This article was supported by Award Number R01GM087227 from the National Institute of General Medical Sciences, the Norman Ackerman Advanced Research Program, and the Robert A. Welch foundation (Grant A-1769).

1. SPPS: CK (TMR) TATG (fTAT) Síntese Nota: dfTAT é produzida em duas etapas: a síntese do monómero fTAT por síntese de péptidos em fase sólida, seguido por dimerização de dissulfureto para formar dfTAT ligação. <ol><li> Ondas 500 mg de resina MBHA-Amida Rink em dimetilformamida (DMF) em 50 ml de uma embarcação SPPS padrão durante 1 h. </li><li> Realizar Fmoc desprotecção através da incubação da resina protegido com Fmoc numa solução de piperidina a 20% (20% de piperidina em DMF, 10 ml (0,30 mmol). Levar a cabo passos de desprotecção duas vezes (1 x 5 minutos e 1 x 15 min), com um passo de lavagem utilizando DMF (o passo de lavagem inclui a lavagem da resina várias vezes com um volume total de aproximadamente 150 ml de DMF e a remoção do solvente por filtração sob vácuo) em entre reacções. </li><li> Sintetizar CK (TMR) RKKRRQRRRG (fTAT) na resina MBHA rink amida. Usar o seguinte aminoácidos protegidos com Fmoc: Fmoc-Lys (Mtt) -OH (apenas no terminal N), Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc- Gln (Trt) -OH, Fmoc-Cys e (Trt) -OH. Efectua-se a reacção utilizando N 2 (20 psi) a agitar a reacção. Executar todas as reacções no RT. <ol><li> Levar a cabo cada uma das reacções de acoplamento de aminoácidos, durante 4 h. Para cada acoplamento, utilizar o aminoácido protegido com Fmoc (1,2 mmol), N, N, N &#39;, N&#39; -Tetramethyl- O- (1H-benzotriazol-1-il) urónio hexafluorofosfato (HBTU) (0,44 g, 1,1 mmol ), e diisopropiletilamina (DIEA) (0,51 ml, 3,0 mmol) dissolvido em DMF. A seguir ao acoplamento de 4 h, lavar a resina com DMF e realizar o passo de desprotecção de Fmoc como descrito no passo 1.2. </li><li> Repita até a cadeia peptídica linear de fTAT (cadeia peptídica linear: CKRKKRRQRRRG não TMR) foi sintetizado. </li><li> Em seguida, lave resina, cuidadosamente, com primeiro DMF e seguindo que com diclorometano (DCM). Lavar a resina várias vezes com um volume total de aproximadamente 150 ml de DMF ou DCM e remover o solvente por filtração sob vácuo. </li><li> VCSE MALDI-TOF para confirmar que o péptido obtido tem o peso molecular correcto. <ol><li> Adicione uma mistura matriz por adição de 1 mg de matriz a uma solução composta por 50 ul de TFA a 0,01% em solução de água e 50 ul de acetonitrilo. </li><li> Para confirmar massa cadeia de péptido linear, utilizar ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico. Executar uma HPLC analítica do péptido bruto e recolher 50 ul a partir do topo do pico puro. </li><li> Para preparar a amostra para a chapa na placa de MALDI: Adicionar 8 ul de péptido a 2 ul de solução de matriz e o lugar sobre a placa de MALDI para o ar seco ou numa coluna C de calor de placas 37 °. Nota: A arginina é conhecido por ser um ácido difícil par SPPS amino. Acoplamento bem sucedido é estabelecida através da realização de um teste de Kaiser 14 (por exemplo, teste, teste da ninidrina). Este ensaio permite a detecção de aminas livres que ainda possam estar desacoplado na resina. No caso de uma coloração azul detectado (indicativo da presença de aminas livres), de acoplamento sPTE são repetidos. </li></ol></li></ol></li><li> Para CK (-NH-TMR) TATG (fTAT), clivar o grupo protector para o grupo Mtt -amino de Lys na CK (-NH-MTT) TATG com uma solução composta por 1% de ácido trifluoroacético (TFA) e triisopropilsilano 2% (TIS) em DCM. <ol><li> Como a remoção do grupo protector de MTT iria resultar no aparecimento de uma cor amarela, incubar a resina com 20 ml da solução acima durante 5 min, repetir este processo até não se observar a cor amarela. Lava-se a resina com DCM e DMF no meio. Além disso, uma vez TIS é um necrófago que limpam o MTT, uma vez que nenhuma cor amarela aparece na solução na presença de MTT. </li><li> Adicionar uma solução adicional com 1% de TFA em DCM (sem TIS) à resina para assegurar que nenhum mais MTT é removido e a solução permanece límpida. </li></ol></li><li> Dissolver as três componentes: carboxitetrametilrodamina (TMR), HBTU, e DIEA (4, 3,9 e 10 equivalência em relação à quantidade de resina (em mg)) em DMF e adicione essa misturapara a resina e realizar a reacção de O / N usando N2 seco para proporcionar agitação. </li><li> Após desprotecção de Fmoc-aminoácido e de conjugação, lavar a resina com DCM e deixar secar. Por clivagem completa do péptido da resina, adicionar uma solução contendo 92,5% de TFA, 2,5% de H2O, 2,5%, TIS, e 2,5% de etanoditiol (EDT) (volume total = 4 ml) para a peptidil-resina durante 3 horas à temperatura ambiente para alcançar a desprotecção global e a clivagem a partir da resina. <ol><li> Precipitar o produto peptídeo bruto usando éter etílico anidro frio (Et2O) por drenagem da solução a partir do passo 1.6 em 40 mL de Et2O, esta rodada para baixo a 4 ° C e 4000 g durante 20 - 25 min. Repetir esta etapa para permitir a lavagem do precipitado com anidro frio Et2O </li><li> Ressuspender os precipitados em água (5 ml ou até precipitado é completamente dissolvido) e liofilizar. Em seguida ressuspender os produtos obtidos em 0,1% de TFA aquoso / acetonitrilo. </li></ol></li> &lt;li&gt; Realizar a análise por HPLC com uma coluna analítica C18 (5 uM, 4 x 150 mm) para analisar cada péptido. Usar uma taxa de fluxo de 1 mL / min, e detecção a 214 nm e 550 nm. </li><li> Realizar HPLC semi-preparativa numa coluna C18 de 10 x 250 mm para a purificação de péptidos. Utilize uma taxa de fluxo de 4 ml / min, e detecção a 214 nm e 550 nm. Para todas as corridas, utilizar gradientes lineares de 0,1% de TFA aquoso (solvente A) e 90% de acetonitrilo, 9,9% de água, e 0,1% de TFA (solvente B). </li><li> Confirmar a identidade correta dos peptídeos por MALDI-TOF de acordo com o protocolo do fabricante: fTAT, massa esperada: 2,041.17, massa observada: 2.040,66. DEAC-K9, massa esperada: 1,412.97, observou massa: 1,415.59. Usar uma matriz α- ácido ciano-4-hidroxicinâmico para a MALDI-TOF. </li></ol> 2. reacção de oxidação: Geração dfTAT <ol><li> Arejar salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4, durante 1 hora (a menos de 5 ml para a reacção abaixo). </li><li> Dissolver fTAT (0,3 mg, 1,5 x 10 -4 mmol) em aerATED PBS pH 7,4 (5 ml). Certifique-se de que o pH é entre 7,0 - 7,5, após a adição do péptido. Se não adiciona-se hidróxido de sódio (1 M, em incrementos pequenos 1 - 5 ul) para levar o pH para trás até 7,4. </li><li> Nota: O oxigénio dissolvido em PBS age para oxidar os grupos tiol em fTAT e formar uma ligação dissulfureto. </li><li> Nutar a reacção S / N para permitir que ele reaja até à conclusão (rendimento 100% com base na análise por HPLC). Purifica-se o produto usando HPLC de fase reversa e análise por espectrometria de massa (MALDI-TOF) tal como no passo 1.9. Massa esperada: 4,080.34, observou massa: 4,084.21. </li><li> Liofilizar puro dfTAT (0,71 x10 -4 mmol) e ressuspender em 200 mL de água (concentração pura dfTAT = 356,3 M). </li></ol> 3. Medindo dfTAT Concentração <ol><li> Ressuspender numa alíquota da dfTAT purificada (tipicamente 1 ul, dependendo da quantidade de péptido purificado) em 149 ul de uma solução 50 mM de TCEP. </li><li> Nota: Nesta etapa dfTAT é reduzido ao seu monomer homólogo fTAT para eliminar a absorção de têmpera que ocorre devido à proximidade do fluoróforo TMR em dfTAT (ε o coeficiente de extinção de TMR em dfTAT é reduzido em comparação com o ε da TMR em redução fTAT). </li><li> Deixar a amostra reagir durante aproximadamente 20 min (HPLC analítica pode ser usado para confirmar a formação de fTAT). </li><li> Adicionar toda a solução para a cuvete de quartzo e medir a absorvância a 556 nm. </li><li> Usando a lei de Beer (A = εcl: ε = 91.500 M-1 cm-1) para calcular a concentração de fTAT, determinar a concentração de dfTAT, e dividir [fTAT] por dois. </li></ol> 4. Experimentos administração celular <ol><li> Semente as células (HeLa, HDF, etc.) Em um prato de cada confluência de 80 - 90% (por exemplo, de 8 poços ou 24 poços prato). Cultivar células em um meio apropriado (por exemplo, DMEM suplementado com FBS a 10% e Pen / Strep) até 80 - 90% de confluência em uma temperatura de 37 ° Catmosfera humidificada contendo 5% de CO 2. </li><li> Lavam-se as células três vezes (3x) com PBS (através da adição de 200 ul de PBS e, em seguida, removendo-o três vezes). </li><li> Adicione uma concentração de trabalho de 5 uM dfTAT por diluição de um stock de dfTAT (em água) em NRL-15 media (por um prato 8 bem o volume total deve ser de 200 uL). Uma concentração de 5 uM dfTAT leva a entrega eficaz (nível elevado de entrega citosólico em mais de 90% das células presentes num prato) na maioria dos tipos celulares testados até à data (Figura 3). No entanto, concentrações mais altas ou mais baixas podem ser mais adequadas para os tipos de células com uma propensão elevada ou baixa para a penetração. NOTA sobre Media: NRL-15 é usado para a entrega de dfTAT uma vez que não contêm cisteína que poderia reduzir a ligação di-sulfito em dfTAT. No entanto, os nossos dados indicam que tanto normal G-15 (com cisteína) e DMEM podem ser utilizados como os meios de entrega. G-15 contém o aminoácido cisteína mas reduzindo presumab cisteínaly oxida na mídia para formar cistina (DMEM é formulado com cistina). Por conseguinte, permanece intacta dfTAT nestes meios de entrega e funciona com a mesma eficiência que o obtido com nrL15. </li><li> Incubar as células com dfTAT (5 ^ M) com ou sem carga (por exemplo., EGFP (10 uM)) e manter a 37 ° C durante 1 h (tempo de incubação pode ser reduzido, mas dfTAT tipicamente requer cerca de 30 a 45 min para induzir fuga de endossomal ). </li><li> Lavar as células com heparina (1 mg / ml) em L-15 (3 lavagens são recomendados) para remover dfTAT ligado à membrana plasmática das células. </li><li> Incubar as células com células-impermeável corante nuclear, por exemplo., Sytox azul, Sytox verde (2 uM em NRL-15), para determinar se a membrana do plasma de células está comprometida (células mortas serão coradas enquanto que as células vivas não vai) de acordo com a o protocolo do fabricante. </li><li> Células de imagem utilizando um microscópio de fluorescência (imersão em óleo de 100X ou objetiva 20X). DfTAT imagem utilizando um filtro de RFP (Ex =560 ± 20 nm / Em = 630 ± 35 nm). Nota: a entrega bem sucedida leva a uma fluorescência difusa dfTAT de toda a célula (avaliação da entrega da proteína ou do péptido de interesse vai depender da aplicação). A coloração dos nucléolos por fTAT (o produto reduzido a partir da entrada de dfTAT citosólica) pode ser utilizada como uma indicação de que a fluorescência é detectada intracelular. fTAT irá degradar dentro de poucas horas. Neste ponto, a fluorescência dos fragmentos de degradação aparece como ponteada. Isso não deve ser confundido com a distribuição pontuada que também é visto se dfTAT permanece sem sucesso preso dentro endosomes (isso pode acontecer se dfTAT está presente em muito baixo de uma concentração). </li></ol> 5. Controling Concentração de MOI Proferido <ol><li> Identificar a concentração de &quot;entrega ideal&quot; necessária para conseguir uma libertação eficaz do citosólica dfTAT no tipo de células utilizado. Realizar a microscopia de fluorescência de células incubadas com increasinconcentrações g de dfTAT. A concentração óptima dfTAT é definida como a concentração mínima que leva para limpar citosólica &quot;difusa&quot; TMR fluorescência em aproximadamente 100% das células em cultura. </li><li> Variar a concentração de MOI utilizado no protocolo de co-incubação, mantendo constante a concentração de dfTAT (por exemplo, usando entrega concentração óptima de dfTAT). Alterando o tempo de incubação para menos do que 1 hora pode também ser uma opção para variar a quantidade de MOI entregue. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

As células utilizadas para entrega dfTAT não deve ser excessivamente confluente (&gt; 90% de confluência) pois isso pode afetar a eficiência de entrega. As células devem também ser saudável: células mortas na cultura podem libertar fragmentos apoptóticos com as quais pode interagir dfTAT (por exemplo, ADN de núcleos degradados). Este por sua vez, pode interferir com a eficiência de entrega e a qualidade de imagem. As células devem ser lavadas cuidadosamente para remover FBS antes de adicionar dfTAT....

A administração de proteínas, péptidos ou pequenas moléculas celulares impermeável em células vivas é muitas vezes desejável em muitas aplicações biológicas ou biotecnológicos (imagiologia celular, ensaios funcionais, de reprogramação celular, etc.) 1-4. Muitas abordagens de entrega já foram relatados, incluindo microinjecção, electroporação, ou a utilização de agentes veiculares (por exemplo., Péptidos de penetração de células, tais como tat, lípidos) 5-7. Cada técnica tipicamente tem prós e contras específicos que podem fazer essas abordagens adequadas para certas aplicações, mas não para outros. Problemas comuns envolvem a eficiência de entrega pobres e / ou falta de controle de quanto material é fornecido 8,9, toxicidade ou impacto fisiológico deletério 10,11, a falta de controle temporal, entrega em algumas células, mas não em toda a população (por exemplo., microinjecção) 12, e complexo de conjugação química ou formulação esquemas 11. s = &quot;jove_content&quot;&gt; Recentemente, temos desenvolvido uma estratégia de entrega de romance que contorna essas limitações. Esta estratégia baseia-se em um peptídeo chamado dfTAT (dímero TAT fluorescente) 13. dfTAT é derivado a partir do bem conhecido péptido célula-penetrante (CPP) TAT. dfTAT contém duas cópias dissulfureto ligado de TAT marcado com o fluoróforo tetrametilrodamina. Apesar de suas semelhanças, TAT e dfTAT diferem significativamente em atividade. TAT é tipicamente internalizado nas células por endocitose. Este CPP permanece no entanto principalmente preso dentro endosomes (isto geralmente levam a uma distribuição pontuada do peptídeo no interior das células, quando examinado por microscopia de fluorescência). Como TAT, dfTAT é eficientemente endocitose pelas células. No entanto, dfTAT não fica preso dentro endosomes. Em vez disso, ela medeia endossomal vazamento de uma maneira que é extremamente eficiente. A actividade de dfTAT endosomolytic pode então ser explorada para entregar macromoléculas através de um ensaio de incubação simples. ntent &quot;&gt; O entendimento actual do processo de entrega é como se segue. dfTAT induz macropinocitose. Como resultado, as células incubadas com dfTAT tomar-se as proteínas solúveis, péptidos ou pequenas moléculas (moléculas de interesse, MOI) presentes nos meios de comunicação por fluido-fase endocitose (ver Figura 1). As interacções entre dfTAT e MOI não são necessários, desde que o tráfego de entidades, em conjunto dentro da via endocítica. Como dfTAT atinge um certo limite dentro do lúmen de organelos endocíticas, que expressa a sua actividade vazamento endossomal (os detalhes moleculares continuam a ser completamente caracterizados). O conteúdo do lúmen dos organelos gotejantes, e, por conseguinte, a MOI, é então libertado para dentro das células. Esta abordagem é, por conseguinte, muito conveniente como não há de conjugação ou formulação regimes com MOI são requeridas. Além disso, porque dfTAT é não modificar directamente uma MOI, que também não deve interferir com a função MOIs uma vez entrega intracelular é alcançada. Além disso, a concentração dedfTAT usados ​​entrega é independente da do MOI na mídia. Por exemplo, a concentração dfTAT pode ser mantida constante entre diferentes experiências para garantir a eficiência reprodutíveis no vazamento endossomal. Em contraste, a concentração de MOI em meios pode ser gradualmente mudada para atingir os níveis desejados de MOI entregue no citosol. A alta eficiência de fuga endossomal conseguido com dfTAT é notavelmente inócuo para muitas das células testados até à data. Esta é uma surpresa porque são organelos endocíticas componente importante das células e seria de esperar que o vazamento dramática mediada por dfTAT seria acompanhada por respostas celulares nocivos. No entanto, as células tratadas proliferam na mesma taxa como células não tratadas e não exibem qualquer alteração significativa no seu transcriptoma. Além disso, a entrega pode ser repetido dentro de minutos, com uma eficiência de entrega reprodutíveis, o que indica que as células podem tolerar ou recuperar do processo de entrega, sem perdera sua capacidade para a endocitose ou vazamento endossomal. Respostas celulares sutis, podem ocorrer durante o parto dfTAT e os detalhes moleculares de que essas respostas possam ser ainda precisam ser exploradas. No entanto, através da combinação de alta eficiência, conveniência de protocolos, e falta de toxicidade, esta abordagem de entrega deve provar imediatamente útil em muitas aplicações baseadas em células. Os protocolos aqui apresentadas visam tornar esta tecnologia acessível para a comunidade de pesquisa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Heparin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CAS 9041-08-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nrL15 L-15 (&#8211;) cysteine</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td></td>
			<td>Special order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-protected Amino acids</td>
			<td>Novabiochem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dfTAT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>model IXB1</td>
			<td>equipped with a heating stage maintained at 37 &#176;C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C humidified, 5% CO2 incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

delivery of proteins, peptides or cell-impermeable small molecules into live cells by incubation with the endosomolytic reagent dftat

Estratégias de entrega macromoleculares tipicamente utilizar a via endocítica como uma via de entrada celular. No entanto, endossomal aprisionamento limita severamente a eficiência com a qual macromoléculas penetrar no espaço citosólico de células. Recentemente, nós contornado este problema ao identificar o reagente dfTAT, um dímero de ligações dissulfureto da TAT péptido marcado com o fluoróforo tetrametilrodamina. Geramos um dímero marcado por fluorescência do péptido TAT prototípico de penetração celular (CPP), dfTAT, que penetra as células vivas e atinge o espaço citosólico de células em particular com uma alta eficiência. Entrega citosólica de dfTAT é conseguida em várias linhas de células, incluindo células primárias. Além disso, a entrega não tem impacto sobre a viabilidade das células visivelmente, a proliferação ou a expressão do gene. dfTAT pode entregar pequenas moléculas, péptidos, anticorpos, enzimas biologicamente activas e um factor de transcrição. Neste relatório, nós descrevemos os protocolos envolvidos na dfTAT síntese e administração celular. O manuscrito descreve como controlar a quantidade da proteína entregue ao espaço citosólico de células, variando a quantidade de proteína administrada extracelularmente. Finalmente, são discutidas as atuais limitações desta nova tecnologia e etapas envolvidas na validação de entrega. Os protocolos descritos devem ser extremamente útil para ensaios baseados em células bem como para a manipulação ex vivo e reprogramação das células.

Para avaliar a diferença entre fTAT e dfTAT, células HeLa são incubadas durante 1 hora com cada um dos péptidos para determinar a diferença na sua localização celular. A internalização dos dois CPP foi avaliada por meio de microscopia de fluorescência. A Figura 2 mostra que fTAT (20 uM) localiza em uma distribuição pontuada. Esta distribuição é consistente com o restante péptido retido no interior de endossomas. Em contraste, o sinal de fluorescência de dfTAT (5 uM) exibe uma distribui?...

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Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

Entrega de proteínas, peptídeos ou célula-impermeável Pequenas moléculas em células vivas por incubação com o Endosomolytic Reagente dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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