This work was supported in part by the US National Institutes of Health (R01 HL 111600) and the American Heart Association (12SDG9010015).

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California, Davis, y se adhirieron a la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicado por los Institutos Nacionales de Salud. 1. Preparación <ol><li> Prepare dos concentrados (25X) los stocks de solución de Tyrode modificada por adelantado y se almacena a 4 ° C: (1) de la I (en mM: NaCl 3205, CaCl2 32,5, KCl 117.5, NaH 2 PO 4 29.75, MgCl2 26.25) y (2) de la II (en mM: NaHCO3 500). <ol><li> Recién preparar la solución de 2 L Tyrode de la siguiente composición (en mM): NaCl 128,2, CaCl 2 1,3, KCl 4,7, MgCl 2 1,05, NaH 2 PO 4 1,19, NaHCO3 20 y glucosa 11,1 mediante la combinación de 1840 ml de agua desionizada (DI) agua, 80 ml Stock I, 80 ml de Stock II, y 4 g de glucosa. No mezclar directamente de la I y II de la; añadir elm a 1840 ml DI para evitar la precipitación. </li></ol></li><li> Preparar la solución madre del desacoplador blebbistatin excitación-contracción en 10 mg / ml en anhidro di-metilsulfóxido (DMSO) con antelación y almacenar la solución madre a 4 ° C. </li><li> Preparar soluciones madre de colorantes fluorescentes: (1) RH237 sensibles al voltaje colorante (1 mg / ml en DMSO) y (2) indicador de calcio de baja afinidad Fluo-5N AM (2 mg / ml en DMSO) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Utilice los preparativos de inmediato para evitar la descomposición, con la consiguiente pérdida de capacidad de carga. </li><li> Cebe la recirculación sistema de perfusión Langendorff con oxigenada (95% O 2, 2 5% de CO) solución de Tyrode. Ajustar el flujo de O 2 / CO 2 para mantener el pH de la solución de Tyrode a 7,4 ± 0,05. Utilice un filtro de red en línea de nylon tejido (tamaño de poro: 11 micras) para filtrar continuamente el líquido de perfusión. <ol><li> Cebe el sistema de perfusión a temperatura ambiente, como la posterior loading de Fluo-5N AM se lleva a cabo a temperatura ambiente. Para Fluo-5N AM carga, utilice un pequeño volumen de líquido de perfusión de recirculación (~ 150 ml). Después de colorante de carga, utilizar un volumen mayor de líquido de perfusión (1 - 2 L, véase la Figura 1C). </li></ol></li><li> Encienda el sistema de adquisición de datos y prepararse para la monitorización continua de la presión de ECG y la perfusión. Prepara sistema de presión-vigilancia: Conecte un transductor de presión a la línea de perfusión y monitorear la presión de perfusión con un amplificador transbridge. Ajuste la presión de perfusión basal a 0 mmHg cuando el corazón no está conectado al sistema de perfusión. </li><li> Alinear las cámaras de mapeo óptico para asegurar la alineación espacial entre el V my SR Ca 2 + señales. <ol><li> En primer lugar, se centran las cámaras mediante la colocación de un gobernante o un objeto con el texto en el plato de la perfusión. A su vez las cámaras de mapeo en un modo de visualización en directo y ajustar el enfoque hasta que el texto es nítido y claro. Adquirir una sola imagen Marco de cada cámara. </li><li> Superposiciónestas imágenes y ajustar la transparencia de la imagen de arriba, así que ambas imágenes son visibles. El texto en las imágenes debe superponerse con exactitud. Si no perfectamente alineados, ajustar el ángulo del espejo dicroico o la posición de cada cámara hasta que se alinean las dos imágenes. </li></ol></li></ol> 2. La recolección, perfusión y tinte de carga del corazón de conejo <ol><li> Asegure el conejo en un retenedor de conejo aprobado. Profundamente anestesiar a través de una inyección intravenosa (vena marginal de la oreja) de pentobarbital sódico (50 mg / kg) y heparina (1000 IU). <ol><li> Cuando los conejos pantallas carecen de reflejos nociceptivos, hacer una incisión en la piel en la línea media para exponer el esternón y las costillas. Corte a través del esternón con-contundentes punta tijeras quirúrgicas desde el xifoides al manubrio. Tenga cuidado de no dañar el corazón al abrir el esternón. Difundir las costillas para exponer el corazón. </li><li> Extirpar rápidamente todo el bloque corazón-pulmón cortando rápidamente todos los vasos y tejido conectivo. Immediatamente colocar el bloque corazón-pulmón en solución enfriada con hielo de Tyrode. </li></ol></li><li> Localice la aorta para la perfusión retrógrada. Cortar la aorta ascendente proximal a las tres ramas del cayado aórtico. Canular la aorta a una cánula de 8 G conectado al sistema de perfusión. Use un pedazo de sutura USP 0 seda para asegurar la aorta en la cánula. </li><li> Diseccionar cuidadosamente la tráquea, los pulmones y la grasa epicárdica del corazón. Con un fuerte pinzas y tijeras de disección, localizar la válvula mitral y cuidadosamente dañar o quitar un folleto para evitar la congestión de la solución en el ventrículo izquierdo. </li><li> Sumergir el corazón en la cámara de perfusión con camisa de vidrio horizontalmente con la superficie anterior del corazón hacia arriba para formación de imágenes. Fije la cánula a una pieza de Sylgard con los pernos en forma de U en la parte inferior del plato de silicio para evitar el movimiento del corazón durante el mapeo (Figura 1D). Si lo desea, inserte un alfiler pequeño insecto en el ápice del corazón por stabilización. </li><li> Posición electrocardiograma (ECG) electrodos en el baño en el lado derecho e izquierdo del corazón. Sumergir totalmente los electrodos en el baño y asegurarse de que no están en contacto con la superficie del corazón para proporcionar un ECG volumen realizado análoga a una configuración de derivación I. Verifique un plomo normal, me ECG morfología. Ajuste el flujo (25 - 35 ml / min) para asegurar que la presión aórtica se mantiene a 60 - 70 mmHg. </li><li> Apague las luces de la sala y añadir 0,3 a 0,6 ml de solución madre blebbistatin (paso 1.2) a la perfusión (concentración final 10 a 20 M). <ol><li> Apague las luces de las habitaciones para evitar fotoinactivación de blebbistatin. Si es necesario, un pequeño proyector o faro se pueden usar para proporcionar iluminación de la tarea. Nota: blebbistatin es un inhibidor de la ATPasa de la miosina y un desacoplador excitación-contracción. Debido Fluo-5N carga requiere condiciones prolongados (60 min) RT (hipotermia) (consulte los pasos 2,8 - 2,10), la producción de energía cardiaca podría estar comprometida. Therefore, la adición de blebbistatin en el perfundido antes de colorante de carga puede reducir la demanda de energía 16 y eliminar los artefactos de movimiento durante las grabaciones ópticas posteriores 17. </li></ol></li><li> Cuando la contracción del corazón ha cesado (10 - 15 min, verificado en el registro de la presión aórtica), cambiar al sistema de perfusión de recirculación de pequeño volumen (vea el paso 1.4.1). </li><li> Preparar y cargar solución de carga Fluo-5N AM: Añadir 0,25 ml de Fluo-5N AM solución madre (paso 1.3) a 0,25 ml cálida 20% F127 Pluronic. Añadir 0,5 ml de solución caliente de Tyrode a la mezcla, mezclar bien y agregar al sistema de perfusión de recirculación de pequeño volumen. </li><li> Monitorear continuamente la presión de perfusión y ECG y ajustar el flujo si es necesario. Colorante de carga dura aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente. 45 min después de la carga ha comenzado, encienda el baño de agua circulante para comenzar a calentar el sistema de perfusión y la perfusión a 37 ° C. </li><li> Después de 60 minutos de Fluo-5N AM carga, switch la perfusión para el sistema de perfusión recirculante volumen más grande (véase el paso 1.4). </li><li> Diluir 50 l de solución de colorante sensible al voltaje de la RH237 (etapa 1.3) en 1 ml de solución caliente de Tyrode y se añade lentamente (más de ~ 5 min) en un puerto de inyección proximal a la cánula. </li></ol> 3. Mapeo óptico <ol><li> Durante los momentos finales de colorante de carga, coloque el corazón y el enfoque de las cámaras de mapeo óptico para asegurar el campo apropiado de vista para el experimento. </li><li> Si lo desea, coloque un electrodo de estimulación bipolar en la superficie epicárdica del corazón para la estimulación. </li><li> Coloque un plástico o de vidrio cubierta de resbalón en la superficie de la cámara de perfusión para reducir los artefactos de movimiento en la superficie del líquido que puede estar presente debido a la recirculación del líquido de perfusión. Nota: Como alternativa a una hoja de cubierta, utilice una cubierta de plástico de cocina limpio 50 mm Petri. </li><li> Centrarse las guías de luz para iluminar uniformemente la superficie del corazón con el correoluz xcitation. Utilice azul diodo emisor de luz (LED) fuentes de luz y filtrar aún más la luz con un 475 a 495 nm filtro de banda (Figura 1). </li><li> Recoger fluorescencia emitida con un macroscopio y dos de metal-óxido-semiconductor (CMOS) cámaras de mapeo óptico complementarias. Dividir la luz emitida con un espejo dicroico a 545 nm. <ol><li> -Pass largo filtrar la fracción de longitud de onda más larga, que contiene la señal m V, a 700 nm. De paso de banda filtrar la fracción de longitud de onda más corta, que contiene la señal SR Ca 2 +, 502 a 534 nm (Figura 1A). Ajuste la frecuencia de adquisición de datos ópticos de 0,5 a 1 kHz. </li></ol></li><li> Para cada grabación óptica, primero iniciar el protocolo de estimulación deseada, encender la luz de excitación, y recoger 1-4 seg de datos. Si lo desea, sincronizar el protocolos de estimulación y adquisición de datos. Nota: No es posible volver a cargar el Fluo-5N AM, por lo tanto la relación señal a ruido (SNR) se decreaSE lo largo del experimento debido a teñir fuga de la SR. Limite protocolo experimental a 1 - 2 horas para asegurar altos valores de SNR. </li><li> Tras el experimento, lavar el sistema de perfusión en la secuencia de agua DI, 70% de alcohol reactivo, y nuevamente con agua DI. </li><li> Filtra cada conjunto de datos con un filtro gaussiano espacial (radio de 3 píxeles) utilizando paquetes de software disponibles comercialmente de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> Si es necesario, espacialmente alinear el V my SR conjuntos de datos Ca 2+. Como en el paso 1.6, superponer imágenes de cada cámara y verificar que las estructuras anatómicas del corazón (es decir., Vasculatura coronaria, bordes de las aurículas o ventrículos) u otros artículos en el campo de visión (es decir, la cánula, el electrodo de estimulación) exactamente solapamiento. Si no, la alineación espacial de los conjuntos de datos es necesario. </li><li> Cambie la imagen transparente superior se logra en las direcciones x e y-dirección hasta que la superposición exacta, tomando nota del número de píxelesla imagen debe ser desplazado en cada dirección. Todo el conjunto de datos correspondiente a la parte superior de la imagen (ya sea V m o SR Ca 2+) debe entonces ser desplazado por el número determinado de píxeles en cada dirección para asegurar la alineación precisa entre el V y m SR Ca 2+ conjuntos de datos. </li></ol>

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++ATPase+2a+gene+delivery+to+restore+electrical+stability+in+the+failing+heart.">Targeted sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase 2a gene delivery to restore electrical stability in the failing heart.</a> Circulation. 126, 2095-2104 (2012).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Las claves del éxito Fluo-5N colorante de carga son la configuración de perfusión de recirculación de pequeño volumen, lo que permite una alta concentración Fluo-5N sin la necesidad de grandes cantidades de colorante, la longitud de tiempo de carga (1 hr), y la realización de la carga a TA. Si la carga se realiza a temperaturas fisiológicas, la actividad enzimática celular rápidamente escinde la etiqueta -AM cuando el colorante atraviesa la membrana celular, atrapando las moléculas de colorante en el citosol ...

Dual optical mapping of intracellular Ca2+ and transmembrane potential (Vm) in the intact Langendorff-perfused heart has become a mainstay of investigations in cardiac electrophysiology, including mechanisms of arrhythmia and excitation-contraction coupling1-4. This approach has provided unprecedented knowledge into normal and abnormal electrophysiology and, importantly, into the bidirectional relationship between Vm and intracellular Ca2+. However, optical mapping of intracellular Ca2+ with high-affinity fluorescent indicators (such as Rhod-2 and Fluo-4) only reports on bulk changes in intracellular Ca2+ and is unable to distinguish whether these changes are due to transmembrane Ca2+ flux, release and reuptake into intracellular stores, or in most instances, some combination of both. Furthermore, high-affinity Ca2+ indicators have slow on-off kinetics and may not accurately report rapid changes in Ca2+ concentration5.
Each action potential triggers a rise in intracellular Ca2+, known as the intracellular Ca2+ transient (CaT). In the mammalian heart, approximately 70 &#8211; 90% of the total CaT is due to release of Ca2+ from the sarcoplasmic reticulum (SR) via opening of ryanodine receptors (RyRs)6. Within the SR, approximately half of the total Ca2+ is bound to calsequestrin (CSQ) and other intra-SR buffers7, which play an important role in SR Ca2+ homeostasis8,9. The amount of free SR Ca2+ dictates the driving force for SR Ca2+ release as well as gating of RyR, and therefore has a significant impact on the intracellular CaT. Furthermore, alterations in SR Ca2+ release or reuptake can, in turn, impact Vm via the electrogenic Na+-Ca2+ exchange, which may have arrhythmogenic consequences. Therefore, in addition to the CaT, monitoring of free SR Ca2+ can provide important insights into contractile and electrophysiological dysfunction.
Over the past several years, investigators have made significant advances in the monitoring of SR Ca2+ in isolated cardiac myocytes and from a single location on the intact heart. One such method requires rapid pulses of caffeine to open RyRs and the SR Ca2+ content is then inferred or calculated from the immediate rise in intracellular Ca2+10. Another intriguing approach uses low-affinity Ca2+ indicators, such as Fluo-5N11 or Mag-Fluo412, which bind to free SR Ca2+. These indicators have dissociation constants (Kd) in the range of 10 &#8211; 400 &#956;M and therefore exhibit minimal fluorescence in the cytosol compared to the SR lumen, where the Ca2+ concentration ([Ca2+]SR) is in the millimolar range. Using low-affinity Ca2+ indicators, several aspects of SR Ca2+ cycling have been investigated at the level of the isolated myocyte, including fractional SR Ca2+ release and the mechanisms of Ca2+ alternans13,14. However, in order to fully understand the heterogeneous nature of SR Ca2+ cycling in the intact heart and the role of SR Ca2+ in spatially distinct arrhythmic phenomena, methods for imaging SR Ca2+ across the epicardial surface of the intact heart are required15.
This article describes methodology for dual optical mapping of free SR Ca2+ and Vm in the intact Langendorff-perfused rabbit heart with the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="956">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">S271-1</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">CaCl2 (2H2O)</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">C79-500</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">S217-500</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">MgCl2 (6H2O)</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">M33-500</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">NaH2PO4 (H2O)</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">S369-500</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">S233-3</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">D16-1</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">95% O2 5% CO2</td>
			<td style="width:167px;">AirGas</td>
			<td style="width:151px;">carbogen</td>
			<td style="width:423px;">For oxygenation and pH of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Blebbistatin</td>
			<td style="width:167px;">Tocris Bioscience</td>
			<td style="width:151px;">1760</td>
			<td style="width:423px;">Excitation-contraction uncoupler</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">RH237</td>
			<td style="width:167px;">Biotium</td>
			<td style="width:151px;">61018</td>
			<td style="width:423px;">Voltage-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Fluo-5N AM</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">F-26915</td>
			<td style="width:423px;">Low-affinity Ca2+ indicator; Alternative: Invitrogen F-14204; Loading must be performed at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Pluronic F127</td>
			<td style="width:167px;">Biotium</td>
			<td style="width:151px;">59004</td>
			<td style="width:423px;">For Ca2+ indicator loading; Warm until the solutiion is clear before use</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Dimethyl sulphoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">D2650</td>
			<td style="width:423px;">For dissolving blebbistatin and dyes</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Filter</td>
			<td style="width:167px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:151px;">NY1104700</td>
			<td style="width:423px;">11um in-line filter</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Pressure Transducer</td>
			<td style="width:167px;">WPI</td>
			<td style="width:151px;">BLPR2</td>
			<td style="width:423px;">For measuring perfusion pressure</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Transbridge Transducer Amplifier</td>
			<td style="width:167px;">WPI</td>
			<td style="width:151px;">SYS-TBM4M</td>
			<td style="width:423px;">For transducing/amplifing pressure signal; PowerLab may also be used with appropriate BioAmp</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">PowerLab 26T</td>
			<td style="width:167px;">ADInstruments</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:423px;">For continuous recording of pressure and ECG signals</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">THT Macroscope</td>
			<td style="width:167px;">SciMedia</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:423px;">Macroscopic optical setup. Details: 0.63x objective (NA=0.31), 2x condensing objective, resultant field of view = 3.1x3.1 cm, depth of focus = ~1.5mm</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">MiCam Ultima-L CMOS</td>
			<td style="width:167px;">SciMedia</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:423px;">Optical mapping cameras</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Precision LED Spot Light</td>
			<td style="width:167px;">Mightex</td>
			<td style="width:151px;">PLS-0470-030-15-S</td>
			<td style="width:423px;">LED light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical mapping of intra-sarcoplasmic reticulum ca2+ and transmembrane potential in the langendorff-perfused rabbit heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

La figura 1A muestra un diagrama esquemático de la configuración óptica para la doble V m y SR Ca 2+ mapeo. Con esta configuración, no hay separación espectral completa de la V my SR Ca 2 + señales (Figura 1B). Un diagrama del sistema de perfusión de doble bucle utilizado para Fluo-5N colorante de carga se ilustra en la Figura 1C. Figura 1D muestra la orientación horizontal del corazón en el plato de ...

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Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

En este artículo se describe el protocolo detallado y equipos necesarios para el mapeo óptico dual de potencial transmembrana (V m) y libre retículo intra-sarcoplásmico (SR) Ca 2+ en el corazón de conejo perfundidos Langendorff. Este método permite la observación directa y la cuantificación de V m y SR Ca 2+ dinámica en el corazón intacto.

Mapeo óptico de Intra-retículo sarcoplásmico Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Y potencial transmembrana en el corazón de conejo perfundidos Langendorff

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

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Research

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Biology

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

9.1K vistas.  University of California Davis.  En este artículo se describe el protocolo detallado y equipos necesarios para el mapeo óptico dual de potencial transmembrana (V m) y libre retículo intra-sarcoplásmico (SR) Ca 2+ en el corazón de conejo perfundidos Langendorff. Este método permite la observación directa y la cuantificación de V m y SR Ca 2+ dinámica en el corazón intacto. 