This article was supported by Award Number R01GM087227 from the National Institute of General Medical Sciences, the Norman Ackerman Advanced Research Program, and the Robert A. Welch foundation (Grant A-1769).

1. SPPS: CK (TMR) TATG (fTAT) sentezi Not: dfTAT iki aşamada üretilir: dfTAT oluşturmak için disülfid bağı dimerizasyonu, katı faz peptid sentezi ile, monomer fTAT sentezini. <ol><li> 1 saat süre ile standart bir 50 ml SPPS kabı içinde dimetilformamid (DMF) içinde Rink Amide MBHA reçinesinin 500 mg kabarma. </li><li> .% 20&#39;lik bir piperidin çözeltisi (DMF içinde% 20 piperidin, 10 ml (0.30 mmol) Fmoc korumalı reçine inkübe edilerek Fmoc korumasının kaldırılması gerçekleştir (1 x 5 dakika ve yıkama aşaması ile birlikte 1 x 15 dak) ile iki kez koruma kaldırma adımları tekrarlayın DMF (yıkama aşaması DMF, yaklaşık 150 ml&#39;lik bir toplam hacim reçineye birden çok kez durulama ve vakumla süzme ile çözücünün çıkarılması dahil olmak üzere) reaksiyonları arasında. </li><li> Alani amid MBHA reçinesi üzerinde CK (TMR) RKKRRQRRRG (fTAT) sentez. Kullanım Fmoc korumalı amino asitleri aşağıdaki gibidir: Fmoc-Lys (Mtt) -OH (sadece N terminaline), Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc- Gln (Trt) -OH, Fmoc-Cys ve (Trt) -OH. Reaksiyonu kışkırtmak N 2 (20 PSI) ile reaksiyonu yürütmek. Oda sıcaklığında bütün reaksiyonlar gerçekleştirin. <ol><li> 4 saat süre ile, her bir amino asit birleştirme reaksiyonunu yürütmek. Her bir bağlantı için, Fmoc korumalı amino asit (1.2 mmol), N, N, N &#39;, N&#39; tetrametilsiklopentadienil O- (1H-benzotriazol-1-il) üronyum hekzaflorofosfat (HBTU) (0.44 g, 1.1 mmol korumalı kullanımı DMF içinde çözülmüş), ve diizopropiletilamin (DIEA) (0.51 mi, 3.0 mmol) eklenmiştir. 4 saat Kenetleme yapıldıktan sonra DMF ile reçinenin yıkanması ve aşama 1.2&#39;de tarif edildiği gibi Fmoc korumasının kaldırılması adımı gerçekleştirmek. </li><li> (: CKRKKRRQRRRG no TMR Lineer peptid zinciri) sentezlendi fTAT doğrusal peptit zinciri kadar tekrarlayın. </li><li> Daha sonra iyice birinci DMF kullanılarak ve diklorometan (DCM) ile takip eden reçine yıkayın. DMF veya DCM, yaklaşık 150 ml&#39;lik bir toplam hacim reçineye birden çok kez yıkayın ve vakum süzme ile ayrılması için kullanılabilir. </li><li> Use MALDI-TOF Elde edilen peptid, doğru moleküler ağırlığa sahip olduğu teyit etmek için. <ol><li> Su çözeltisi içinde% 0.01 TFA, 50 ul asetonitril, 50 ul oluşan bir çözeltiye matris 1 mg ekleyerek bir matris karışımı yapın. </li><li> Lineer peptit zinciri kütlesi teyit etmek için, α-siyano-4-hidroksisinamik asit kullanın. Ham peptid analitik HPLC çalıştırın ve saf tepe üstünden 50 ul toplamak. </li><li> MALDI plaka plaka numunesinin hazırlanması için: Kuru veya 37 ° C ısıya plaka üzerinde yayınlamak için MALDI plaka üzerinde matris solüsyon ve yer 2 ul peptidin 8 ul ekleyin. Not: Arginin SPPS&#39;si çiftin zor olan bir amino asit olduğu bilinmektedir. Başarılı birleştirme Kaiser testi 14 (örneğin, ninhidrin testi) yapılarak oluşturulur. Bu test reçine Kuplajsız kalabilir serbest aminlerin tespiti için izin verir. Durumda, sabit bir mavi renk (serbest aminler varlığının göstergesidir) tespit edilir, birleştirme sTeps&#39;in tekrar edilir. </li></ol></li></ol></li><li> CK için (= NH-TMR) TATG (fTAT),% 1 trifluoroasetik asit (TFA) ve% 2 triizopropilsilan oluşan bir çözelti ile CK Lys-amino grubunda (-NH-Mtt) TATG Mtt koruma grubunun yanlması DCM (TBS). <ol><li> MTT koruma grubunun çıkarılması, sarı bir rengin ortaya çıkması ile sonuçlanabilir ki gibi, 5 dakika boyunca, yukarıda çözeltisi 20 ml reçine inkübe sarı renk elde edilinceye kadar, bu tekrarlayın. Arasında, DCM ve DMF reçine yıkanır. TIS MTT temizlemek olan bir çöpçü Ayrıca, çünkü bir kez sarı renkli MTT mevcudiyetinde çözelti içinde görüntülenir. </li><li> Daha MTT sağlamak için reçineye, DCM içinde% 1 TFA (herhangi bir TBS) ile ilave bir solüsyonu ilave çıkarılır ve çözelti, açık kalır. </li></ol></li><li> DMF (() mg reçine miktarına göre 4, 3.9 ve 10 denklik) Carboxytetramethylrhodamine (TMR), HBTU ve DIEA ve bu karışımı ekleyin: üç bileşeni çözülürreçine ve reaksiyon O yürütmek / N karıştırma sağlamak için kuru N 2 kullanarak. </li><li> Fmoc-korumasının giderilmesinden ve amino asit Konjügasyondan sonra DCM ile reçinenin yıkanması ve kurutun. Peptidin reçineden komple klevajından için, 92.5% TFA,% 2.5 ihtiva eden bir çözelti ilave H2O,% 2.5, TIS, ve 3 peptidil-reçineye% 2.5 etanditiol (EDT) (toplam hacim = 4 mi) oda sıcaklığında saat reçineden genel koruma açma ve klevajını elde etmek mümkündü. <ol><li> Et 2 O 40 ml adım 1.6 çözeltinin boşaltılması soğuk susuz etil eter (Et 2 O) kullanılarak ham peptid ürünü Çökelti, 4 ° C&#39;de, bu aşağı doğru döner ve 20 için 4000 xg - 25 dak. Soğuk susuz Et 2 O. ile çökelti yıkama izin vermek için bu adımı tekrarlayın </li><li> Su (5 ml ya da çökelti tamamen eriyene kadar) ve liyofilize çökeltilerin yeniden süspanse edin. Daha sonra% 0.1 sulu TFA / asetonitril içinde elde edilen ürünler yeniden süspanse edin. </li></ol></li> &lt;li&gt; analitik C18 kolonu (5 um, 4 x 150 mm) her peptid analiz HPLC analizi yapın. 214 nm ve 550 nm &#39;de bir akış 1 ml / dakika hızını ve algılama kullanın. </li><li> Peptit saflaştırılması için bir C18, 10 x 250 mm sütun üzerinde, yarı-preparatif HPLC gerçekleştirin. 214 nm ve 550 nm &#39;de bir akış 4 ml / dk&#39;lık bir oranı ve algılama kullanın. Tüm işlemler için,% 0.1 sulu TFA (solvent A) ve% 90 asetonitril,% 9.9 su ve% 0.1 TFA (solvent B) doğrusal gradyanlar kullanımı. </li><li> FTAT, beklenen kütle: 2,041.17, gözlemlenen kütle: 2040.66, üreticinin protokolüne uygun olarak MALDI-TOF ile peptidlerin, doğru kimliğini teyit edin. Kütle beklenen DEAC-K9: 1,415.59: 1,412.97, kütle görülmüştür. MALDI-TOF için α- siyano-4-hidroksisinamik asit matris kullanın. </li></ol> 2. Oksidasyon reaksiyonu: dfTAT Üretimi <ol><li> 1 saat (aşağıdaki reaksiyon için, en az 5 mi), fosfat tamponlu salin (PBS) pH 7.4 havalandırın. </li><li> AER bölgesindeki fTAT (0.3 mg, 1.5 x 10 -4 mmol) çözülürated PBS pH 7.4 (5 mi). Peptidin ilavesinden sonra 7.5 - pH 7.0 arasında olduğundan emin olun. Sodyum hidroksit ilave değilse (küçük artışlarla 1 M, 1-5 ul) geri 7.4 kadar pH değeri getirmek için. </li><li> Not: PBS içinde çözülmüş oksijen fTAT tiol grupları oksitleyerek, bir disülfid bağ oluşturmak üzere hareket eder. </li><li> Reaksiyon O Nutate / N tamamlanmadan (HPLC analizine göre% 100 verim) kadar reaksiyona girmesine izin vermek. Ters faz HPLC ile ürünün saflaştırmak ve adım 1.9 olarak kütle spektrometrisi (MALDI-TOF) ile analiz edilmiştir. Beklenen kütle: 4,084.21: 4,080.34, kütle görülmüştür. </li><li> 200 ul su içinde Lyophilize saf dfTAT (0.71 x 10 -4 mmol) ve tekrar süspansiyon (konsantrasyon saf dfTAT = 356,3 uM). </li></ol> 3. dfTAT Konsantrasyon ölçüm <ol><li> 50 mM TCEP solüsyon 149 ul saflaştırılmış dfTAT (saflaştırılmış peptid miktarına bağlı olarak, tipik olarak 1 ul), bir kısım yeniden süspanse edin. </li><li> Not: Bu adımda dfTAT kendi mo indirgenirnomer muadili fTAT nedeniyle dfTAT bölgesindeki TMR fluorofor yakın bir yerde (in dfTAT TMR ekstinksiyon katsayısı ε indirgenmiş fTAT bölgesindeki TMR nin s kıyasla azaltılır) oluşur absorbans su verme ortadan kaldırmak için. </li><li> Örnek yaklaşık 20 dakika boyunca reaksiyona girmesine izin verir (analitik HPLC fTAT oluşumu teyit etmek için kullanılabilir). </li><li> Kuvars küvetine tüm çözüm ekleyin ve 556 nm&#39;de absorbansı ölçün. </li><li> Beer Kanunu Kullanma (A = εcl: ε = 91500 M -1 cm -1), fTAT konsantrasyonunu hesaplamak dfTAT konsantrasyonunu belirlemek ve iki tarafından [fTAT] bölmek için. </li></ol> 4. Hücresel Gönderme Deneyler <ol><li> % 90 (örn 8-kuyu veya 24 kuyu çanak) - 80 konfluansa bir tabak hücreler (. HeLa, HDF, vs.) Tohum. Bir 37 ° C% 90 konfluent - uygun bir ortam içinde hücreler büyümek 80 kadar (örneğin, DMEM,% 10 FBS ve Pen / Strep ile takviye edilmiş)% 5 CO2 içeren nemlendirilmiş atmosfer. </li><li> (Üç kez çıkarılması daha sonra PBS içinde 200 ul ilave edilerek) hücreler üç kere PBS ile (3X) yıkayın. </li><li> (8 de toplam hacim 200 ul olmalıdır çanak için) NRL-15 ortamı (su içinde) dfTAT bir stok seyreltilmesiyle dfTAT bir 5 uM çalışma konsantrasyonu yapın. 5 uM dfTAT bir konsantrasyon olarak etkili taşınmasında, tarih (Şekil 3) test edilen pek çok hücre tipinde (bir tabak içinde bulunan hücrelerin% 90&#39;ından fazlası sitozolik teslimat yüksek düzeyde) neden olur. Bununla birlikte, daha düşük ya da daha yüksek konsantrasyonlarda nüfuz etmesi için yüksek ya da düşük eğilimi olan hücre türleri için daha uygun olabilir. MEDYA Not: dfTAT disülfid bağı azaltabilecek sistein içermediği NRL-15 dfTAT verilmesi için kullanılır. Ancak, veri hem normal L-15 (sistein ile) ve DMEM dağıtım ortamı olarak kullanılabileceğini göstermektedir. L-15 indirgeme amino asit sistein, ancak sistein presumab içerirly (DMEM sistin ile formüle edilmiştir) sistin oluşturulması için medya okside. dfTAT dolayısıyla bu ortam içinde bozulmadan kalır ve dağıtım nrL15 ile elde edilen ile aynı etkinlikte çalışır. </li><li> Ya da yük olmadan dfTAT (5 uM) (örn.,, EGFP (10 uM)) kuluçkaya bırakılır ve (kuluçkalama süresi azaltılabilir, ancak dfTAT tipik olarak endozomal sızıntı uyarılması için yaklaşık 30 ila 45 dakika gerektiren 1 saat süre ile 37 ° C &#39;de devam ). </li><li> (3 yıkama tavsiye edilir), hücrelerin plazma zarına bağlanmış dfTAT kaldırmak için L-15 heparin (1 mg / ml) ile hücrelerin yıkayın. </li><li> Uygun cep geçirmeyen Nükleer soya, kuluçkaya bırakılır, örneğin., Sytox Mavi, Sytox Yeşil (NRL, 15-2 uM), hücrelerin plazma zarı tehlikeye olup olmadığını belirlemek için (canlı hücreler olmaz ise ölü hücreler boyanmış olacaktır) Üreticinin protokolü. </li><li> Bir floresan mikroskop (100X immersiyon yağı veya 20X objektif) kullanarak görüntü hücreleri. Bir RFP filtre kullanarak Görüntü dfTAT (Ex =560 ± 20 nm / Em = 630 ± 35 nm). Not: başarılı dağıtım hücre boyunca dfTAT yayılmış bir floresan (uygulamaya bağlı olacaktır proteinin veya ilgili peptidin teslim değerlendirilmesi) yol açar. FTAT (sitosolik girişi üzerine dfTAT azaltılmış ürünü) ile nukleoli boyanması tespit floresans hücre içi olduğuna dair bir gösterge olarak kullanılabilir. fTAT birkaç saat içinde düşer. Bu noktada, parçalanma fragmanları floresan punktat olarak görünür. Bu dfTAT başarısız (dfTAT bir konsantrasyon çok düşük de varsa bu olur) endozomlardan içinde sıkışıp kalırsa da görülür noktasal dağıtımı için karışık olmamalıdır. </li></ol> Teslim İçişleri Bakanlığı 5. denetimden geçmiş Konsantrasyon <ol><li> Kullanılan hücre tipinde dfTAT verimli sitozolik serbest ulaşmak için gerekli &quot;optimal dağıtım&quot; konsantrasyonunu belirleyin. Increasin ile kuluçkaya hücreler üzerinde floresan mikroskobu gerçekleştirindfTAT g konsantrasyonları. Optimal dfTAT konsantrasyonu sitosolik temizlemek için neden minimum konsantrasyon olarak tanımlanan bir kültür içindeki hücrelerin yaklaşık% 100 TMR floresan &quot;yaygın&quot;. </li><li> (DfTAT optimal dağıtım konsantrasyonu kullanılarak, örneğin) dfTAT sabiti konsantrasyonunu tutarken İçişleri Bakanlığı konsantrasyon eş kuluçka protokolünde kullanılan Vary. Az 1 saat inkübasyon süresi değiştirilmesi İçişleri Bakanlığı teslim miktarını değiştirmek için bir seçenek olabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Didenko, V. V., Ngo, H., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine+as+a+transmembrane+carrier+of+fluorescently+labeled+proteins+and+antibodies.">Polyethyleneimine as a transmembrane carrier of fluorescently labeled proteins and antibodies.</a> Anal Biochem. 344, 168-173 (2005).</li><li>Takeuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+Rapid+Cytosolic+Delivery+Using+Cell-Penetrating+Peptides+Mediated+by+Pyrenebutyrate.">Direct and Rapid Cytosolic Delivery Using Cell-Penetrating Peptides Mediated by Pyrenebutyrate.</a> ACS Chem Biol. 1, 299-303 (2006).</li><li>Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peptide+carrier+for+the+delivery+of+biologically+active+proteins+into+mammalian+cells.">A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells.</a> Nat Biotech. 19, 1173-1176 (2001).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+somatic+cells+via+TAT-mediated+protein+transduction+of+recombinant+factors.">Reprogramming of somatic cells via TAT-mediated protein transduction of recombinant factors.</a> Biomaterials. 33, 5047-5055 (2012).</li><li>Torchilin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+delivery+of+protein+and+peptide+therapeutics.">Intracellular delivery of protein and peptide therapeutics.</a> Drug Discov Today: Technol. 5, e95-e103 (2005).</li><li>Chakravarty, P., Qian, W., El-Sayed, M. A., Prausnitz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+molecules+into+cells+using+carbon+nanoparticles+activated+by+femtosecond+laser+pulses.">Delivery of molecules into cells using carbon nanoparticles activated by femtosecond laser pulses.</a> Nature nanotechnol. 5, 607-611 (2010).</li><li>Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+delivery+using+engineered+virus-like+particles.">Protein delivery using engineered virus-like particles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 16998-17003 (2011).</li><li>Pan, C., Lu, B., Chen, H., Bishop, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+human+fibroblasts+using+HIV-1+TAT+recombinant+proteins+OCT4,+SOX2,+KLF4+and+c-MYC.">Reprogramming human fibroblasts using HIV-1 TAT recombinant proteins OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC.</a> Mol Biol Rep. 37, 2117-2124 (2010).</li><li>Fittipaldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Membrane+Lipid+Rafts+Mediate+Caveolar+Endocytosis+of+HIV-1+Tat+Fusion+Proteins.">Cell Membrane Lipid Rafts Mediate Caveolar Endocytosis of HIV-1 Tat Fusion Proteins.</a> J Biol Chem. 278, 34141-34149 (2003).</li><li>Lee, Y. J., Erazo-Oliveras, A., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+macromolecules+into+live+cells+by+simple+co-incubation+with+a+peptide.">Delivery of macromolecules into live cells by simple co-incubation with a peptide.</a> Chembiochem. 11, 325-330 (2010).</li><li>Angeles-Boza, A. M., Erazo-Oliveras, A., Lee, Y. J., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+endosomolytic+reagents+by+branching+of+cell-penetrating+peptides:+tools+for+the+delivery+of+bioactive+compounds+to+live+cells+in+cis+or+trans.">Generation of endosomolytic reagents by branching of cell-penetrating peptides: tools for the delivery of bioactive compounds to live cells in cis or trans.</a> Bioconjugate chem. 21, 2164-2167 (2010).</li><li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O.">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3185-3190 (2001).</li><li>Erazo-Oliveras, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+delivery+into+live+cells+by+incubation+with+an+endosomolytic+agent.">Protein delivery into live cells by incubation with an endosomolytic agent.</a> Nat methods. 11, 861-867 (2014).</li><li>Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+test+for+detection+of+free+terminal+amino+groups+in+the+solid-phase+synthesis+of+peptides.">Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides.</a> Anal Biochem. 34, 595-598 (1970).</li><li>Muthukrishnan, N., Johnson, G. A., Lim, J., Simanek, E. E., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAT-mediated+photochemical+internalization+results+in+cell+killing+by+causing+the+release+of+calcium+into+the+cytosol+of+cells.">TAT-mediated photochemical internalization results in cell killing by causing the release of calcium into the cytosol of cells.</a> Biochim biophys acta. 1820, 1734-1743 (2012).</li><li>Lautwein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+B+lymphoblastoid+cells+contain+distinct+patterns+of+cathepsin+activity+in+endocytic+compartments+and+regulate+MHC+class+II+transport+in+a+cathepsin+S-independent+manner.">Human B lymphoblastoid cells contain distinct patterns of cathepsin activity in endocytic compartments and regulate MHC class II transport in a cathepsin S-independent manner.</a> J Leukoc Biol. 75, 844-855 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Çünkü bu aşırı konfluent olmamalıdır dfTAT teslimat için kullanılan hücreler (&gt;% 90 konflüans) verme etkinliğini etkileyebilir. Hücreler de sağlıklı olması gerekir: kültürdeki ölü hücreler dfTAT (bozulmuş çekirdekten örneğin DNA) etkileşim hangi ile apoptotik parçaları serbest bırakabilirsiniz. Bu da bu uygulama randımanına ve görüntüleme kalitesini engelleyebilir. Hücreler dfTAT eklemeden önce FBS kaldırmak için iyice yıkanmalıdır. FBS içinde BSA bulunan dfTAT ba?...

Canlı hücrelere proteinler, peptitler ya da hücre-geçirgen olmayan küçük molekül iletilmesi pek çok biyolojik veya biyoteknolojik uygulamalar (hücresel görüntüleme işlevsel deneyler, hücre yeniden programlama, vb.) 1-4 genellikle arzu edilen bir durumdur. Birçok dağıtım yaklaşımlar önce mikroenjeksiyon, elektroporasyon veya taşıyıcı maddelerin kullanımı da dahil olmak üzere, rapor edilmiştir (örn., Örneğin TAT hücre nüfuz peptidler, lipidler) 5-7. Her teknik genellikle belirli uygulamalar için değil, başkaları için bu yaklaşımlar yeterli hale getirebileceğini belirli artıları ve eksileri vardır. Sık karşılaşılan sorunlar birkaç hücrelerde değil bütün bir halkın ve / veya eksikliği 8,9 teslim edilir ne kadar malzeme kontrolü, toksisite veya zararlı fizyolojik etkisi 10,11, zamansal kontrol eksikliği, teslimat kötü teslimat verimliliği (dahil örn., mikroenjeksiyon) 12 ve karmaşık kimyasal çekimi veya formülasyon şemaları 11. s = &quot;jove_content&quot;&gt; Son zamanlarda, biz bu sınırlamaları ortadan bir roman teslim strateji geliştirdik. Bu strateji dfTAT adında bir peptid (dimer floresan TAT) 13 dayanır. dfTAT iyi bilinen hücre nüfuz peptid (CPP) TAT türetilmiştir. dfTAT fluorofor tetrametilrodamin ile etiketlenmiş TAT iki disülfür bağlı bir kopyasını içerir. Onların benzerliklere rağmen, TAT ve dfTAT aktivitesinde önemli ölçüde farklıdır. TAT tipik endositoz ile hücre içine yerleştirilebilir. Bu CPP Ancak çoğunlukla (floresan mikroskobu ile incelendiğinde bu genellikle hücrelerin içinde peptid bir noktalı dağılımına yol) endozomlardan içinde sıkışıp kalır. TAT gibi, dfTAT verimli hücreler tarafından endocytosed edilir. Ancak, dfTAT endozomlardan içinde sıkışıp kalmıyor. Bunun yerine, son derece verimli bir şekilde endozomal sızıntı aracılık eder. DfTAT ve endosomolitik aktivitesi daha sonra basit bir kuluçka testi ile makromoleküllerin teslim için kullanılabilir. şöyle ntent &quot;&gt; dağıtım işleminin mevcut anlayış. dfTAT makropinositoz neden olur. Sonuç olarak, dfTAT kuluçkaya hücreler sıvı faz ortam içinde mevcut olan çözünür protein, peptid, veya küçük molekülleri (ilgili moleküller, MOI) sürebilir endositoz (Şekil 1). dfTAT ve İçişleri arasındaki etkileşimler birlikte endositik yolunun içinde hem de kurumlar trafik sürece gerekli değildir. dfTAT endositik organellerin lümeni içinde belirli bir eşiğe ulaştığında, onun endozomal kaçak aktivitesini (moleküler ayrıntıları ifade dfTAT, çünkü bu yaklaşım Ayrıca. Bu nedenle MOI konjugasyon veya formülasyon düzenleri gerekli olduğu gibi çok uygundur.). tam olarak karakterize olması sızıntılı organellerin lümenin içeriğini kalır ve bu nedenle, İB, daha sonra hücrelerden salınan hücre içi taşıyıcı ulaşıldıktan sonra doğrudan MOI değiştirerek değil, aynı zamanda MOIS işlevine müdahale etmemelidir. Buna ek olarak, konsantrasyondfTAT dağıtım medyada MOI bu bağımsız kullanılır. Örneğin, dfTAT konsantrasyonu endozomal kaçağı tekrarlanabilir verim sağlamak için farklı deneyler arasında sabit tutulabilir. Bunun aksine, ortam içinde MOI konsantrasyonu giderek MOI sitozol içinde teslim istenen seviyelerinin elde edilmesi için değiştirilebilir. DfTAT ile elde yüksek endozomal kaçak verimliliği bugüne kadar test edilen hücrelerin birçok dikkat çekici zararsız olduğunu. Endositik organelleri hücre önemli bir bileşenidir ve bir dfTAT aracılık dramatik kaçak zararlı hücresel yanıtları eşlik edeceğini beklenir, çünkü bu bir sürpriz oldu. Bununla birlikte, tedavi edilen hücreler, tedavi edilmemiş hücrelere aynı hızda çoğalır ve transcriptome önemli bir değişiklik göstermez. Ayrıca, dağıtım hücreleri kaybetmeden teslim sürecinden tahammül ya kurtarabilirsiniz ya belirten tekrarlanabilir dağıtım verimliliği ile birkaç dakika içinde tekrar edilebilirendositoz veya endozomal sızıntı onların kapasitesi. Ince hücresel yanıtları dfTAT teslimat ve bu yanıtların keşfedilmeyi beklemektedir ne olabileceğini moleküler ayrıntıları sırasında yer alabilir. Ancak, yüksek verim, protokollerin kolaylık ve toksisite eksikliği birleştirerek, bu teslim yaklaşımı birçok hücre tabanlı uygulamalarda hemen kullanışlı ispatlamak zorundadır. Burada sunulan protokolleri araştırma topluluğuna bu teknoloji erişilebilir hale getirmeyi amaçlamaktadır.

<table><tbody><tr><td>Heparin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>CAS 9041-08-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Blue</td><td>Invitrogen</td><td>S11348</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Invitrogen</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>nrL15 L-15 (&amp;ndash;) cysteine</td><td>Hyclone</td><td></td><td>Special order</td></tr><tr><td>Fmoc-protected Amino acids</td><td>Novabiochem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dfTAT</td><td></td><td></td><td>Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu)</td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted epifluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td>model IXB1</td><td>equipped with a heating stage maintained at 37 &amp;deg;C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C humidified, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

delivery of proteins, peptides or cell-impermeable small molecules into live cells by incubation with the endosomolytic reagent dftat

Makromoleküler teslim stratejileri genellikle hücresel bir giriş yolu olarak endositik yolu kullanmaktadır. Ancak, endozomal tuzak ciddi hücrelerin sitozolik alan nüfuz makromoleküller hangi ile verimliliği sınırlar. Son zamanlarda, biz reaktif dfTAT, fluorofor tetrametilrodamin etiketli peptid TAT bir disülfit bağ dimer belirleyerek bu sorunu hile var. Bu, canlı hücreleri nüfuz eder ve özellikle yüksek bir verimlilik ile hücrelerin sitosolik alan ulaşır prototip hücre nüfuz peptid (CPP) TAT, dfTAT, bir floresan etiketli dimer yarattı. DfTAT bölgesinin Sitosolik dağıtım birincil hücreler de dahil olmak üzere birden fazla hücre çizgileri elde edilir. Ayrıca, dağıtım belirgin hücre canlılığı, proliferasyonu veya gen ekspresyonunu etkilememektedir. dfTAT küçük moleküller, peptitler, antikorlar, enzimler ve biyolojik olarak aktif bir transkripsiyon faktörünü sağlayabilir. Bu raporda, dfTA katılan protokol tarifT sentezi ve hücresel teslimat. Eser hücre dışı İlaç olarak verilen proteinin miktarının değiştirilmesiyle hücre sitosolik alan teslim proteinin miktarının kontrolü açıklamaktadır. Son olarak, bu yeni teknoloji ve teslimat doğrulayarak katılan adımların güncel sınırlamalar tartışılmıştır. Tarif edilen protokoller, hücre bazlı deneyler hem de hücrelerinin ex vivo, manipülasyon ve yeniden programlama için çok yararlı olacaktır.

FTAT ve dfTAT arasındaki farkı değerlendirmek için, HeLa hücreleri, hücresel lokalizasyon farkını belirlemek için her peptit ile 1 saat süre ile inkübe edilir. İki CPP en içselleştirilmesi floresan mikroskopi kullanılarak değerlendirildi. FTAT (20 mcM) bir noktasal dağılımı lokalize 2 gösterileri Şekil. Peptid endozomlardan içinde sıkışan kalan bu dağılım tutarlıdır. Bunun aksine, dfTAT (5 uM) floresans sinyali sitosol ve nükleus içinde homojen bir dağ?...

Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT at JoVE.com

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

Endosomolitik Reaktif dfTAT ile kuluçkaya yatırılması ile Canlı hücreler içine proteinler, peptitler ya da hücre-geçirgen olmayan küçük moleküller teslimi

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

delivery-proteins-peptides-or-cell-impermeable-small-molecules-into

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K Görüntüleme.  Texas A&M University. We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky. 

Video: Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Physical interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane protein complexes and in dynamic processes such as transmembrane (TM) signaling and regulation of cell-surface protein levels. Understanding the structural features driving the association of particular sequences requires sophisticated biophysical and biochemical analyses of TM peptide complexes. However, the extreme hydrophobicity of TM domains makes them very difficult to manipulate using standard peptide chemistry techniques, and production of suitable study material often proves prohibitively challenging. Identifying conditions under which peptides can adopt stable helical conformations and form complexes spontaneously adds a further level of difficulty. Here we present a procedure for the production of homo- or hetero-dimeric TM peptide complexes from materials that are expressed in E. coli, thus allowing incorporation of stable isotope labels for nuclear magnetic resonance (NMR) or non-natural amino acids for other applications relatively inexpensively. The key innovation in this method is that TM complexes are produced and purified as covalently associated (disulfide-crosslinked) assemblies that can form stable, stoichiometric and homogeneous structures when reconstituted into detergent, lipid or other membrane-mimetic materials. We also present carefully optimized procedures for expression and purification that are equally applicable whether producing single TM domains or crosslinked complexes and provide advice for adapting these methods to new TM sequences.

Biophysical and biochemical studies of interactions among membrane-embedded protein domains face many technical challenges, the first of which is obtaining appropriate study material. This article describes a protocol for producing and purifying disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes that are suitable for structural analysis by solution nuclear magnetic resonance (NMR) and other analytical applications.

Yapısal Çalışmaları üretimi disülfid stabilize Transmembran Peptit Kompleksi

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Kimya

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

Sağlam, mikroakışkan Hücre içi Delivery Platform olarak hücre Sıkma

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Biyomühendislik

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum (ER) resident proteins implicated in homotypic fusion of the ER. We detail here a method for purifying a glutathione S-transferase (GST) and poly-histidine tagged Drosophila atlastin by two rounds of affinity chromatography. Studying fusion reactions in vitro requires purified fusion proteins to be inserted into a lipid bilayer. Liposomes are ideal model membranes, as lipid composition and size may be adjusted. To this end, we describe a reconstitution method by detergent removal for Drosophila atlastin into preformed liposomes. While several reconstitution methods are available, reconstitution by detergent removal has several advantages that make it suitable for atlastins and other similar proteins. The advantage of this method includes a high reconstitution yield and correct orientation of the reconstituted protein. This method can be extended to other membrane proteins and for other applications that require proteoliposomes. Additionally, we describe a FRET based lipid mixing assay of proteoliposomes used as a measurement of membrane fusion.

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Biological membrane fusion is catalyzed by specialized fusion proteins. Measuring the fusogenic properties of proteins can be achieved by lipid mixing assays. We present a method for purifying recombinant Drosophila atlastin, a protein that mediates homotypic fusion of the ER, reconstituting it to preformed liposomes, and testing for fusion capacity.

Rekombinant Drosophila , lipid karıştırıcılar Için lipozomlar halinde deterjan destekli yeniden yapılanma

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Biyokimya

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. This information is particularly valuable in the context of host-pathogen interactions. Many pathogen proteins function within host cells in a variety of way such as, enabling evasion of the host immune system and survival within the intracellular environment. To study these pathogen-protein host-cell interactions, several approaches are commonly used, including: in vivo infection with a strain expressing a tagged or mutant protein, or introduction of pathogen genes via transfection or transduction. Each of these approaches has advantages and disadvantages. We sought a means to directly introduce exogenous proteins into cells. Electroporation is commonly used to introduce nucleic acids into cells, but has been more rarely applied to proteins although the biophysical basis is exactly the same. A standard electroporator was used to introduce affinity-tagged bacterial effectors into mammalian cells. Human epithelial and mouse macrophage cells were cultured by traditional methods, detached, and placed in 0.4 cm gap electroporation cuvettes with an exogenous bacterial pathogen protein of interest (e.g. Salmonella Typhimurium GtgE). After electroporation (0.3 kV) and a short (4 hr) recovery period, intracellular protein was verified by fluorescently labeling the protein via its affinity tag and examining spatial and temporal distribution by confocal microscopy. The electroporated protein was also shown to be functional inside the cell and capable of correct subcellular trafficking and protein-protein interaction. While the exogenous proteins tended to accumulate on the surface of the cells, the electroporated samples had large increases in intracellular effector concentration relative to incubation alone. The protocol is simple and fast enough to be done in a parallel fashion, allowing for high-throughput characterization of pathogen proteins in host cells including subcellular targeting and function of virulence proteins.

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

Memeli Hücreleri içinde fonksiyonel Bakteriyel Efektör elektroporasyonu

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Engineering Cell-permeable Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can make use of the translocating ability of so-called cell penetrating peptides (CPPs), also designated as protein transduction domains (PTDs). The TAT-CPP derived from the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Tat (trans-activator of transcription) protein has been widely used. The positively charged TAT promotes cell permeability thereby overcoming the barriers of the cellular membrane by endocytosis or/and direct membrane penetration2. In combination with a nuclear localization signal (NLS) fusion proteins are able to enter the nucleus exhibiting functionality. Our video presentation demonstrates, as an exemplification for the engineering of cell-permeable proteins, the construction, production and application of a cell-permeable version of the DNA-modifying enzyme Cre.
Cre is a site-specific recombinase that is able to recognize and recombine 34 base pair loxP sites in mammalian cells in vitro and in vivo. Therefore the Cre/loxP system is widely used to conditionally induce mutations in the genome of living cells3,4. The delivery of active Cre recombinase to cells, however, represents a limitation.
We describe the pSESAME vector system, which allows a direct insertion of the gene-of-interest and provides a platform to rapidly clone different domains and tags used within the vector in a convenient and standardized manner. Rearranging of the different tags has been shown to modify the biochemical properties of the fusion proteins providing a possibility to achieve higher yield and better solubility. We demonstrate how to express and purify recombinant cell-permeant proteins in and from E. coli. The functionality of the recombinant Cre protein is finally validated in cell culture by assessing its intracellular recombinase activity.

Protein transduction enables the direct delivery of biologically active proteins into cells. In contrast to conventional methods such as DNA transfection or viral transduction this non-invasive paradigm allows highly efficient cellular manipulation in a titratable manner circumventing cellular toxicity and the risk of oncogenic transformation by permanent genetic modification.

Mühendislik Hücre geçirgen Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can ...

Biyoloji

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1. Many of these are referred to as cell-penetrating peptides, which are frequently noted for their potential as drug delivery vectors1-3. Moreover, there is increasing interest in antimicrobial peptides that operate via non-membrane lytic mechanisms4,5, particularly those that cross bacterial membranes without causing cell lysis and kill cells by interfering with intracellular processes6,7. In fact, authors have increasingly pointed out the relationship between cell-penetrating and antimicrobial peptides1,8. A firm understanding of the process of membrane translocation and the relationship between peptide structure and its ability to translocate requires effective, reproducible assays for translocation. Several groups have proposed methods to measure translocation into large unilamellar lipid vesicles (LUVs)9-13. LUVs serve as useful models for bacterial and eukaryotic cell membranes and are frequently used in peptide fluorescent studies14,15. Here, we describe our application of the method first developed by Matsuzaki and co-workers to consider antimicrobial peptides, such as magainin and buforin II16,17. In addition to providing our protocol for this method, we also present a straightforward approach to data analysis that quantifies translocation ability using this assay. The advantages of this translocation assay compared to others are that it has the potential to provide information about the rate of membrane translocation and does not require the addition of a fluorescent label, which can alter peptide properties18, to tryptophan-containing peptides. Briefly, translocation ability into lipid vesicles is measured as a function of the Foster Resonance Energy Transfer (FRET) between native tryptophan residues and dansyl phosphatidylethanolamine when proteins are associated with the external LUV membrane (Figure 1). Cell-penetrating peptides are cleaved as they encounter uninhibited trypsin encapsulated with the LUVs, leading to disassociation from the LUV membrane and a drop in FRET signal. The drop in FRET signal observed for a translocating peptide is significantly greater than that observed for the same peptide when the LUVs contain both trypsin and trypsin inhibitor, or when a peptide that does not spontaneously cross lipid membranes is exposed to trypsin-containing LUVs. This change in fluorescence provides a direct quantification of peptide translocation over time.

This protocol details a method for the quantitative measure of peptide translocation into large unilamellar lipid vesicles. This method also provides information about the rate of membrane translocation and can be used to identify peptides that efficiently and spontaneously cross lipid bilayers.

Büyük Unilamellar Veziküller Ölçme Peptid Translokasyon

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

Hücre geçirgen Cys kullanılarak memeli hücrelerinde doğrudan protein teslim<sub&gt; 2</sub&gt; His<sub&gt; 2</sub&gt; Çinko-parmak Alanlar

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated exocytosis is fundamental for intercellular communication and is a key mechanism for the secretion of neurotransmitters, hormones, inflammatory mediators, and other compounds, by a variety of cells. At least three distinct mechanisms are known for regulated exocytosis: full exocytosis, where a single SG fully fuses with the plasma membrane, kiss-and-run exocytosis, where a single SG transiently fuses with the plasma membrane, and compound exocytosis, where several SGs fuse with each other, prior to or after SG fusion with the plasma membrane. The type of regulated exocytosis undertaken by a cell is often dictated by the type of secretory trigger. However, in many cells, a single secretory trigger can activate multiple modes of regulated exocytosis simultaneously. Despite their abundance and importance across cell types and species, the mechanisms that determine the different modes of secretion are largely unresolved. One of the main challenges in investigating the different modes of regulated exocytosis, is the difficulty in distinguishing between them as well as exploring them separately. Here we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran as an exocytosis reporter, and live cell imaging, to differentiate between the different pathways of regulated exocytosis, focusing on compound exocytosis, based on the robustness and duration of the exocytic events.

Here we detail a method for live cell imaging of regulated exocytosis. This method utilizes FITC-dextran, which accumulates in lysosome-related organelles, as a reporter. This simple method also allows distinguishing between different modes of regulated exocytosis in cells that are difficult to manipulate genetically.

Düzenlenmiş ekzositozu için muhabir olarak FITC dextran görüntüleme

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...

Bead Loading Proteins and Nucleic Acids into Adherent Human Cells

Many live-cell imaging experiments use exogenous particles (e.g., peptides, antibodies, beads) to label or function within cells. However, introducing proteins into a cell across its membrane is difficult. The limited selection of current methods struggles with low efficiency, requires expensive and technically demanding equipment, or functions within narrow parameters. Here, we describe a relatively simple and cost-effective technique for loading DNA, RNA, and proteins into live human cells. Bead loading induces a temporary mechanical disruption to the cell membrane, allowing macromolecules to enter adherent, live mammalian cells. At less than 0.01 USD per experiment, bead loading is the least expensive cell loading method available. Moreover, bead loading does not substantially stress cells or impact their viability or proliferation. This manuscript describes the steps of the bead loading procedure, adaptations, variations, and technical limitations. This methodology is especially suited for live-cell imaging but provides a practical solution for other applications requiring the introduction of proteins, beads, RNA, or plasmids into living, adherent mammalian cells.

Bead loading introduces proteins, plasmids, and particles into adherent mammalian cells. This cell loading technique is inexpensive, rapid, and does not substantially affect cell health. It is best suited for live-cell imaging.

Boncuk, Proteinleri ve Nükleik Asitleri Yapışan İnsan Hücrelerine Yüklüyor

Many live-cell imaging experiments use exogenous particles (e.g., peptides, antibodies, beads) to label or function within cells. However, introducing ...

Live Fluorescence, Inverse Imaging of Cell Ruffling, and Macropinocytosis

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase nutrients and other material in cells. The dramatic extension of cell surface ruffles, their closure to form macropinosomes, and the maturation of internalized macropinosomes are key events in this pathway that can be difficult to capture using conventional confocal imaging based on tracking a bolus of fluorescent cargo. Fluorescent dextrans are commonly used experimentally as fluid phase markers for macropinosomes and for other endocytic pathways. A method the lab has adopted to optimize the imaging of dextran uptake involves using live imaging of cells bathed in high concentrations of fluorescent dextran in the medium, with the unlabeled cells appearing in relief (as black). The cell ruffles are highlighted to visualize ruffle closure, and internalized macropinosomes appear as fluorescent vacuoles in the cell interior. This method is optimal for visualizing macropinosome features and allows for easy segmentation and quantification. This paper describes dual-labeling of pathways with different sized dextrans and the co-expression of lipid probes and fluorescent membrane proteins to demark macropinosomes and other endosomes. The detection of internalized dextran at an ultrastructural level using correlative light and electron microscopy (CLEM) is also demonstrated. These cell processes can be imaged using multiple live imaging modalities, including in 3D. Taken together, these approaches optimize macropinosome imaging for many different settings and experimental systems.

<meta charset="utf8"></head><body>Canlı Floresan, Hücre Karışıklığının Ters Görüntülenmesi ve Makropinositoz

This protocol demonstrates dextran imaging in live cells using continuous uptake and inverse images to optimize visualization of ruffling, macropinosome maturation, and analysis of dextran and other cell labelings.

Canlı Floresan, Hücre Karışıklığının Ters Görüntülenmesi ve Makropinositoz

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase ...