micro-inyección (protocolo 4) permite que las infecciones sistémicas, reproducibles y posterior seguimiento y visualización de la progresión de la infección con un enfoque especial en las interacciones bacteria...

Abscessus Mycobacterium es un patógeno emergente que provoca un amplio espectro de síndromes clínicos en seres humanos. Estos incluyen infecciones cutáneas, así como las infecciones pulmonares crónicas severas, en su mayoría se encuentran en inmunocomprometidos y en pacientes con fibrosis quística 1,2,3,4. M. abscessus también es considerado como una de las principales especies de micobacterias de rápido crecimiento responsables de las infecciones nosocomiales y yatrogénica en los seres humanos. Por otra parte, varios informes recientes destacan la posibilidad de que M. abscessus podía cruzar la barrera sangre-cerebro y inducir lesiones importantes en el sistema nervioso central (CNS) 5,6. A pesar de ser un cultivador rápido, M. exposiciones abscessus también varias características patógenas que están relacionados con los de Mycobacterium tuberculosis, incluyendo la capacidad de permanecer en silencio durante años dentro de las estructuras granulomatosas y generar lesiones caseosas en los pulmones 7. Más alarmante es el bajo sensibilidad de M. abscessus a los antibióticos, lo que hace que estas infecciones extremadamente difíciles de tratar que conduce a una tasa de fracaso terapéutico significativo 8,9. La amenaza importante de esta especie es principalmente su resistencia intrínseca a los antibióticos, lo cual es motivo de gran preocupación en las instituciones de salud pública 10 y una contraindicación para el trasplante de pulmón 11. M. abscessus pantallas morfotipos (R) de colonias lisas (S) o ásperos que conducen a diferentes resultados clínicos. En contraste con la cepa S, R bacterias tienen una tendencia a crecer de extremo a extremo, lo que lleva a una cuerda o similar a un cordón estructura 12,13. Varios estudios independientes basados ​​en modelos ya sea celulares o animales revelaron el fenotipo hiper-virulencia de la R morfotipo 14,15. A partir de estudios epidemiológicos, los casos más graves de M. infecciones pulmonares abscessus parecen estar asociados con R variantes de 16, que son la única variante quese ha visto a persistir durante años en un huésped infectado 3. La diferencia morfotipo se basa en la presencia (en S) o pérdida (en R) de glicopeptidolípidos asociadas a la superficie (GPL) 12. Sin embargo, debido a las limitaciones inherentes de los modelos de celular / animales disponibles actualmente utilizado para estudiar M. infección abscessus, nuestro conocimiento sobre los hechos fisiopatológicos de las variantes R o S sigue siendo oscuro. La infección de ratones inmunocompetentes vía intravenosa o en aerosol conduce a la colonización transitoria, lo que impide el uso de ratones para estudiar las infecciones persistentes y en vivo las pruebas de sensibilidad de drogas 17. Por lo tanto, el desarrollo de modelos animales susceptibles a la manipulación de la respuesta del huésped es un gran desafío. En este contexto, los modelos no mamíferos de infección se han desarrollado recientemente, incluyendo Drosophila melanogaster 18 que ofrece una serie de ventajas como el coste, la velocidad y la ética o la aceptabilidadVer el modelo de ratón. El modelo de pez cebra (Danio rerio) de infección también se ha explorado para visualizar, mediante formación de imágenes no invasiva, la progresión y la cronología de M. infección abscessus en un animal vivo 19. Es importante destacar que también se estableció una prueba de concepto para demostrar su idoneidad para in vivo evaluaciones antibióticos contra M. abscessus 17,20. El pez cebra se han utilizado ampliamente durante las últimas dos décadas para estudiar las interacciones entre diversos patógenos y el sistema inmune del huésped 21. El creciente éxito de este modelo de vertebrados alternativa se basa en las principales y únicas oportunidades que motivaron y validan su uso para una mejor comprensión de numerosas infecciones virales y bacterianas 19,22,23,24,25,26,27,28,29. A diferencia de la mayoría de otros modelos animales, embriones de pez cebra son ópticamente transparentes, lo que permite imágenes de fluorescencia no invasiva 30. Esta Has llevado a estudiar M. abscessus infectado embriones de pez cebra con detalles sin precedentes, que culminó con la descripción de grabación extracelular, que representan un ejemplo de plasticidad morfológica bacteriana. Cording representa un nuevo mecanismo de subversión del sistema inmunológico y un mecanismo fundamental promover patogénesis de la aguda M. infección abscessus 19. Este informe describe las nuevas herramientas y métodos que utilizan el embrión de pez cebra para descifrar las características fisiopatológicas de M. abscessus infección y para estudiar las interacciones íntimas entre los bacilos y el sistema inmune innato. En primer lugar, un protocolo de microinyección detallado que incluye el procesamiento de la inóculo bacteriano, la preparación de embriones, y la infección per se, se presenta. Métodos adaptados específicamente para evaluar M. virulencia abscessus midiendo diferentes parámetros, como la supervivencia de acogida y la carga bacteriana, se presentan. Se presta especial atención sobre la formapara supervisar, a nivel espacio-temporal, el destino y la progresión de la infección y de la respuesta inmune del huésped a M. abscessus usando microscopía de video. Por otra parte, para investigar la contribución y el papel de los macrófagos durante M. abscessus infección, métodos para generar los macrófagos-agotado embriones (utilizando enfoques ya sea genetically- o basados ​​químicamente) se describen. Por último, los protocolos para visualizar las interacciones específicas con los macrófagos o neutrófilos utilizando ya sea fijo o embriones vivos están documentados. El objetivo de este informe es estimular más estudios para arrojar nueva luz en M. mecanismos de virulencia abscessus y en particular el papel de acuerdo en el establecimiento de un proceso de infección aguda e incontrolada.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BBL MGIT PANTA</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>245114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>04-100-811-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from Bovine Liver&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Middlebrook 7H10 Agar</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>262710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Middlebrook 7H9 Broth</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Delta Microscopie</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>319244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Gibco Life Technologie</td>
			<td>30391-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Ocean Sea Salts&#160;</td>
			<td>Aquarium Systems Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries&#160;</td>
			<td>Sutter instrument Inc</td>
			<td>BF100-78-10</td>
			<td>1mm O.D. X 0.78 mm I.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller device&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument Inc</td>
			<td></td>
			<td>Flamming/Brown Micropipette Puller p-87</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Tritech Research&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Digital microINJECTOR, MINJ-D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sciences Tools inc</td>
			<td></td>
			<td>Dumont # M5S&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deciphering and imaging pathogenesis and cording of mycobacterium abscessus in zebrafish embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions.&#160;The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model.&#160;In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an&#160;in vivo&#160;model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

Aunque diversos sitios anatómicos pueden ser inyectados 32, las inyecciones de la vena caudal se utilizan a menudo para generar infección sistémica para análisis posteriores experimentos de supervivencia, incluyendo la determinación de la carga bacteriana, la actividad de la fagocitosis o la formación del cordón. Las inyecciones en los músculos de la cola se utilizan para evaluar el reclutamiento de macrófagos en el sitio de la inyección (Figura 3A). Para investigar y comparar la vi...

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Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

Descifrar e imagen Patogénesis y Cording de<em&gt; Abscessus Mycobacterium</em&gt; En embriones de pez cebra

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

10.1K vistas.  Université Montpellier. Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos. 