Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la interacción huésped-patógeno, como la patogenicidad y la virulencia de la infección bacteriana. La principal ventaja de esta técnica es que podemos evaluar la toxicidad entre y dentro de las especies de Aeromonas y contribuir a nuestra comprensión de la patogénesis de la infección de Aeromonas. Para comenzar a lavar aproximadamente 2.000 gusanos adultos gravid con agua estéril desionizada.
Repita el lavado tres veces manteniendo los gusanos en la parte inferior del tubo. Después de centrifugar los gusanos quitar el sobrenadante y mantener los gusanos en 3.5 mililitros de agua desionizada. Añadir un mililitro de hipoclorito de sodio y 0,5 mililitros de hidróxido de potasio al tubo.
A continuación, agitar el tubo durante seis minutos para anlicer los cuerpos del gusano. Después de que se liberen los huevos, agregue 10 mililitros de agua desionizada para detener la lelisis. A continuación, centrifugar el tubo para tirar hacia abajo de los huevos y eliminar la mayor cantidad de sobrenadante como sea posible.
Lavar los huevos con 15 mililitros de M9 mediano al menos tres veces. Transfiera los huevos a un plato de 3,5 centímetros e i incubarlos a 20 grados centígrados durante una noche. Después de esto retire 10 microlitros de gusanos L1 y medio M9 de la placa.
Contar los gusanos y obtener la concentración de gusanos L1 en el medio M9. Con una pipeta, tome 0,5 mililitros de caldo E.coli OP50 LB y extiéndalo en una placa ENGM. Luego incubar la placa a 37 grados Celsius durante 16 a 18 horas.
Enfríe el ENGM a temperatura ambiente. A continuación, la semilla incuba gusanos L1 en una placa ENGM con E.coli OP50. Incubar los gusanos a 20 grados centígrados hasta que lleguen a la etapa L4.
En primer lugar, seleccione una sola colonia de cada una de las cuatro cepas de Aeromonas y escúlelas de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, mida la absorbancia OD 600 del caldo bacteriano y ajústelo hasta que la absorbancia sea igual a 2.0. Siguiente punto y esparcir 30 microlitros de caldo bacteriano de cada cepa en placas NGM.
Seleccione y transfiera aleatoriamente los gusanos L4 previamente preparados a las placas NGM con las cepas Aeromonas. Luego incubar las placas a 20 grados centígrados hasta que el ensayo esté completo. Todos los días transfieren todos los gusanos vivos a una nueva placa NGM con bacterias.
Cuenta el número de gusanos vivos, muertos y sensores todos los días hasta que el último gusano esté muerto. Después de cultivar las cepas de Aeromonas y medir su absorbancia como se describió anteriormente, centrifugar el caldo bacteriano a 3.500 g durante 15 minutos. Ajuste el caldo bacteriano con S Medium.
Y añadir 195 microlitros de caldo bacteriano en el medio S a ocho pozos de una placa de 96 pozos. Lavar los gusanos de la placa ENGM con ellos M9 medio. A continuación, ajuste la concentración de la solución de gusano a cinco gusanos por microlitro.
Agregue cinco microlitros de la solución de gusano a cada uno de los pozos de la placa de 96 pozos. Incubar el plato en una coctelera, y contar el número de gusanos vivos a las 24, 48 y 72 horas. Después de cultivar las cepas de Aeromonas y ajustar la absorbancia de acuerdo con el punto del protocolo de texto y esparcir el caldo bacteriano en las placas NGM.
Después de esto, transfiera 50 gusanos L4 a cada placa NGM. Cada 24 horas transfiere los gusanos a placas NGM frescas. Seleccione aleatoriamente 10 gusanos y transfiéralos a un gel de 2% de agarosa en un medio M9 en una diapositiva.
Finalmente coloque un cubreobjetos en el gel y capture imágenes musculares con un filtro de proteína fluorescente verde en un microscopio fluorescente equipado con una cámara. En este protocolo se evaluaron las toxicidades de cuatro cepas de Aeromonas. La tasa de supervivencia de C.elegans infectados con especies de Aeromonas fue más alta en ensayos usando A.caviae, y más baja en ensayos usando A.dhakensis.
En un ensayo de toxicidad líquida la supervivencia de C.elegans disminuyó significativamente cuando se infectó con A.dhakensis o A.hidrofilia. En el ensayo de necrosis muscular los grados de daño muscular variaron entre las especies de Aeromonas. A.caviae causó el menor daño muscular, mientras que A.dhakensis produjo la mayor cantidad de daño muscular.
Los métodos descritos en este video ofrecen una manera conveniente de diferenciar la diversidad de la virulencia entre y dentro de las especies de Aeromonas. Además, también es un modelo fiable para estudiar la interacción entre un patógeno y el huésped.
