This article was supported by Award Number R01GM087227 from the National Institute of General Medical Sciences, the Norman Ackerman Advanced Research Program, and the Robert A. Welch foundation (Grant A-1769).

1. SPPS: CK (TMR) TATG (fTAT) Síntesis Nota: dfTAT se produce en dos etapas: la síntesis del monómero fTAT por síntesis de péptidos en fase sólida seguida de dimerización disulfuro de bonos para formar dfTAT. <ol><li> Swell 500 mg de resina MBHA de amida de Rink en dimetilformamida (DMF) en un recipiente de 50 ml SPPS estándar para 1 hr. </li><li> Realizar desprotección de Fmoc mediante la incubación de la resina protegida con Fmoc en una solución de piperidina al 20% (20% de piperidina en DMF, 10 ml (0,30 mmol). Llevar a cabo etapas de desprotección dos veces (1 x 5 min y 1 x 15 min) con una etapa de lavado usando DMF (la etapa de lavado incluye enjuagar la resina varias veces con un volumen total de aproximadamente 150 ml de DMF y eliminar el disolvente por filtración al vacío) entre reacciones. </li><li> Sintetizar CK (TMR) RKKRRQRRRG (fTAT) en la resina MBHA de amida pista. Utiliza el siguiente Fmoc aminoácidos protegidos: Fmoc-Lys (MTT) -OH (sólo en el extremo N-terminal), Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc- Gln (Trt) -OH, Fmoc-Cys y (Trt) -OH. Llevar a cabo la reacción utilizando N 2 (20 PSI) para agitar la reacción. Realizar todas las reacciones a temperatura ambiente. <ol><li> Realizar cada reacción de acoplamiento de aminoácidos durante 4 horas. Para cada acoplamiento, utilice el aminoácido protegido con Fmoc (1,2 mmol), N, N, N &#39;, N&#39; -tetrametil- O- (benzotriazol-1 H-1 il) uronio (HBTU) (0,44 g, 1,1 mmol ), y diisopropiletilamina (DIEA) (0,51 ml, 3,0 mmol) disuelto en DMF. Después del acoplamiento 4 hr, lavar la resina con DMF y llevar a cabo la etapa de desprotección Fmoc como se describe en el paso 1.2. </li><li> Repita hasta que la cadena peptídica lineal de fTAT: fue sintetizado (cadena peptídica lineal CKRKKRRQRRRG sin TMR). </li><li> A continuación, lavar la resina a fondo usando primero DMF y después de que con diclorometano (DCM). Enjuagar la resina varias veces con un volumen total de aproximadamente 150 ml de DMF o DCM y eliminar el disolvente por filtración al vacío. </li><li> Use MALDI-TOF para confirmar que el péptido obtenido tiene el peso molecular correcto. <ol><li> Hacer una mezcla matriz mediante la adición de 1 mg de la matriz a una solución compuesta por 50 l de 0,01% TFA en solución de agua y 50 l de acetonitrilo. </li><li> Para confirmar masa cadena de péptido lineal, utilizar el ácido α-ciano-4-hidroxicinámico. Ejecutar un HPLC analítico del péptido en bruto y recoger 50 l desde la parte superior del pico puro. </li><li> Para preparar la muestra a la placa en la placa de MALDI: Añadir 8 l de péptido a 2 l de la solución de la matriz y el lugar en la placa de MALDI secar al aire o en una placa de calor 37 ° C. Nota: La arginina es conocido por ser un ácido difícil de pareja en SPPS amino. Acoplamiento exitoso se establece mediante la realización de una prueba de Kaiser 14 (prueba por ejemplo, ninhidrina). Esta prueba permite la detección de aminas libres que no hayan quedado desacoplada en la resina. En caso de que se detecte un color azul (indicativo de la presencia de aminas libres), de acoplamiento steps se repiten. </li></ol></li></ol></li><li> Para CK (-NH-TMR) TATG (fTAT), escindir el grupo protector MTT en el grupo amino de Lys en la CK (-NH-MTT) TATG con una solución compuesta de ácido 1% trifluoroacético (TFA) y 2% triisopropilsilano (TIS) en DCM. <ol><li> Como la eliminación de grupo protector MTT daría lugar a la aparición de un color amarillo, se incuba la resina con 20 ml de la solución anterior durante 5 minutos, repetir esto hasta que no se observa ningún color amarillo. Lavar la resina con DCM y DMF en el medio. Además desde TIS es un limpiador que captar el MTT, una vez que no aparece ningún color amarillo en la solución en presencia de MTT. </li><li> Añadir una solución adicional con 1% de TFA en DCM (sin TIS) a la resina para asegurar que no más MTT se retira y la solución permanece clara. </li></ol></li><li> Disolver los tres componentes: carboxitetrametilrodamina (TMR), HBTU y DIEA (4, 3.9 y 10 la equivalencia con respecto a la cantidad de resina (en mg)) en DMF y añadir esta mezclaa la resina y llevar a cabo la reacción de O / N utilizando N2 seco para proporcionar agitación. </li><li> Siguiendo Fmoc-desprotección y conjugación de aminoácidos, lavar la resina con DCM y deje que se seque. Para la escisión completa del péptido de la resina, se añade una solución que contiene 92,5% de TFA, 2,5% H 2 O, 2,5%, TIS y 2,5% de etanoditiol (EDT) (volumen total = 4 ml) a la peptidil-resina para 3 hr a RT para lograr la desprotección global y escisión de la resina. <ol><li> Precipitar los productos peptídicos bruto usando éter etílico anhidro frío (Et 2 O) mediante el drenaje de la solución de la etapa 1.6 en 40 ml de Et 2 O, girar esto abajo a 4 ° C y 4.000 xg durante 20 - 25 min. Repita este paso para permitir el lavado del precipitado con anhidro frío Et2O </li><li> Resuspender el precipitado en agua (5 ml o hasta que se haya disuelto completamente precipitado) y se liofiliza. Entonces resuspender los productos obtenidos en 0,1% TFA acuoso / acetonitrilo. </li></ol></li> &lt;li&gt; Realizar el análisis por HPLC con una columna analítica C18 (5 m, 4 x 150 mm) para analizar cada péptido. Utilice una velocidad de flujo de 1 ml / min, y detección a 214 nm y 550 nm. </li><li> Realizar HPLC semi-preparativa en una columna C18 10 x 250 mm para la purificación de péptidos. Utilice una velocidad de flujo de 4 ml / min, y detección a 214 nm y 550 nm. Para todas las corridas, utilizar gradientes lineales de 0,1% TFA acuosa (disolvente A) y 90% de acetonitrilo, 9,9% de agua, y 0,1% de TFA (disolvente B). </li><li> Confirmar la identidad correcta de los péptidos por MALDI-TOF de acuerdo con el protocolo del fabricante: fTAT, masa esperada: 2,041.17, masa observada: 2.040,66. DEAC-K9, que se espera de masas: 1,412.97, observó masa: 1,415.59. Utilice una matriz de ácido ciano-4-hidroxicinámico α- para el MALDI-TOF. </li></ol> 2. Oxidación de reacción: dfTAT Generación <ol><li> Airear salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4 durante 1 hora (al menos 5 ml para la reacción a continuación). </li><li> Disolver fTAT (0,3 mg, 1,5 x 10 -4 mmol) en aerado PBS pH 7,4 (5 ml). Asegúrese de que el pH está entre 7.0 - 7.5 después de la adición del péptido. Si no añadir hidróxido de sodio (1 M, en pequeños incrementos 1 - 5 l) para llevar el pH de nuevo hasta 7,4. </li><li> Nota: El oxígeno disuelto en PBS actúa para oxidar los grupos tiol en fTAT y formar un enlace disulfuro. </li><li> Inclinar la cabeza de la reacción de O / N para permitir que reaccione hasta la finalización (rendimiento 100% basado en el análisis HPLC). Se purifica el producto mediante HPLC de fase inversa y analizar mediante espectrometría de masas (MALDI-TOF) como en el paso 1.9. Masa esperado: 4,080.34, observó masa: 4,084.21. </li><li> Liofilizar pura dfTAT (0,71 x 10 -4 mmol) y resuspender en 200 l de agua (concentración pura dfTAT = 356,3 M). </li></ol> 3. Medir dfTAT Concentración <ol><li> Resuspender una alícuota de la dfTAT purificada (típicamente 1 l dependiendo de la cantidad de péptido purificado) en un 149 l de 50 mM solución de TCEP. </li><li> Nota: En este paso dfTAT se reduce a su monomer contraparte fTAT para eliminar la absorbancia de enfriamiento que se produce debido a la proximidad del fluoróforo TMR en dfTAT (ε el coeficiente de extinción de TMR en dfTAT se reduce en comparación con el ε de TMR en fTAT reducida). </li><li> Permitir que la muestra reaccione durante aproximadamente 20 min (HPLC analítica se puede utilizar para confirmar la formación de fTAT). </li><li> Añadir toda la solución a la cubeta de cuarzo y se mide la absorbancia a 556 nm. </li><li> Usando la ley de Beer (A = εcl: ε = 91500 M -1 cm -1) para calcular la concentración de fTAT, determine la concentración de dfTAT y dividir [fTAT] por dos. </li></ol> 4. Experimentos de entrega celulares <ol><li> Seed las células (HeLa, HDF, etc.) En un plato en una confluencia del 80 - 90% (por ejemplo, 8 pocillos o de 24 pocillos plato). Cultivan las células en un medio apropiado (por ejemplo, DMEM suplementado con 10% de FBS y Pen / Strep) hasta 80 - 90% de confluencia en un 37 ° Cambiente humidificado contiene 5% de CO 2. </li><li> Se lavan las células tres veces (3X) con PBS (mediante la adición de 200 l de PBS y luego extraerla tres veces). </li><li> Haga una concentración de trabajo 5 M de dfTAT diluyendo un stock de dfTAT (en agua) en la NRL-15 medios de comunicación (para un 8 y plato el volumen total debe ser de 200 l). Una concentración de 5 mM dfTAT conduce a la entrega eficiente (alto nivel de entrega citosólica en más de 90% de las células presentes en un plato) en la mayoría de tipos de células ensayadas hasta la fecha (Figura 3). Sin embargo, las concentraciones inferiores o superiores pueden ser más adecuados para tipos de células con una propensión alta o baja para la penetración. NOTA SOBRE MEDIOS: NRL-15 se utiliza para la entrega de dfTAT ya que no contiene cisteína, que podría reducir el enlace disulfuro en dfTAT. Sin embargo, nuestros datos indican que tanto regulares L-15 (con cisteína) y DMEM puede ser utilizado como los medios de entrega. L-15 contiene el aminoácido cisteína reducir pero presumab cisteínaly se oxida en los medios para formar la cistina (DMEM se formula con cistina). por lo tanto, dfTAT permanece intacto en estos medios y la entrega trabaja en la misma eficacia que la obtenida con nrL15. </li><li> Se incuban las células con dfTAT (5 M) con o sin carga (por ejemplo., EGFP (10 mM)) y mantener a 37 ° C durante 1 h (tiempo de incubación puede ser reducida pero dfTAT típicamente requiere aproximadamente 30 a 45 min para inducir la fuga de endosomal ). </li><li> Lavar las células con heparina (1 mg / ml) en L-15 (se recomiendan 3 lavados) para eliminar dfTAT unido a la membrana plasmática de las células. </li><li> Se incuban las células con tinción nuclear impermeable a las células, por ejemplo., Sytox Azul, Sytox Green (2 M en NRL-15), para determinar si la membrana plasmática de las células se ve comprometida (células muertas se tiñeron mientras que las células vivas no) de acuerdo con protocolo del fabricante. </li><li> Celdas de imagen utilizando un microscopio de fluorescencia (inmersión en aceite 100X u objetivo 20X). Imagen dfTAT utilizando un filtro de RFP (Ex =560 ± 20 nm / Em = 630 ± 35 nm). Nota: la entrega exitosa conduce a una fluorescencia difusa de dfTAT toda la célula (la evaluación de la entrega de proteína o péptido de interés dependerá de la aplicación). La tinción de nucleolos por fTAT (el producto reducido de dfTAT a la entrada citosólica) se puede utilizar como una indicación de que la fluorescencia detectada es intracelular. fTAT degradará dentro de pocas horas. En este punto, la fluorescencia de los fragmentos de degradación aparecerá como puntiforme. Esto no se debe confundir la distribución puntiforme que también se ve si dfTAT permanece sin éxito atrapado dentro de endosomas (esto puede suceder si dfTAT está presente en muy baja de una concentración). </li></ol> 5. Controling Concentración de MOI Entregado <ol><li> Identificar la concentración &quot;entrega óptima&quot; necesario para lograr eficientes liberación citosólica de dfTAT en el tipo celular utilizado. Realizar microscopía de fluorescencia en células incubadas con increasinconcentraciones g de dfTAT. La concentración óptima dfTAT se define como la concentración mínima que conduce a despejar citosólica &quot;difundir&quot; TMR de fluorescencia en aproximadamente 100% de las células en un cultivo. </li><li> Vary la concentración de MOI utilizada en el protocolo de co-incubación mientras se mantiene la concentración de dfTAT constante (por ejemplo, utilizando la concentración de la entrega óptima de dfTAT). Cambiar el tiempo de incubación a menos de 1 hr también podría ser una opción para variar la cantidad de MOI entregado. </li></ol>

<ol>
	<li>Didenko, V. V., Ngo, H., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine+as+a+transmembrane+carrier+of+fluorescently+labeled+proteins+and+antibodies.">Polyethyleneimine as a transmembrane carrier of fluorescently labeled proteins and antibodies.</a> Anal Biochem. 344, 168-173 (2005).</li><li>Takeuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+Rapid+Cytosolic+Delivery+Using+Cell-Penetrating+Peptides+Mediated+by+Pyrenebutyrate.">Direct and Rapid Cytosolic Delivery Using Cell-Penetrating Peptides Mediated by Pyrenebutyrate.</a> ACS Chem Biol. 1, 299-303 (2006).</li><li>Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peptide+carrier+for+the+delivery+of+biologically+active+proteins+into+mammalian+cells.">A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells.</a> Nat Biotech. 19, 1173-1176 (2001).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+somatic+cells+via+TAT-mediated+protein+transduction+of+recombinant+factors.">Reprogramming of somatic cells via TAT-mediated protein transduction of recombinant factors.</a> Biomaterials. 33, 5047-5055 (2012).</li><li>Torchilin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+delivery+of+protein+and+peptide+therapeutics.">Intracellular delivery of protein and peptide therapeutics.</a> Drug Discov Today: Technol. 5, e95-e103 (2005).</li><li>Chakravarty, P., Qian, W., El-Sayed, M. A., Prausnitz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+molecules+into+cells+using+carbon+nanoparticles+activated+by+femtosecond+laser+pulses.">Delivery of molecules into cells using carbon nanoparticles activated by femtosecond laser pulses.</a> Nature nanotechnol. 5, 607-611 (2010).</li><li>Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+delivery+using+engineered+virus-like+particles.">Protein delivery using engineered virus-like particles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 16998-17003 (2011).</li><li>Pan, C., Lu, B., Chen, H., Bishop, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+human+fibroblasts+using+HIV-1+TAT+recombinant+proteins+OCT4,+SOX2,+KLF4+and+c-MYC.">Reprogramming human fibroblasts using HIV-1 TAT recombinant proteins OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC.</a> Mol Biol Rep. 37, 2117-2124 (2010).</li><li>Fittipaldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Membrane+Lipid+Rafts+Mediate+Caveolar+Endocytosis+of+HIV-1+Tat+Fusion+Proteins.">Cell Membrane Lipid Rafts Mediate Caveolar Endocytosis of HIV-1 Tat Fusion Proteins.</a> J Biol Chem. 278, 34141-34149 (2003).</li><li>Lee, Y. J., Erazo-Oliveras, A., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+macromolecules+into+live+cells+by+simple+co-incubation+with+a+peptide.">Delivery of macromolecules into live cells by simple co-incubation with a peptide.</a> Chembiochem. 11, 325-330 (2010).</li><li>Angeles-Boza, A. M., Erazo-Oliveras, A., Lee, Y. J., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+endosomolytic+reagents+by+branching+of+cell-penetrating+peptides:+tools+for+the+delivery+of+bioactive+compounds+to+live+cells+in+cis+or+trans.">Generation of endosomolytic reagents by branching of cell-penetrating peptides: tools for the delivery of bioactive compounds to live cells in cis or trans.</a> Bioconjugate chem. 21, 2164-2167 (2010).</li><li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O.">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3185-3190 (2001).</li><li>Erazo-Oliveras, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+delivery+into+live+cells+by+incubation+with+an+endosomolytic+agent.">Protein delivery into live cells by incubation with an endosomolytic agent.</a> Nat methods. 11, 861-867 (2014).</li><li>Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+test+for+detection+of+free+terminal+amino+groups+in+the+solid-phase+synthesis+of+peptides.">Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides.</a> Anal Biochem. 34, 595-598 (1970).</li><li>Muthukrishnan, N., Johnson, G. A., Lim, J., Simanek, E. E., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAT-mediated+photochemical+internalization+results+in+cell+killing+by+causing+the+release+of+calcium+into+the+cytosol+of+cells.">TAT-mediated photochemical internalization results in cell killing by causing the release of calcium into the cytosol of cells.</a> Biochim biophys acta. 1820, 1734-1743 (2012).</li><li>Lautwein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+B+lymphoblastoid+cells+contain+distinct+patterns+of+cathepsin+activity+in+endocytic+compartments+and+regulate+MHC+class+II+transport+in+a+cathepsin+S-independent+manner.">Human B lymphoblastoid cells contain distinct patterns of cathepsin activity in endocytic compartments and regulate MHC class II transport in a cathepsin S-independent manner.</a> J Leukoc Biol. 75, 844-855 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Las células utilizadas para la entrega dfTAT no debe ser demasiado confluentes (&gt; 90% de confluencia), ya que esto podría afectar a la eficiencia en la entrega. Las células también deben ser saludables: las células muertas en el cultivo pueden liberar fragmentos apoptóticos con la que dfTAT puede interactuar (por ejemplo, el ADN de núcleos degradados). Esto a su vez puede interferir con la eficacia del suministro y la calidad de la imagen. Las células se deben lavar a fondo para eliminar FBS antes de...

La entrega de proteínas, péptidos o pequeñas moléculas impermeables a las células en células vivas es a menudo deseable en muchas aplicaciones biológicas o biotecnológicas (de imagen celular, ensayos funcionales, la reprogramación celular, etc.) A 1-4. Ya se han reportado muchos enfoques de entrega, incluyendo la microinyección, electroporación, o el uso de agentes de portador (por ejemplo., Péptidos penetran en las células, tales como TAT, lípidos) 5-7. Cada técnica tiene normalmente ventajas y desventajas específicas que podrían hacer que estos enfoques adecuados para ciertas aplicaciones, pero no para otros. Problemas comunes incluyen la eficiencia de entrega de pobres y / o la falta de control de la cantidad de material que se entrega 8,9, toxicidad o efectos fisiológicos deletéreos 10,11, la falta de control temporal, entrega en pocas células, pero no en toda una población (por ejemplo., microinyección) 12, y la conjugación química compleja o de formulación de planes de 11. s = &quot;jove_content&quot;&gt; Recientemente, hemos desarrollado una estrategia de entrega novela que evita estas limitaciones. Esta estrategia se basa en un péptido llamado dfTAT (dímero TAT fluorescente) 13. dfTAT se deriva a partir del péptido de penetración celular bien conocido (CPP) TAT. dfTAT contiene dos copias disulfuro unido de TAT etiquetados con el tetrametilrodamina fluoróforo. A pesar de sus similitudes, TAT y dfTAT difieren significativamente en la actividad. TAT típicamente se internaliza en las células por endocitosis. Sin embargo, esto CPP permanece atrapado en su mayoría dentro de los endosomas (esto por lo general conduce a una distribución puntiforme del péptido dentro de las células cuando se examina por microscopía de fluorescencia). Como TAT, dfTAT se endocitosis eficientemente por las células. Sin embargo, dfTAT no se queda atrapado dentro de endosomas. En su lugar, media la fuga de endosomal de una manera que es extremadamente eficiente. La actividad endosomolítica de dfTAT puede entonces ser explotado para entregar macromoléculas mediante un ensayo de incubación simple. ntent &quot;&gt; La comprensión actual del proceso de entrega es como sigue. dfTAT induce macropinocytosis. Como resultado, las células incubadas con dfTAT ocupan proteínas solubles, péptidos, o pequeñas moléculas (moléculas de interés, MOI) presentes en los medios de comunicación por el fluido de fase endocitosis (ver Figura 1). Las interacciones entre dfTAT y MOI no son necesarios, siempre y cuando tanto el tráfico entidades juntos dentro de la vía endocítica. Como dfTAT alcanza un cierto umbral dentro de la luz de los orgánulos endocíticas, expresa su actividad fuga de endosomal (los detalles moleculares siendo para ser totalmente caracterizado). El contenido del lumen de los orgánulos que gotean, y por lo tanto la MOI, se libera en las células. Por tanto, este enfoque es muy conveniente, ya que no se requieren de conjugación o formulación esquemas con MOI. Además, debido a dfTAT es no modificar directamente una MOI, también no debe interferir con la función de las MOI una vez que se consigue el suministro intracelular. Además, la concentración dedfTAT utiliza entrega es independiente de la de MOI en medios de comunicación. Por ejemplo, la concentración dfTAT puede mantenerse constante entre los diferentes experimentos para garantizar la eficiencia reproducibles en fugas endosomal. En contraste, la concentración de MOI en los medios se puede cambiar gradualmente para lograr los niveles deseados de MOI entregado en el citosol. La alta eficacia de fuga endosomal logrado con dfTAT es notablemente inocuos para muchas de las células ensayadas hasta la fecha. Esto es una sorpresa porque orgánulos endocíticas son componente importante de las células y uno esperaría que la fuga dramática mediada por dfTAT iría acompañado de las respuestas celulares deletéreos. Sin embargo, las células tratadas proliferan a la misma velocidad que las células no tratadas y no muestran cambios significativos en su transcriptoma. Por otra parte, la entrega se puede repetir dentro de minutos con eficiencias de entrega reproducibles, lo que indica que las células pueden o bien tolerar o recuperarse de el proceso de entrega sin perdersu capacidad para la endocitosis o fugas endosomal. Respuestas celulares sutiles pueden tener lugar durante el parto dfTAT y los detalles moleculares de lo que podrían ser permanecen estas respuestas para ser explorado. Sin embargo, mediante la combinación de alta eficiencia, conveniencia de protocolos, y la falta de toxicidad, este enfoque entrega debe demostrar inmediatamente útil en muchas aplicaciones basadas en células. Los protocolos presentados en este documento están dirigidas a hacer esta tecnología al alcance de la comunidad científica.

<table><tbody><tr><td>Heparin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>CAS 9041-08-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Blue</td><td>Invitrogen</td><td>S11348</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Invitrogen</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>nrL15 L-15 (&amp;ndash;) cysteine</td><td>Hyclone</td><td></td><td>Special order</td></tr><tr><td>Fmoc-protected Amino acids</td><td>Novabiochem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dfTAT</td><td></td><td></td><td>Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu)</td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted epifluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td>model IXB1</td><td>equipped with a heating stage maintained at 37 &amp;deg;C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C humidified, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

delivery of proteins, peptides or cell-impermeable small molecules into live cells by incubation with the endosomolytic reagent dftat

Estrategias de prestación macromoleculares normalmente utilizan la vía endocítica como una vía de entrada celular. Sin embargo, el atrapamiento endosomal limita severamente la eficiencia con la que las macromoléculas penetrar en el espacio citosólico de células. Recientemente, hemos eludido este problema mediante la identificación del reactivo dfTAT, un dímero enlace disulfuro del péptido TAT etiquetado con la tetrametilrodamina fluoróforo. Hemos generado un dímero marcado con fluorescencia del péptido de penetración celular (CPP) TAT prototípico, dfTAT, que penetra en las células vivas y alcanza el espacio citosólico de células con una eficiencia particularmente alta. La entrega citosólica de dfTAT se logra en varias líneas celulares, incluyendo células primarias. Por otra parte, la entrega no afecta notablemente la viabilidad celular, la proliferación o la expresión génica. dfTAT puede entregar moléculas pequeñas, péptidos, anticuerpos, enzimas biológicamente activa y un factor de transcripción. En este informe se describen los protocolos involucrados en DFTASíntesis de T y la entrega celular. El manuscrito describe cómo controlar la cantidad de proteína entregada al espacio citosólico de las células mediante la variación de la cantidad de proteína administrada extracelularmente. Finalmente, se discuten las limitaciones actuales de esta nueva tecnología y pasos involucrados en la validación de la entrega. Los protocolos descritos deben ser extremadamente útil para ensayos basados ​​en células, así como para la manipulación ex vivo y la reprogramación de las células.

Para evaluar la diferencia entre fTAT y dfTAT, células HeLa se incuban durante 1 h con cada péptido para determinar la diferencia en su localización celular. La internalización de los dos CPP de se evaluó mediante microscopía de fluorescencia. Figura 2 muestra que fTAT (20 mM) se localiza en una distribución punteada. Esta distribución es coherente con el péptido restante atrapado dentro de los endosomas. Por el contrario, la señal de fluorescencia de dfTAT (5 M) muestra una distribución homo...

Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT at JoVE.com

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

La entrega de proteínas, péptidos o impermeable a las células pequeñas moléculas en células vivas por incubación con el reactivo endosomolítico dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

delivery-proteins-peptides-or-cell-impermeable-small-molecules-into

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K vistas.  Texas A&M University. We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky. 

Video: Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Physical interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane protein complexes and in dynamic processes such as transmembrane (TM) signaling and regulation of cell-surface protein levels. Understanding the structural features driving the association of particular sequences requires sophisticated biophysical and biochemical analyses of TM peptide complexes. However, the extreme hydrophobicity of TM domains makes them very difficult to manipulate using standard peptide chemistry techniques, and production of suitable study material often proves prohibitively challenging. Identifying conditions under which peptides can adopt stable helical conformations and form complexes spontaneously adds a further level of difficulty. Here we present a procedure for the production of homo- or hetero-dimeric TM peptide complexes from materials that are expressed in E. coli, thus allowing incorporation of stable isotope labels for nuclear magnetic resonance (NMR) or non-natural amino acids for other applications relatively inexpensively. The key innovation in this method is that TM complexes are produced and purified as covalently associated (disulfide-crosslinked) assemblies that can form stable, stoichiometric and homogeneous structures when reconstituted into detergent, lipid or other membrane-mimetic materials. We also present carefully optimized procedures for expression and purification that are equally applicable whether producing single TM domains or crosslinked complexes and provide advice for adapting these methods to new TM sequences.

Biophysical and biochemical studies of interactions among membrane-embedded protein domains face many technical challenges, the first of which is obtaining appropriate study material. This article describes a protocol for producing and purifying disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes that are suitable for structural analysis by solution nuclear magnetic resonance (NMR) and other analytical applications.

La producción de disulfuro estabilizados complejos transmembrana de péptidos de Estudios Estructurales

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Investigación

Química

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

Exprimir la célula como un robusto, Microfluidic intracelular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Bioingeniería

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum (ER) resident proteins implicated in homotypic fusion of the ER. We detail here a method for purifying a glutathione S-transferase (GST) and poly-histidine tagged Drosophila atlastin by two rounds of affinity chromatography. Studying fusion reactions in vitro requires purified fusion proteins to be inserted into a lipid bilayer. Liposomes are ideal model membranes, as lipid composition and size may be adjusted. To this end, we describe a reconstitution method by detergent removal for Drosophila atlastin into preformed liposomes. While several reconstitution methods are available, reconstitution by detergent removal has several advantages that make it suitable for atlastins and other similar proteins. The advantage of this method includes a high reconstitution yield and correct orientation of the reconstituted protein. This method can be extended to other membrane proteins and for other applications that require proteoliposomes. Additionally, we describe a FRET based lipid mixing assay of proteoliposomes used as a measurement of membrane fusion.

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Biological membrane fusion is catalyzed by specialized fusion proteins. Measuring the fusogenic properties of proteins can be achieved by lipid mixing assays. We present a method for purifying recombinant Drosophila atlastin, a protein that mediates homotypic fusion of the ER, reconstituting it to preformed liposomes, and testing for fusion capacity.

Reconstitución asistida por detergente de Drosophila Atlastin recombinante en liposomas para ensayos de mezcla de lípidos

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Bioquímica

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. This information is particularly valuable in the context of host-pathogen interactions. Many pathogen proteins function within host cells in a variety of way such as, enabling evasion of the host immune system and survival within the intracellular environment. To study these pathogen-protein host-cell interactions, several approaches are commonly used, including: in vivo infection with a strain expressing a tagged or mutant protein, or introduction of pathogen genes via transfection or transduction. Each of these approaches has advantages and disadvantages. We sought a means to directly introduce exogenous proteins into cells. Electroporation is commonly used to introduce nucleic acids into cells, but has been more rarely applied to proteins although the biophysical basis is exactly the same. A standard electroporator was used to introduce affinity-tagged bacterial effectors into mammalian cells. Human epithelial and mouse macrophage cells were cultured by traditional methods, detached, and placed in 0.4 cm gap electroporation cuvettes with an exogenous bacterial pathogen protein of interest (e.g. Salmonella Typhimurium GtgE). After electroporation (0.3 kV) and a short (4 hr) recovery period, intracellular protein was verified by fluorescently labeling the protein via its affinity tag and examining spatial and temporal distribution by confocal microscopy. The electroporated protein was also shown to be functional inside the cell and capable of correct subcellular trafficking and protein-protein interaction. While the exogenous proteins tended to accumulate on the surface of the cells, the electroporated samples had large increases in intracellular effector concentration relative to incubation alone. The protocol is simple and fast enough to be done in a parallel fashion, allowing for high-throughput characterization of pathogen proteins in host cells including subcellular targeting and function of virulence proteins.

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

La electroporación de efectores bacterianos funcionales en células de mamífero

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Inmunología e Infección

Engineering Cell-permeable Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can make use of the translocating ability of so-called cell penetrating peptides (CPPs), also designated as protein transduction domains (PTDs). The TAT-CPP derived from the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Tat (trans-activator of transcription) protein has been widely used. The positively charged TAT promotes cell permeability thereby overcoming the barriers of the cellular membrane by endocytosis or/and direct membrane penetration2. In combination with a nuclear localization signal (NLS) fusion proteins are able to enter the nucleus exhibiting functionality. Our video presentation demonstrates, as an exemplification for the engineering of cell-permeable proteins, the construction, production and application of a cell-permeable version of the DNA-modifying enzyme Cre.
Cre is a site-specific recombinase that is able to recognize and recombine 34 base pair loxP sites in mammalian cells in vitro and in vivo. Therefore the Cre/loxP system is widely used to conditionally induce mutations in the genome of living cells3,4. The delivery of active Cre recombinase to cells, however, represents a limitation.
We describe the pSESAME vector system, which allows a direct insertion of the gene-of-interest and provides a platform to rapidly clone different domains and tags used within the vector in a convenient and standardized manner. Rearranging of the different tags has been shown to modify the biochemical properties of the fusion proteins providing a possibility to achieve higher yield and better solubility. We demonstrate how to express and purify recombinant cell-permeant proteins in and from E. coli. The functionality of the recombinant Cre protein is finally validated in cell culture by assessing its intracellular recombinase activity.

Protein transduction enables the direct delivery of biologically active proteins into cells. In contrast to conventional methods such as DNA transfection or viral transduction this non-invasive paradigm allows highly efficient cellular manipulation in a titratable manner circumventing cellular toxicity and the risk of oncogenic transformation by permanent genetic modification.

Ingeniería penetran en las células de proteínas

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can ...

Biología

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1. Many of these are referred to as cell-penetrating peptides, which are frequently noted for their potential as drug delivery vectors1-3. Moreover, there is increasing interest in antimicrobial peptides that operate via non-membrane lytic mechanisms4,5, particularly those that cross bacterial membranes without causing cell lysis and kill cells by interfering with intracellular processes6,7. In fact, authors have increasingly pointed out the relationship between cell-penetrating and antimicrobial peptides1,8. A firm understanding of the process of membrane translocation and the relationship between peptide structure and its ability to translocate requires effective, reproducible assays for translocation. Several groups have proposed methods to measure translocation into large unilamellar lipid vesicles (LUVs)9-13. LUVs serve as useful models for bacterial and eukaryotic cell membranes and are frequently used in peptide fluorescent studies14,15. Here, we describe our application of the method first developed by Matsuzaki and co-workers to consider antimicrobial peptides, such as magainin and buforin II16,17. In addition to providing our protocol for this method, we also present a straightforward approach to data analysis that quantifies translocation ability using this assay. The advantages of this translocation assay compared to others are that it has the potential to provide information about the rate of membrane translocation and does not require the addition of a fluorescent label, which can alter peptide properties18, to tryptophan-containing peptides. Briefly, translocation ability into lipid vesicles is measured as a function of the Foster Resonance Energy Transfer (FRET) between native tryptophan residues and dansyl phosphatidylethanolamine when proteins are associated with the external LUV membrane (Figure 1). Cell-penetrating peptides are cleaved as they encounter uninhibited trypsin encapsulated with the LUVs, leading to disassociation from the LUV membrane and a drop in FRET signal. The drop in FRET signal observed for a translocating peptide is significantly greater than that observed for the same peptide when the LUVs contain both trypsin and trypsin inhibitor, or when a peptide that does not spontaneously cross lipid membranes is exposed to trypsin-containing LUVs. This change in fluorescence provides a direct quantification of peptide translocation over time.

This protocol details a method for the quantitative measure of peptide translocation into large unilamellar lipid vesicles. This method also provides information about the rate of membrane translocation and can be used to identify peptides that efficiently and spontaneously cross lipid bilayers.

La translocación de péptidos en la medición de grandes vesículas unilamelares

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

Proteína entrega directa de células de mamíferos Utilización de Células permeable Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -Su<sub&gt; 2</sub&gt; Dominios de zinc-finger

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated exocytosis is fundamental for intercellular communication and is a key mechanism for the secretion of neurotransmitters, hormones, inflammatory mediators, and other compounds, by a variety of cells. At least three distinct mechanisms are known for regulated exocytosis: full exocytosis, where a single SG fully fuses with the plasma membrane, kiss-and-run exocytosis, where a single SG transiently fuses with the plasma membrane, and compound exocytosis, where several SGs fuse with each other, prior to or after SG fusion with the plasma membrane. The type of regulated exocytosis undertaken by a cell is often dictated by the type of secretory trigger. However, in many cells, a single secretory trigger can activate multiple modes of regulated exocytosis simultaneously. Despite their abundance and importance across cell types and species, the mechanisms that determine the different modes of secretion are largely unresolved. One of the main challenges in investigating the different modes of regulated exocytosis, is the difficulty in distinguishing between them as well as exploring them separately. Here we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran as an exocytosis reporter, and live cell imaging, to differentiate between the different pathways of regulated exocytosis, focusing on compound exocytosis, based on the robustness and duration of the exocytic events.

Here we detail a method for live cell imaging of regulated exocytosis. This method utilizes FITC-dextran, which accumulates in lysosome-related organelles, as a reporter. This simple method also allows distinguishing between different modes of regulated exocytosis in cells that are difficult to manipulate genetically.

Proyección de imagen de FITC-dextrano como reportero para exocitosis regulada

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...

Bead Loading Proteins and Nucleic Acids into Adherent Human Cells

Many live-cell imaging experiments use exogenous particles (e.g., peptides, antibodies, beads) to label or function within cells. However, introducing proteins into a cell across its membrane is difficult. The limited selection of current methods struggles with low efficiency, requires expensive and technically demanding equipment, or functions within narrow parameters. Here, we describe a relatively simple and cost-effective technique for loading DNA, RNA, and proteins into live human cells. Bead loading induces a temporary mechanical disruption to the cell membrane, allowing macromolecules to enter adherent, live mammalian cells. At less than 0.01 USD per experiment, bead loading is the least expensive cell loading method available. Moreover, bead loading does not substantially stress cells or impact their viability or proliferation. This manuscript describes the steps of the bead loading procedure, adaptations, variations, and technical limitations. This methodology is especially suited for live-cell imaging but provides a practical solution for other applications requiring the introduction of proteins, beads, RNA, or plasmids into living, adherent mammalian cells.

Bead loading introduces proteins, plasmids, and particles into adherent mammalian cells. This cell loading technique is inexpensive, rapid, and does not substantially affect cell health. It is best suited for live-cell imaging.

Perlas cargando proteínas y ácidos nucleicos en células humanas adherentes

Many live-cell imaging experiments use exogenous particles (e.g., peptides, antibodies, beads) to label or function within cells. However, introducing ...

Live Fluorescence, Inverse Imaging of Cell Ruffling, and Macropinocytosis

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase nutrients and other material in cells. The dramatic extension of cell surface ruffles, their closure to form macropinosomes, and the maturation of internalized macropinosomes are key events in this pathway that can be difficult to capture using conventional confocal imaging based on tracking a bolus of fluorescent cargo. Fluorescent dextrans are commonly used experimentally as fluid phase markers for macropinosomes and for other endocytic pathways. A method the lab has adopted to optimize the imaging of dextran uptake involves using live imaging of cells bathed in high concentrations of fluorescent dextran in the medium, with the unlabeled cells appearing in relief (as black). The cell ruffles are highlighted to visualize ruffle closure, and internalized macropinosomes appear as fluorescent vacuoles in the cell interior. This method is optimal for visualizing macropinosome features and allows for easy segmentation and quantification. This paper describes dual-labeling of pathways with different sized dextrans and the co-expression of lipid probes and fluorescent membrane proteins to demark macropinosomes and other endosomes. The detection of internalized dextran at an ultrastructural level using correlative light and electron microscopy (CLEM) is also demonstrated. These cell processes can be imaged using multiple live imaging modalities, including in 3D. Taken together, these approaches optimize macropinosome imaging for many different settings and experimental systems.

<meta charset="utf8"></head><body>Fluorescencia en vivo, imágenes inversas de agitación celular y macropinocitosis

This protocol demonstrates dextran imaging in live cells using continuous uptake and inverse images to optimize visualization of ruffling, macropinosome maturation, and analysis of dextran and other cell labelings.

Fluorescencia en vivo, imágenes inversas de agitación celular y macropinocitosis

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase ...