This article was supported by Award Number R01GM087227 from the National Institute of General Medical Sciences, the Norman Ackerman Advanced Research Program, and the Robert A. Welch foundation (Grant A-1769).

1. SPPS: CK (TMR) TATG (fTAT) Synthèse Remarque: dfTAT est construit en deux étapes: synthèse du monomère de fTAT par synthèse peptidique en phase solide suivie d&#39;une dimérisation de liaison disulfure pour former dfTAT. <ol><li> Swell 500 mg de Rink Amide MBHA dans le diméthylformamide (DMF) dans un 50 ml navire SPPS standard pour 1 h. </li><li> Effectuer Fmoc déprotection par incubation de la résine Fmoc protégé dans une solution de pipéridine à 20% (20% de pipéridine dans du DMF, 10 ml (0,30 mmol). Effectuer les étapes de déprotection de deux fois (1 x 5 min et 1 x 15 min) avec une étape de lavage à l&#39;aide DMF (l&#39;étape de lavage comprend le rinçage de la résine plusieurs fois avec un volume total d&#39;environ 150 ml de DMF et l&#39;élimination du solvant par filtration sous vide) entre les deux réactions. </li><li> Synthétiser CK (TMR) RKKRRQRRRG (fTAT) sur la résine MBHA patinoire amide. Utilisation suivant la acides aminés protégés par Fmoc: Fmoc-Lys (Mtt) -OH (uniquement sur les N-terminale), Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc- Gln (Trt) -OH, Fmoc-Cys et (Trt) -OH. Réaliser la réaction en utilisant N 2 (20 PSI) à agiter la réaction. Effectuer toutes les réactions à la température ambiante. <ol><li> Effectuer chaque acide réaction de couplage aminé pendant 4 heures. Pour chaque couplage, utiliser la protection Fmoc acide aminé (1,2 mmol), de N, N, N &#39;, N&#39; tétraméthyl- O- (benzotriazol-1 H 1-yl) uronium (HBTU) (0,44 g, 1,1 mmoles ), et de la diisopropyléthylamine (DIEA) (0,51 ml, 3,0 mmol) dissous dans du DMF. Après le couplage de 4 heures, laver la résine avec du DMF et d&#39;effectuer l&#39;étape de déprotection Fmoc comme décrit dans l&#39;étape 1.2. </li><li> Répéter jusqu&#39;à ce que la chaîne peptidique linéaire de fTAT (chaîne peptidique linéaire: CKRKKRRQRRRG aucun TMR) a été synthétisé. </li><li> Puis, lavez soigneusement la résine en utilisant d&#39;abord et après que le DMF avec du dichlorométhane (DCM). Rincer la résine plusieurs fois avec un volume total d&#39;environ 150 ml de DMF ou le DCM et éliminer le solvant par filtration sous vide. </li><li> Use MALDI-TOF afin de confirmer que le peptide obtenu a la masse moléculaire correcte. <ol><li> Ajouter un mélange de matrice par addition de 1 mg de la matrice à une solution composée de 50 ul de TFA à 0,01% d&#39;eau et de solution 50 ul d&#39;acétonitrile. </li><li> Pour confirmer linéaire de masse de la chaîne peptidique, l&#39;acide α-utiliser cyano-4-hydroxycinnamique. Exécuter une HPLC analytique du peptide brut et recueillir 50 pi du sommet du pic pur. </li><li> Pour préparer l&#39;échantillon à la plaque sur la plaque MALDI: Ajouter 8 pi de peptide à 2 pi de la solution de matrice et les placer sur la plaque MALDI sécher à l&#39;air ou sur une plaque de 37 ° C de chaleur. Note: L&#39;arginine est connue pour être difficile à un acide couple dans SPPS aminés. Couplage succès est établi en effectuant un test de Kaiser 14 (test par exemple, la ninhydrine). Cet essai permet la détection d&#39;amines libres qui pourraient subsister désaccouplé sur la résine. Dans le cas où une couleur bleue est détectée (indicatif de la présence d&#39;amines libres), le couplage sPTE sont répétées. </li></ol></li></ol></li><li> Pour CK (-NH-TMR) TATG (fTAT), cliver le groupe protecteur Mtt au groupe a-amino de Lys sur CK (-NH-MTT) TATG avec une solution composée de 1% d&#39;acide trifluoroacétique (TFA) et 2% de triisopropylsilane (TIS) dans le DCM. <ol><li> Comme l&#39;élimination de groupe protecteur MTT se traduirait par l&#39;apparition d&#39;une couleur jaune, incuber la résine avec 20 ml de la solution ci-dessus pendant 5 min, jusqu&#39;à ce qu&#39;il ne répéter cette couleur jaune est observée. Laver la résine avec du DCM et du DMF dans l&#39;intervalle. En outre, depuis TIS est un charognard qui piéger le MTT, une fois pas de couleur jaune apparaît dans la solution en présence de MTT. </li><li> Ajouter une solution supplémentaire de 1% de TFA dans du DCM (pas d&#39;TIS) pour la résine destinée à assurer qu&#39;aucune plus MTT est éliminée et la solution reste limpide. </li></ol></li><li> Dissoudre les trois composantes: carboxytétraméthylrhodamine (TMR), HBTU et de DIEA (4, 3,9 et 10 l&#39;équivalence en ce qui concerne la quantité de résine (en mg)) dans le DMF et ajouter ce mélangeà la résine et effectuer la réaction O / N à l&#39;aide de N2 sec à fournir une agitation. </li><li> Après Fmoc-déprotection et la conjugaison d&#39;acides aminés, laver la résine avec du DCM et laisser sécher. Pour le clivage complet du peptide de la résine, ajouter une solution contenant 92,5% de TFA, 2,5% de H 2 O, 2,5%, TIS, et 2,5% d&#39;éthanedithiol (EDT) (volume total = 4 ml) à la peptidyl-résine pour trois heure à température ambiante pour obtenir une déprotection globale et le clivage de la résine. <ol><li> Précipiter les produits peptidiques bruts avec de l&#39;éther éthylique anhydre froid (Et 2 O) en drainant la solution de l&#39;étape 1.6 dans 40 ml d&#39;Et 2 O, tourner vers le bas ce à 4 ° C et 4000 x g pendant 20 - 25 min. Répétez cette étape pour permettre le lavage du précipité avec anhydre froid Et 2 O. </li><li> Remettre en suspension les précipités dans l&#39;eau (5 ml ou jusqu&#39;à ce précipité est complètement dissous) et lyophiliser. Ensuite, remettre en suspension les produits obtenus dans 0,1% de TFA aqueux / acétonitrile. </li></ol></li> &lt;li&gt; Effectuer l&#39;analyse HPLC avec une colonne analytique C18 (5 pm, 4 x 150 mm) pour analyser chaque peptide. Utiliser une vitesse d&#39;écoulement de 1 ml / min, et la détection à 214 nm et 550 nm. </li><li> Effectuer HPLC semi-préparative sur une colonne de 10 x 250 mm C18 pour la purification des peptides. Utiliser un débit de 4 ml / min, et la détection à 214 nm et 550 nm. Pour tous les essais, en utilisant des gradients linéaires de TFA aqueux à 0,1% (solvant A) et 90% d&#39;acétonitrile, 9,9% d&#39;eau, et 0,1% de TFA (solvant B). </li><li> Confirmer l&#39;identité exacte des peptides par MALDI-TOF selon le protocole du fabricant: fTAT, masse attendue: 2,041.17, masse observée: 2040,66. DEAC-K9, masse attendue: 1,412.97, a observé de masse: 1,415.59. Utilisation d&#39;une matrice d&#39;acide α- cyano-4-hydroxycinnamique à la MALDI-TOF. </li></ol> 2. Réaction d&#39;oxydation: Génération dfTAT <ol><li> Aérer solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à pH 7,4 pendant 1 h (au moins 5 ml pour la réaction ci-dessous). </li><li> Dissoudre fTAT (0,3 mg, 1,5 x 10 -4 mmol) dans aerATED PBS pH 7,4 (5 ml). Assurez-vous que le pH est compris entre 7,0 - 7,5 après l&#39;addition du peptide. Sinon ajouter de l&#39;hydroxyde de sodium (1 M, par petits incréments de 1 à 5 pl) pour porter le pH jusqu&#39;à 7,4 avant. </li><li> Remarque: L&#39;oxygène dissous dans du PBS agit de façon à oxyder les groupes thiols sur fTAT et former une liaison disulfure. </li><li> Nutation la réaction O / N afin de lui permettre de réagir jusqu&#39;à achèvement (rendement de 100% sur la base de l&#39;analyse par CLHP). On purifie le produit en utilisant HPLC en phase inverse et analyse par spectrométrie de masse (MALDI-TOF) comme dans l&#39;étape 1.9. Masse attendue: 4,080.34, a observé de masse: 4,084.21. </li><li> Lyophiliser pur dfTAT (0,71 x10 -4 mmol) et remettre en suspension dans 200 pi d&#39;eau (concentration pur dfTAT = 356,3 M). </li></ol> 3. Mesurer dfTAT Concentration <ol><li> Remettre en suspension une portion aliquote de la dfTAT (typiquement 1 pi en fonction de la quantité de peptide purifié) purifié dans une solution de 149 ul de 50 mM de TCEP. </li><li> Remarque: Dans cette étape dfTAT est réduite à sa moNomer homologue fTAT pour éliminer la trempe d&#39;absorbance qui se produit en raison de la proximité du fluorophore TMR dans dfTAT (l&#39;ε du coefficient d&#39;extinction de la TMR dans dfTAT est réduite par rapport à la ε de TMR dans fTAT réduite). </li><li> Laisser l&#39;échantillon de réagir pendant environ 20 min (HPLC analytique peut être utilisé pour confirmer la formation de fTAT). </li><li> Ajouter toute la solution dans la cuvette de quartz et de mesurer l&#39;absorbance à 556 nm. </li><li> En utilisant la loi de Beer (A = εcl: ε = 91500 M -1 cm -1) pour calculer la concentration de fTAT, déterminer la concentration de dfTAT, et de diviser [fTAT] par deux. </li></ol> 4. Les expériences de livraison cellulaires <ol><li> Ensemencer les cellules (HeLa, HDF, etc.) Dans un plat à une confluence de 80 - 90% (par exemple, 8 puits ou à 24 puits plat). Cultiver des cellules dans un milieu approprié (par exemple, DMEM complété avec 10% de FBS et Pen / Strep) jusqu&#39;à ce que 80 - 90% de confluence dans un 37 ° Catmosphère humidifiée contenant 5% de CO 2. </li><li> Laver les cellules trois fois (3 x) avec du PBS (par addition de 200 pl de PBS et ensuite l&#39;élimination trois fois). </li><li> Faire une concentration de travail de 5 uM de dfTAT en diluant un stock de dfTAT (dans l&#39;eau) dans la LNR-15 médias (pour un 8 bien plat le volume total devrait être de 200 pi). Une concentration de 5 uM dfTAT conduit à une prestation efficace (niveau élevé de la livraison cytosolique dans plus de 90% de cellules présentes dans un plat) dans la plupart des types de cellules testés à ce jour (Figure 3). Cependant, les concentrations inférieures ou supérieures pourraient être plus adéquat pour les types de cellules avec une propension élevée ou faible pour la pénétration. NOTE A PROPOS DE MEDIA: NRL-15 est utilisé pour la livraison de dfTAT car il ne contient pas de cystéine qui pourrait réduire la liaison disulfure dans dfTAT. Cependant, nos données indiquent que le paquet régulier L-15 (avec de la cysteine) et DMEM peut être utilisé comme support de livraison. L-15 contient la cystéine d&#39;acides aminés mais la réduction de la cystéine presumabLy oxyde dans les médias pour former la cystine (DMEM est formulé avec la cystine). dfTAT reste donc intacte dans ces milieux et la livraison fonctionne avec la même efficacité que celle obtenue avec nrL15. </li><li> Incuber les cellules avec dfTAT (5 uM) avec ou sans cargaison (par ex., EGFP (10 M)) et conserver à 37 ° C pendant 1 heure (temps d&#39;incubation peut être réduite, mais dfTAT nécessite généralement environ 30 à 45 min pour induire une fuite endosomiale ). </li><li> Laver les cellules avec de l&#39;héparine (1 mg / ml) dans du L-15 (3 lavages sont recommandés) pour éliminer dfTAT lié à la membrane plasmique des cellules. </li><li> Incuber les cellules avec coloration nucléaire de cellule imperméable, par exemple., Bleu Sytox, Sytox Green (2 pM dans NRL-15), afin de déterminer si la membrane plasmique des cellules est compromise (cellules mortes sont colorées alors que les cellules vivantes ne sont pas) selon la le protocole du fabricant. </li><li> Cellules image en utilisant un microscope à fluorescence (100X à immersion d&#39;huile ou d&#39;un objectif 20X). DfTAT image en utilisant un filtre de demande de propositions (Ex =560 ± 20 nm / Em = 630 ± 35 nm). Remarque: La prestation réussie conduit à une fluorescence diffuse des dfTAT toute la cellule (évaluation de la prestation de protéine ou un peptide d&#39;intérêt dépendra de l&#39;application). La coloration des nucléoles par fTAT (le produit réduit lors de l&#39;entrée de dfTAT cytosolique) peut être utilisé comme une indication que la fluorescence détectée est intracellulaire. fTAT se dégrade en quelques heures. À ce stade, la fluorescence des fragments de dégradation apparaît comme ponctuée. Cela ne devrait pas être confondu pour la distribution ponctuée qui est également considéré si dfTAT reste sans succès piégé à l&#39;intérieur des endosomes (cela peut arriver si dfTAT est présent à une trop faible concentration). </li></ol> 5. Controling Concentration de MOI Livré <ol><li> Identifier la concentration &quot;de livraison optimale&quot; nécessaire pour obtenir la libération cytosolique efficace de dfTAT dans le type de cellule utilisée. Effectuer la microscopie par fluorescence sur des cellules incubées avec increasing concentrations de dfTAT. La concentration optimale dfTAT est définie comme la concentration minimale qui conduit à effacer cytosolique &quot;diffuser&quot; TMR fluorescence à environ 100% des cellules dans une culture. </li><li> Varier la concentration de MOI utilisé dans le protocole de co-incubation tout en gardant la concentration de dfTAT constante (par exemple, en utilisant une concentration de livraison optimale de dfTAT). Modification de la durée d&#39;incubation à moins de 1 h pourrait également être une option pour varier la quantité de MOI livré. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Les cellules utilisées pour la livraison dfTAT ne devrait pas être trop confluentes (&gt; 90% de confluence) car cela pourrait affecter l&#39;efficacité de la livraison. Les cellules devraient également être en bonne santé: les cellules mortes à la culture peuvent libérer des fragments apoptotiques avec laquelle dfTAT peut interagir (par exemple, l&#39;ADN à partir de noyaux dégradées). Cela peut interférer avec l&#39;efficacité de la livraison et de la qualité de l&#39;imagerie. Les cellules doiv...

La livraison des protéines, des peptides ou de petites molécules cellulaires imperméable dans les cellules vivantes est souvent souhaitable dans de nombreuses applications biologiques ou biotechnologiques (imagerie cellulaire, des tests fonctionnels, reprogrammation cellulaire, etc.) 4.1. De nombreuses approches de livraison ont déjà été signalées, y compris une micro-injection, l&#39;électroporation ou l&#39;utilisation d&#39;agents de support (par ex., Des peptides de pénétration cellulaire telles que des lipides, TAT) 5-7. Chaque technique a généralement avantages et les inconvénients spécifiques qui pourraient rendre ces approches adéquates pour certaines applications, mais pas pour d&#39;autres. Questions courantes concernent l&#39;efficacité de livraison pauvres et / ou le manque de contrôle de la quantité de matériel est livré 8,9, la toxicité ou délétère impact physiologique 10,11, le manque de contrôle temporel, la livraison dans quelques cellules, mais pas dans toute une population (par ex., microinjection) 12, et de conjugaison complexe chimique ou formulation régimes 11. s = &quot;jove_content&quot;&gt; Récemment, nous avons développé une stratégie de prestation roman qui contourne ces limitations. Cette stratégie repose sur un peptide appelé dfTAT (dimère de TAT fluorescent) 13. dfTAT est dérivé du peptide bien savoir cellule-pénétrant (RPC) TAT. dfTAT contient deux copies de disulfure lié TAT marqués avec le fluorophore tétraméthylrhodamine. Malgré leurs similitudes, TAT et dfTAT diffèrent de manière significative de l&#39;activité. TAT est généralement internalisé dans les cellules par endocytose. Ce RPC reste cependant la plupart du temps emprisonné à l&#39;intérieur des endosomes (ce qui généralement conduit à une distribution ponctuée du peptide dans les cellules lorsqu&#39;elles sont examinées par microscopie à fluorescence). Comme TAT, dfTAT est efficacement endocytose par les cellules. Cependant, dfTAT ne reste pas coincé à l&#39;intérieur des endosomes. Au lieu de cela, il assure la médiation de fuite de l&#39;endosome d&#39;une manière qui est extrêmement efficace. L&#39;activité de endosomolytique dfTAT peut alors être exploitée pour fournir des macromolécules par un essai d&#39;incubation simple. MÉNAGEMENT &quot;&gt; La compréhension actuelle du processus d&#39;exécution est le suivant. dfTAT induit macropinocytose. En conséquence, les cellules incubées avec dfTAT prennent des protéines solubles, des peptides ou de petites molécules (molécules d&#39;intérêt, MOI) présents dans les médias par le fluide en phase endocytose (voir figure 1). Les interactions entre dfTAT et MOI ne sont pas nécessaires dans la mesure où les deux entités de trafic en même temps à l&#39;intérieur de la voie d&#39;endocytose. Comme dfTAT atteint un certain seuil dans la lumière des organites d&#39;endocytose, on exprime l&#39;activité de fuite de l&#39;endosome (les détails moléculaires restent à être pleinement caractérisé). Le contenu de la lumière des organites qui fuient, et donc la MOI, est alors libéré dans les cellules. Cette approche est donc très pratique car aucun conjugaison ou de formulation des programmes avec MOI sont nécessaires. En outre, parce dfTAT est pas directement la modification d&#39;un MOI, il ne doit pas interférer avec la fonction IAM une fois que la délivrance intracellulaire est réalisée. En outre, la concentration dedfTAT utilisé livraison est indépendante de celle de MOI dans les médias. Par exemple, la concentration dfTAT peut être maintenue constante entre les différentes expériences pour garantir l&#39;efficacité de fuite reproductibles endosomal. En revanche, la concentration de la MOI dans les médias peut être progressivement modifié pour atteindre des niveaux souhaités de MOI livré dans le cytosol. L&#39;efficacité de fuite endosomal haute réalisé avec dfTAT est remarquablement inoffensifs pour la plupart des cellules testées à ce jour. Ceci est une surprise car organites d&#39;endocytose sont composante importante des cellules et on pourrait penser que la fuite dramatique médiée par dfTAT serait accompagnée par des réponses cellulaires délétères. Pourtant, les cellules traitées prolifèrent à la même vitesse que les cellules non traitées et ne présentent pas de changements significatifs dans leur transcriptome. En outre, la livraison peut être répété en quelques minutes avec des rendements de livraison reproductibles, ce qui indique que les cellules peuvent soit tolérer ou récupérer du processus de livraison sans perdreleur capacité d&#39;endocytose ou de fuite endosomal. Réponses cellulaires subtiles pourraient avoir lieu lors de la livraison dfTAT et les détails moléculaires de ce que ces réponses pourraient être restent à explorer. Pourtant, en alliant efficacité, commodité de protocoles, et l&#39;absence de toxicité, cette approche de la livraison devrait se révéler immédiatement utile dans de nombreuses applications à base de cellules. Les protocoles présentés ici visent à rendre cette technologie accessible à la communauté de recherche.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Heparin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CAS 9041-08-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nrL15 L-15 (&#8211;) cysteine</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td></td>
			<td>Special order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-protected Amino acids</td>
			<td>Novabiochem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dfTAT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>model IXB1</td>
			<td>equipped with a heating stage maintained at 37 &#176;C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C humidified, 5% CO2 incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

delivery of proteins, peptides or cell-impermeable small molecules into live cells by incubation with the endosomolytic reagent dftat

Stratégies de prestation macromoléculaires utilisent généralement la voie d&#39;endocytose comme une voie d&#39;entrée cellulaire. Cependant, endosomal piégeage limite considérablement l&#39;efficacité avec laquelle macromolécules pénétrer l&#39;espace cytosolique des cellules. Récemment, nous avons contourné ce problème en identifiant le réactif dfTAT, un dimère de liaisons disulfure du peptide TAT de la tétraméthylrhodamine marqué avec un fluorophore. Nous avons généré un dimère marqué par fluorescence du peptide pénétrant dans les cellules (CPP) TAT prototypique, dfTAT, qui pénètre dans les cellules vivantes et atteint l&#39;espace cytosolique des cellules avec une efficacité particulièrement élevée. Cytosolique de livraison dfTAT est réalisé dans plusieurs lignées cellulaires, y compris des cellules primaires. En outre, la livraison n&#39;a pas d&#39;incidence sensiblement la viabilité cellulaire, la prolifération ou l&#39;expression génique. dfTAT peut délivrer de petites molécules, des peptides, des anticorps, des enzymes biologiquement actives et un facteur de transcription. Dans ce rapport, nous décrivons les protocoles impliqués dans DFTALa synthèse de T et la livraison cellulaire. Le manuscrit décrit comment contrôler la quantité de protéine délivrée à l&#39;espace cytosolique des cellules en faisant varier la quantité de protéine administrée de manière extracellulaire. Enfin, les limites actuelles de cette nouvelle technologie et les étapes impliquées dans la validation de la livraison sont discutées. Les protocoles décrits doivent être extrêmement utile pour les dosages à base de cellules ainsi que pour la manipulation ex vivo et la reprogrammation de cellules.

Afin d&#39;évaluer la différence entre fTAT et dfTAT, les cellules HeLa sont incubées pendant 1 heure avec chaque peptide pour déterminer la différence de leur localisation cellulaire. L&#39;internalisation du RPC de deux été évaluée en utilisant la microscopie de fluorescence. La figure 2 montre que fTAT (20 uM) se localise dans une distribution ponctuée. Cette distribution est en accord avec le peptide restant piégé à l&#39;intérieur des endosomes. En revanche, le signal de fluorescence ...

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Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

Livraison des protéines, des peptides ou imperméable aux cellules petites molécules dans des cellules vivantes par incubation avec le réactif dfTAT endosomolytique

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K vues.  Texas A&M University. We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky. 