This article was supported by Award Number R01GM087227 from the National Institute of General Medical Sciences, the Norman Ackerman Advanced Research Program, and the Robert A. Welch foundation (Grant A-1769).

1. SPPS: CK (TMR) TATG (fTAT) التجميعي ملاحظة: يتم إنتاج dfTAT في خطوتين: تجميع للfTAT مونومر عن طريق التخليق المرحلة الببتيد الصلبة تليها ثاني كبريتيد dimerization السندات لتشكيل dfTAT. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنتفخ 500 ملغ من حلبة أميد الراتنج MBHA في ثنائي ميثيل الفورماميد (DMF) في القياسية 50 مل سفينة SPPS لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء Fmoc deprotection التي يحتضنها الراتنج Fmoc المحمية في حل تأكسد 20٪ (20٪ تأكسد في DMF، 10 مل (0.30 ملمول). نفذ الخطوات من deprotection مرتين (1 × 5 دقائق و 1 × 15 دقيقة) مع خطوة الغسيل يستخدم DMF (الخطوة غسل يتضمن الشطف الراتنج عدة مرات مع الحجم الكلي حوالي 150 مل من DMF وإزالة المذيب عن طريق الترشيح فراغ) بين ردود الفعل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليف CK (TMR) RKKRRQRRRG (fTAT) على حلبة أميد MBHA الراتنج. استخدم ما يلي Fmoc المحمية الأحماض الأمينية: Fmoc-ليز (الإنتقالي العسكري) -OH (فقط على N-المحطة)، Fmoc-ليز (بوك) -OH، Fmoc-الغليسين-OH، Fmoc-الارجنتين (PBF) -OH، Fmoc- Gقانون الجنسية (TRT) -OH، وFmoc-السيستئين (TRT) -OH. تنفيذ رد فعل باستخدام N 2 (20 PSI) للتحريض على رد الفعل. أداء جميع ردود الفعل في RT. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ كل الأحماض الأمينية اقتران رد فعل لمدة 4 ساعة. لكل اقتران، استخدم Fmoc المحمية الأحماض الأمينية (1.2 مليمول)، N، N، N، N &#39;-Tetramethyl- O- (1 H -benzotriazol-1-يل) uronium hexafluorophosphate (HBTU) (0.44 غرام، 1.1 مليمول )، وdiisopropylethylamine (DIEA) (0.51 مل، 3.0 ملمول) المذاب في DMF. بعد اقتران 4 ساعة، ويغسل الراتنج مع DMF وتنفيذ الخطوة deprotection Fmoc كما هو موضح في الخطوة 1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر حتى سلسلة الببتيد خطية من fTAT: تم تصنيعه (الخطي سلسلة الببتيد CKRKKRRQRRRG لا TMR). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يغسل الراتنج بدقة باستخدام DMF الأول وبعد ذلك مع ثنائي كلورو ميثان (DCM). شطف الراتنج عدة مرات مع الحجم الكلي حوالي 150 مل من DMF أو DCM وإزالة المذيب عن طريق الترشيح فراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Uحد ذاته MALDI-TOF للتأكد من أن الببتيد حصلت لديه الوزن الجزيئي الصحيح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل مزيج المصفوفة بإضافة 1 ملغ من المصفوفة إلى حل مكونة من 50 ميكرولتر من 0.01٪ TFA في محلول من المياه و50 ميكرولتر من أسيتونتريل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتأكيد الخطية سلسلة الببتيد كتلة، استخدم حمض α-Cyano-4-hydroxycinnamic. تشغيل HPLC التحليلي للالببتيد الخام وجمع 50 ميكرولتر من أعلى ذروة نقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد نموذج لوحة على لوحة MALDI: إضافة 8 ميكرولتر من الببتيد إلى 2 ميكرولتر من حل مصفوفة ومكان على لوحة MALDI إلى الهواء الجاف أو على 37 درجة مئوية لوحة الحرارة. ملاحظة: من المعروف ارجينين أن تكون الأحماض الأمينية الصعب الزوجين في SPPS. تم تأسيس ناجح اقتران عن طريق إجراء اختبار كايزر 14 (اختبار على سبيل المثال، النينهيدرين). هذا الاختبار يسمح للكشف عن الأمينات الحرة التي قد تبقى. فصل على الراتنج. في حال تم الكشف عن اللون الأزرق (يدل على وجود الأمينات الحرة)، واقتران الصورةوتتكرر teps. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لCK (-NH-TMR) TATG (fTAT)، يلتصق مجموعة حماية الإنتقالي العسكري في مجموعة -amino من ليز على CK (-NH-الإنتقالي العسكري) TATG بمحلول مكون من حمض 1٪ trifluoroacetic (TFA) و 2٪ triisopropylsilane (TIS) في DCM. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما إزالة MTT مجموعة حماية من شأنه أن يؤدي إلى ظهور اللون الأصفر، واحتضان الراتنج مع 20 مل من محلول أعلاه لمدة 5 دقائق، كرر هذا حتى يتم احترام أي اللون الأصفر. غسل الراتنج مع DCM وDMF بينهما. بالإضافة إلى ذلك منذ TIS هو زبال التي من شأنها أن كنس وMTT، مرة واحدة لم يظهر اللون الأصفر في الحل في وجود MTT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حلا إضافيا مع 1٪ TFA في DCM (لا TIS) إلى الراتنج لضمان لا أكثر MTT تتم إزالة ويبقى الحل واضحة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل المكونات الثلاثة: Carboxytetramethylrhodamine (TMR)، HBTU، وDIEA (4 و 3.9 و 10 التكافؤ في احترام لكمية من الراتنج (في ملغ)) في DMF وإضافة هذا الخليطإلى الراتنج وتنفيذ O رد فعل / N باستخدام N الجاف 2 لتقديم الإثارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد Fmoc-deprotection وتصريف الأحماض الأمينية، وغسل الراتنج مع DCM واتركه حتى يجف. للانشقاق كاملة من الببتيد من راتنج، إضافة محلول يحتوي على 92.5٪ TFA 2.5٪ H 2 O، و 2.5٪، TIS، و 2.5٪ ethanedithiol (بتوقيت شرق الولايات المتحدة) (إجمالي حجم = 4 مل) إلى ببتيديل الراتنجات ل3 ساعة على RT لتحقيق deprotection العالمي والانقسام من الراتنج. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترسيب المنتجات الببتيد الخام باستخدام البارد إثيل الأثير اللامائية (ET 2 O) من خلال استنزاف الحل من الخطوة 1.6 إلى 40 مل من إت 2 O، وتدور هذه أسفل في 4 ° C و 4،000 x ج لمدة 20 - 25 دقيقة. كرر هذه الخطوة للسماح غسل الراسب مع مائي بارد إت 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend والرواسب في الماء (5 مل أو حتى يذوب تماما راسب) ويجفد. ثم resuspend والمنتجات التي تم الحصول عليها في 0.1٪ مائي TFA / الأسيتونتريل. </li></ol></li> &lt;لى&gt; إجراء تحليل HPLC مع عمود C18 التحليلي (5 ميكرون، 4 × 150 مم) لتحليل كل الببتيد. استخدام معدل التدفق من 1 مل / دقيقة، وكشف في 214 نانومتر و 550 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء HPLC شبه إعدادي على C18 10 × 250 ملم عمود لتنقية الببتيد. استخدام معدل تدفق 4 مل / دقيقة، وكشف في 214 نانومتر و 550 نانومتر. لجميع أشواط، استخدام تدرجات خطية من 0.1٪ مائي TFA (A المذيبات) و 90٪ الأسيتونتريل، 9.9٪ من المياه، و 0.1٪ TFA (المذيبات B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد الهوية الصحيحة من الببتيدات بواسطة MALDI-TOF وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة: fTAT، الكتلة المتوقعة: 2،041.17 والكتلة لاحظ: 2040.66. لاحظ 1،412.97 والكتلة: DEAC-K9، يتوقع كتلة 1،415.59. استخدام cyano-4-hydroxycinnamic مصفوفة حمض ألفا لMALDI-TOF. </li></ol> 2. الأكسدة رد فعل: الجيل dfTAT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تهوية الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ودرجة الحموضة 7.4 لمدة 1 ساعة (5 مل على الأقل للتفاعل أدناه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل fTAT (0.3 ملغ، 1.5 × 10 -4 ملمول) في آيرATED PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 (5 مل). تأكد من أن درجة الحموضة ما بين 7،0-7،5 بعد إضافة الببتيد. إن لم يكن إضافة هيدروكسيد الصوديوم (1 M، بزيادات صغيرة 1-5 ميكرولتر) لتحقيق قيمة الأس الهيدروجيني إلى ما يصل إلى 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملاحظة: الأوكسجين المذاب في برنامج تلفزيوني يعمل على أكسدة المجموعات ثيول على fTAT وتشكيل السندات ثاني كبريتيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Nutate يا رد فعل / N لتمكينه من الرد حتى الانتهاء (100٪ العائد على أساس تحليل HPLC). تنقية المنتج باستخدام عكس المرحلة HPLC وتحليل الطيف الكتلي (MALDI-TOF) كما في الخطوة 1.9. ولاحظ 4،080.34 والكتلة: الكتلة المتوقعة 4،084.21. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجفد النقي dfTAT (0.71 X10 -4 ملمول) و resuspend في 200 ميكرولتر المياه (تركيز النقي dfTAT = 356،3 ميكرومتر). </li></ol> 3. قياس تركيز dfTAT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و resuspend قسامة من المنقى dfTAT (عادة 1 ميكرولتر اعتمادا على كمية من الببتيد المنقى) في 149 ميكرولتر من 50 ملي TCEP الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملاحظة: في هذه الخطوة يتم تقليل dfTAT إلى mo لهاnomer نظيره fTAT للقضاء على التبريد الامتصاصية الذي يحدث نتيجة لقربها من fluorophore TMR في dfTAT (يتم تقليل ε معامل انقراض TMR في dfTAT بالمقارنة مع ε من TMR في خفض fTAT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للعينة للرد على ما يقرب من 20 دقيقة (HPLC التحليلية يمكن استخدامها لتأكيد تشكيل fTAT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة كافة الحل لكفيت الكوارتز وقياس الامتصاصية في 556 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام قانون بير (A = εcl: ε = 91500 M -1 سم -1) لحساب تركيز fTAT، تحديد تركيز dfTAT، وتقسيم [fTAT] من قبل اثنين. </li></ol> 4. التسليم التجارب الخلوية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور خلايا (هيلا، HDF، الخ.) في طبق في confluency من 80-90٪ (على سبيل المثال، 8 جيدا أو 24 جيدا طبق). زراعة خلايا في المتوسط ​​المناسب (على سبيل المثال، DMEM تستكمل مع 10٪ FBS والقلم / بكتيريا) حتى 80-90٪ confluency في 37 ° Cجو مرطب يحتوي على 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا ثلاث مرات (3X) مع PBS (بإضافة 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ومن ثم إزالته ثلاث مرات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل تركيز العمل 5 ميكرومتر من dfTAT عن طريق تمييع مخزون من dfTAT (في الماء) في المختبر الوطني المرجعي-15 وسائل الإعلام (ل8 طبق بشكل جيد يجب أن يكون الحجم الكلي 200 ميكرولتر). هناك تركيز 5 ميكرومتر dfTAT يؤدي إلى التنفيذ الفعال (مستوى عال من تسليم عصاري خلوي في أكثر من 90٪ من الخلايا الموجودة في طبق) في معظم أنواع الخلايا اختبار حتى الآن (الشكل 3). ومع ذلك، وتركيزات أقل أو أعلى قد يكون أكثر ملاءمة لأنواع الخلايا مع ميل ارتفاع أو انخفاض لاختراق. ملاحظة حول وسائل الإعلام: يستخدم المختبر الوطني المرجعي-15 للتسليم dfTAT لأنها لا تحتوي على السيستين التي يمكن أن تقلل من السندات ثاني كبريتيد في dfTAT. ومع ذلك، البيانات المتوفرة لدينا تشير إلى أن كلا العادي L-15 (مع السيستين) وDMEM يمكن أن تستخدم وسائل الإعلام التسليم. L-15 يحتوي على الحد من الحمض الأميني السيستين ولكن presumab السيستينلاي يتأكسد في وسائل الإعلام لتشكيل السيستين (وضعت DMEM مع السيستين). لذا يبقى dfTAT سليمة في وسائل الإعلام هذه ويعمل تسليم في بنفس الفعالية التي تم الحصول عليها مع nrL15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا مع dfTAT (5 ميكرومتر) مع أو بدون البضائع (على سبيل المثال، EGFP (10 ميكرومتر)) والحفاظ على 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة (يمكن تخفيض فترة حضانة لكن dfTAT يتطلب عادة حوالي 30-45 دقيقة للحث على تسرب endosomal ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع الهيبارين (1 ملغ / مل) في L-15 (يوصى 3 يغسل) لإزالة dfTAT بد أن الغشاء البلازمي للخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا مع وصمة عار النووية خلايا كتيمة، على سبيل المثال، Sytox الأزرق، Sytox الأخضر (2 ميكرومتر في المختبر الوطني المرجعي-15)، لتحديد ما إذا كان خطر الغشاء البلازمي للخلايا (لن تكون ملطخة الخلايا الميتة في حين أن الخلايا الحية لن) وفقا ل بروتوكول الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا صورة باستخدام مجهر مضان (100X الغمر النفط أو الهدف 20X). صورة dfTAT باستخدام فلتر RFP (خر =560 ± 20 نانومتر / م = 630 ± 35 نانومتر). ملاحظة: نجاح تسليم يؤدي إلى مضان منتشر في جميع أنحاء dfTAT الخلية (تقييم إيصال البروتين أو الببتيد من الفائدة سوف تعتمد على التطبيق). تلطيخ من الأنوية التي كتبها fTAT (المنتج انخفاض dfTAT عند الدخول عصاري خلوي) يمكن أن تستخدم كمؤشر على أن مضان الكشف هو داخل الخلايا. سوف fTAT تتحلل في غضون ساعات قليلة. عند هذه النقطة، فإن مضان من شظايا تدهور تظهر كما منقط. هذا لا ينبغي أن يكون الخلط لتوزيع منقط أن ينظر أيضا إذا بقيت dfTAT محاصرين دون جدوى داخل الإندوسومات (هذا يمكن أن يحدث إذا هي موجودة في منخفض جدا من تركيز dfTAT). </li></ol> 5. السيطرة تركيز وزارة الداخلية سلمت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد &quot;تسليم الأمثل&quot; التركيز المطلوب لتحقيق الافراج عصاري خلوي كفاءة dfTAT في نوع من الخلايا المستخدمة. أداء مضان المجهر على الخلايا المحتضنة في التزايد معتركيزات غرام من dfTAT. يتم تعريف تركيز dfTAT على النحو الأمثل وتركيز الحد الأدنى الذي يؤدي إلى مسح عصاري خلوي &quot;نزع فتيل&quot; TMR مضان في ما يقرب من 100٪ من الخلايا في الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تختلف تركيز وزارة الداخلية المستخدمة في بروتوكول التعاون الحضانة مع الحفاظ على تركيز dfTAT ثابت (على سبيل المثال، وذلك باستخدام تركيز تسليم الأمثل dfTAT ل). يمكن تغيير الوقت الحضانة إلى أقل من 1 ساعة أيضا أن يكون خيارا لتغيير كمية وزارة الداخلية تسليمها. </li></ol>

<ol>
	<li>Didenko, V. V., Ngo, H., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine+as+a+transmembrane+carrier+of+fluorescently+labeled+proteins+and+antibodies.">Polyethyleneimine as a transmembrane carrier of fluorescently labeled proteins and antibodies.</a> Anal Biochem. 344, 168-173 (2005).</li><li>Takeuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+Rapid+Cytosolic+Delivery+Using+Cell-Penetrating+Peptides+Mediated+by+Pyrenebutyrate.">Direct and Rapid Cytosolic Delivery Using Cell-Penetrating Peptides Mediated by Pyrenebutyrate.</a> ACS Chem Biol. 1, 299-303 (2006).</li><li>Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peptide+carrier+for+the+delivery+of+biologically+active+proteins+into+mammalian+cells.">A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells.</a> Nat Biotech. 19, 1173-1176 (2001).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+somatic+cells+via+TAT-mediated+protein+transduction+of+recombinant+factors.">Reprogramming of somatic cells via TAT-mediated protein transduction of recombinant factors.</a> Biomaterials. 33, 5047-5055 (2012).</li><li>Torchilin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+delivery+of+protein+and+peptide+therapeutics.">Intracellular delivery of protein and peptide therapeutics.</a> Drug Discov Today: Technol. 5, e95-e103 (2005).</li><li>Chakravarty, P., Qian, W., El-Sayed, M. A., Prausnitz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+molecules+into+cells+using+carbon+nanoparticles+activated+by+femtosecond+laser+pulses.">Delivery of molecules into cells using carbon nanoparticles activated by femtosecond laser pulses.</a> Nature nanotechnol. 5, 607-611 (2010).</li><li>Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+delivery+using+engineered+virus-like+particles.">Protein delivery using engineered virus-like particles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 16998-17003 (2011).</li><li>Pan, C., Lu, B., Chen, H., Bishop, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+human+fibroblasts+using+HIV-1+TAT+recombinant+proteins+OCT4,+SOX2,+KLF4+and+c-MYC.">Reprogramming human fibroblasts using HIV-1 TAT recombinant proteins OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC.</a> Mol Biol Rep. 37, 2117-2124 (2010).</li><li>Fittipaldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Membrane+Lipid+Rafts+Mediate+Caveolar+Endocytosis+of+HIV-1+Tat+Fusion+Proteins.">Cell Membrane Lipid Rafts Mediate Caveolar Endocytosis of HIV-1 Tat Fusion Proteins.</a> J Biol Chem. 278, 34141-34149 (2003).</li><li>Lee, Y. J., Erazo-Oliveras, A., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+macromolecules+into+live+cells+by+simple+co-incubation+with+a+peptide.">Delivery of macromolecules into live cells by simple co-incubation with a peptide.</a> Chembiochem. 11, 325-330 (2010).</li><li>Angeles-Boza, A. M., Erazo-Oliveras, A., Lee, Y. J., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+endosomolytic+reagents+by+branching+of+cell-penetrating+peptides:+tools+for+the+delivery+of+bioactive+compounds+to+live+cells+in+cis+or+trans.">Generation of endosomolytic reagents by branching of cell-penetrating peptides: tools for the delivery of bioactive compounds to live cells in cis or trans.</a> Bioconjugate chem. 21, 2164-2167 (2010).</li><li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O.">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3185-3190 (2001).</li><li>Erazo-Oliveras, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+delivery+into+live+cells+by+incubation+with+an+endosomolytic+agent.">Protein delivery into live cells by incubation with an endosomolytic agent.</a> Nat methods. 11, 861-867 (2014).</li><li>Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+test+for+detection+of+free+terminal+amino+groups+in+the+solid-phase+synthesis+of+peptides.">Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides.</a> Anal Biochem. 34, 595-598 (1970).</li><li>Muthukrishnan, N., Johnson, G. A., Lim, J., Simanek, E. E., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAT-mediated+photochemical+internalization+results+in+cell+killing+by+causing+the+release+of+calcium+into+the+cytosol+of+cells.">TAT-mediated photochemical internalization results in cell killing by causing the release of calcium into the cytosol of cells.</a> Biochim biophys acta. 1820, 1734-1743 (2012).</li><li>Lautwein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+B+lymphoblastoid+cells+contain+distinct+patterns+of+cathepsin+activity+in+endocytic+compartments+and+regulate+MHC+class+II+transport+in+a+cathepsin+S-independent+manner.">Human B lymphoblastoid cells contain distinct patterns of cathepsin activity in endocytic compartments and regulate MHC class II transport in a cathepsin S-independent manner.</a> J Leukoc Biol. 75, 844-855 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

الخلايا المستخدمة للتسليم dfTAT لا ينبغي أن تكون متموجة بشكل مفرط (&gt; 90٪ confluency) لأن هذا قد يؤثر على كفاءة التسليم. وينبغي أيضا أن تكون الخلايا السليمة: الخلايا الميتة في الثقافة يمكن أن يطلق شظايا أفكارك التي dfTAT يمكن أن تتفاعل (على سبيل المثال، الحمض النووي من ?...

<html> تسليم البروتينات والببتيدات أو خلايا غير منفذة جزيئات صغيرة في الخلايا الحية أمر مرغوب فيه في العديد من التطبيقات البيولوجية أو التكنولوجيا الحيوية (التصوير الخلوي، المقايسات الفنية، إعادة برمجة الخلايا، الخ.) 1-4. وقد سبق أن ذكرت العديد من المناهج التسليم، بما في ذلك microinjection، Electroporation لل، أو استخدام وكلاء الناقل (على سبيل المثال، الببتيدات اختراق الخلية مثل TAT، والدهون) 5-7. كل تقنية وعادة إيجابيات وسلبيات المحددة التي قد تجعل هذه النهج كافية لبعض التطبيقات ولكن ليس للآخرين. وتشمل القضايا المشتركة الكفاءة تسليم الفقيرة و / أو عدم وجود رقابة من كمية المواد يتم تسليم 8،9، سمية أو ضار تأثير الفسيولوجية 10،11، عدم وجود رقابة الزمنية، والتسليم في خلايا قليلة ولكن ليس في السكان (على سبيل المثال، microinjection) 12، ومعقدة الاقتران الكيميائية أو صياغة خطط 11. <html> الصورة = &quot;jove_content&quot;&gt; في الآونة الأخيرة، قمنا بتطوير استراتيجية تسليم الرواية التي تلتف حول هذه القيود. وتعتمد هذه الاستراتيجية على الببتيد اسمه dfTAT (ديمر TAT الفلورسنت) 13. مشتق dfTAT من الببتيد نعرف جيدا اختراق خلايا (CPP) TAT. dfTAT يحتوي على اثنين من كبريتيد العبودي نسخ من TAT المسمى مع tetramethylrhodamine fluorophore. وعلى الرغم من أوجه الشبه بينهما، TAT وdfTAT تختلف اختلافا كبيرا في النشاط. وعادة ما المنضوية TAT في الخلايا عن طريق الإلتقام. ولكن هذا CPP لا يزال محتجزا في الغالب داخل الإندوسومات (هذا يؤدي عادة إلى توزيع منقط من الببتيد داخل الخلايا عندما فحصت بواسطة المجهر مضان). مثل TAT، وendocytosed dfTAT بكفاءة عن طريق الخلايا. ومع ذلك، dfTAT لا البقاء محاصرين داخل الإندوسومات. بدلا من ذلك، انها تتوسط تسرب endosomal بطريقة غير فعالة للغاية. النشاط endosomolytic من dfTAT ثم يمكن استغلاله لتقديم الجزيئات عن طريق فحص بسيط الحضانة. ntent &quot;&gt; والفهم الحالي لعملية التسليم على النحو التالي. dfTAT يدفع macropinocytosis. ونتيجة لذلك، والخلايا المحتضنة مع dfTAT يستغرق بروتينات قابلة للذوبان، والببتيدات، أو جزيئات صغيرة (جزيئات من الفائدة، وزارة الداخلية) موجودة في وسائل الإعلام من قبل المائع- الإلتقام (انظر الشكل 1). التفاعلات بين dfTAT وزارة الداخلية ليست ضرورية ما دام كل حركة المرور الكيانات معا ضمن مسار التقامي. وتصل dfTAT عتبة معينة داخل تجويف العضيات التقامي، فإنها تعرب عن النشاط تسرب endosomal لها (التفاصيل الجزيئية يبقى أن يميز تماما). مضمون لمعة من العضيات تتسرب منها المياه، وبالتالي فإن وزارة الداخلية، ثم يتم إطلاقها في الخلايا، وبالتالي هذا النهج غير مريحة للغاية كما ليس هناك حاجة لتصريف الافعال أو صياغة خطط مع وزارة الداخلية. وعلاوة على ذلك، لأن dfTAT هو لا تعديل وزارة الداخلية مباشرة، فإنه ينبغي أيضا أن لا تتداخل مع وظيفة موييس مرة واحدة ويتحقق تسليم داخل الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تركيزتستخدم dfTAT التسليم مستقل من أن من وزارة الداخلية في وسائل الإعلام. على سبيل المثال، تركيز dfTAT يمكن أن تظل ثابتة بين التجارب المختلفة لضمان الكفاءة استنساخه في تسرب endosomal. في المقابل، وتركيز وزارة الداخلية في وسائل الإعلام يمكن أن تتغير تدريجيا لتحقيق المستويات المنشودة من وزارة الداخلية تسليمها في العصارة الخلوية. ارتفاع endosomal كفاءة تسرب تحقق مع dfTAT هي غير ضارة بشكل ملحوظ إلى العديد من الخلايا اختبار حتى الآن. هذا هو مفاجأة لأن العضيات التقامي هي عنصر هام من عناصر الخلايا ويتوقع المرء أن تسرب مثيرة بوساطة dfTAT سيرافق الاستجابات الخلوية الضارة. ومع ذلك، وتتكاثر الخلايا المعالجة في نفس معدل الخلايا غير المعالجة وعدم عرض أي تغييرات كبيرة في Transcriptome على الخاصة بهم. وعلاوة على ذلك، يمكن تكرار التسليم في غضون دقائق مع كفاءات تسليم استنساخه، مشيرا إلى أن الخلايا إما أن يتسامح أو التعافي من عملية التسليم دون أن تفقدقدرتها على الإلتقام أو تسرب endosomal. الاستجابات الخلوية خفية قد يتحقق أثناء الولادة dfTAT والتفاصيل الجزيئية ما يمكن أن تبقى هذه الردود من يكتشفها. بعد، من خلال الجمع بين الكفاءة العالية، والراحة من البروتوكولات، وعدم وجود سمية، يجب أن هذا النهج تسليم يكون مفيدا على الفور في العديد من التطبيقات المستندة إلى الخلية. وتهدف البروتوكولات الواردة في هذه الوثيقة إلى جعل هذه التكنولوجيا في متناول المجتمع البحثي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Heparin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CAS 9041-08-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nrL15 L-15 (&#8211;) cysteine</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td></td>
			<td>Special order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-protected Amino acids</td>
			<td>Novabiochem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dfTAT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>model IXB1</td>
			<td>equipped with a heating stage maintained at 37 &#176;C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C humidified, 5% CO2 incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

delivery of proteins, peptides or cell-impermeable small molecules into live cells by incubation with the endosomolytic reagent dftat

استراتيجيات تسليم الجزيئات عادة الاستفادة من مسار التقامي كطريق من دخول الخلوية. ومع ذلك، endosomal انحباس يحد بشدة من الكفاءة التي الجزيئات تخترق الفضاء عصاري خلوي من الخلايا. مؤخرا، قمنا التحايل على هذه المشكلة عن طريق تحديد كاشف dfTAT، وديمر السندات ثاني كبريتيد من TAT الببتيد المسمى مع tetramethylrhodamine fluorophore. لقد ولدت ديمر fluorescently المسمى من تنميط الببتيد اختراق الخلية (CPP) TAT، dfTAT، التي تخترق الخلايا الحية وتصل مساحة عصاري خلوي من الخلايا مع كفاءة عالية للغاية. ويتحقق تسليم عصاري خلوي من dfTAT في خطوط الخلايا متعددة، بما في ذلك الخلايا الأولية. وعلاوة على ذلك، والتسليم لا يؤثر بشكل ملحوظ بقاء الخلية، وانتشار أو التعبير الجيني. dfTAT يمكن أن يحقق الجزيئات، والببتيدات، والأجسام المضادة، والانزيمات النشطة بيولوجيا صغيرة وعامل النسخ. في هذا التقرير، وصفنا البروتوكولات تشارك في dfTAالتوليف T والتسليم الخلوية. يصف المخطوطة كيفية السيطرة على كمية من البروتين تسليمها إلى الفضاء عصاري خلوي الخلايا من خلال تغيير كمية البروتين تدار خارج الخلية. وأخيرا، تناقش القيود الحالية من هذه التكنولوجيا الجديدة والخطوات المتبعة في التحقق من صحة التسليم. يجب أن تكون البروتوكولات المذكورة مفيدة للغاية لفحوصات خلية القاعدة فضلا عن التلاعب فيفو السابقين وإعادة برمجة الخلايا.

لتقييم الفرق بين fTAT وdfTAT، يتم تحضين الخلايا هيلا لمدة 1 ساعة مع كل الببتيد لتحديد الفرق في توطين الخلوي. تم تقييم واستيعاب اثنين CPP باستخدام المجهر مضان. ويبين الشكل 2 أن fTAT (20 ميكرومتر) يموضع في توزيع منقط. هذا التوزيع يتسق مع الببتيد المتبقية محاصر داخل الإندو...

Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT at JoVE.com

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

تسليم والبروتينات، والببتيدات أو خلية بردة الجزيئات الصغيرة إلى الخلايا الحية التي الحضانة مع Endosomolytic الكاشف dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

delivery-proteins-peptides-or-cell-impermeable-small-molecules-into

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K Views.  Texas A&M University. We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky. 

Video: Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

تصنيع أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية الدنا للكشف Reagentless من الأحماض النووية والبروتينات والجزيئات الصغيرة

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

تعيش خلية من خلايا التصوير تعرب عن ترحيل البروتينات Fluorescently الموسومة في مصفوفة ثلاثية الأبعاد

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular choice for drug delivery applications, particularly since it is already FDA-approved for use in humans in the form of resorbable sutures. Hydrophobic and hydrophilic drugs are encapsulated in PLGA particles via single- or double-emulsion. Briefly, the drug is dissolved with polymer or emulsified with polymer in an organic phase that is then emulsified with the aqueous phase. After the solvent has evaporated, particles are washed and collected via centrifugation for lyophilization and long term storage. PLGA degrades slowly via hydrolysis in aqueous environments, and encapsulated agents are released over a period of weeks to months. Although PLGA is a material that possesses many advantages for drug delivery, reproducible formation of nanoparticles can be challenging; considerable variability is introduced by the use of different equipment, reagents batch, and precise method of emulsification. Here, we describe in great detail the formation and characterization of microparticles and nanoparticles formed by single- or double-emulsion using the emulsifying agent vitamin E-TPGS. Particle morphology and size are determined with scanning electron microscopy (SEM). We provide representative SEM images for nanoparticles produced with varying emulsifier concentration, as well as examples of imaging artifacts and failed emulsifications. This protocol can be readily adapted to use alternative emulsifiers (e.g. poly(vinyl alcohol), PVA) or solvents (e.g.&#160;dichloromethane, DCM).

We describe the production and characterization of nanoparticles and microparticles composed of poly(lactic-co-glycolic acid) using vitamin E-TPGS as an emulsifier. By varying formulation parameters such as the concentration of emulsifier, it is possible to produce nanoparticles with mean diameters ranging from 220 nm to&#160;1.98 &#181;m.

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulation من واحدة RNA الجزيئات بواسطة الملقط البصرية

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers that exist in biological fluids cannot be easily detected with mass spectrometry or immunoassays because they are present in very low concentration, are labile, and are often masked by high-abundance proteins such as albumin or immunoglobulin. Bait containing poly(N-isopropylacrylamide) (NIPAm) based nanoparticles are able to overcome these physiological barriers. In one step they are able to capture, concentrate and preserve biomarkers from body fluids. Low-molecular weight analytes enter the core of the nanoparticle and are captured by different organic chemical dyes, which act as high affinity protein baits. The nanoparticles are able to concentrate the proteins of interest by several orders of magnitude. This concentration factor is sufficient to increase the protein level such that the proteins are within the detection limit of current mass spectrometers, western blotting, and immunoassays. Nanoparticles can be incubated with a plethora of biological fluids and they are able to greatly enrich the concentration of low-molecular weight proteins and peptides while excluding albumin and other high-molecular weight proteins. Our data show that a 10,000 fold amplification in the concentration of a particular analyte can be achieved, enabling mass spectrometry and immunoassays to detect previously undetectable biomarkers.

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

هيدروجيل الجسيمات النانوية حصاد البلازما أو البول للكشف عن وفرة البروتينات منخفضة

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

في المختبر تخلل من Ferritins تحميل FITC-عبر الفأر حاجز الدم في الدماغ: نموذج لدراسة تسليم Nanoformulated الجزيئات

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors within the medium to control cell behavior. However, soluble additions cannot mimic certain signaling motifs, such as matrix-bound growth factors, cell-cell signaling, and spatial biochemical cues, which are common influences on cells. Furthermore, biophysical properties of the matrix, such as substrate stiffness, play important roles in cell fate, which is not easily manipulated using conventional cell culturing practices. In this method, we describe a straightforward protocol to provide patterned bioactive proteins on synthetic polyethylene glycol (PEG) hydrogels using photochemistry. This platform allows for the independent control of substrate stiffness and spatial biochemical cues. These hydrogels can achieve a large range of physiologically relevant stiffness values. Additionally, the surfaces of these hydrogels can be photopatterned with bioactive peptides or proteins via thiol-ene click chemistry reactions. These methods have been optimized to retain protein function after surface immobilization. This is a versatile protocol that can be applied to any protein or peptide of interest to create a variety of patterns. Finally, cells seeded onto the surfaces of these bioactive hydrogels can be monitored over time as they respond to spatially specific signals.

In this method, we use photopolymerization and click chemistry techniques to create protein or peptide patterns on the surface of polyethylene glycol (PEG) hydrogels, providing immobilized bioactive signals for the study of cellular responses in vitro.

الزخرفة البروتينات النشطة بيولوجيا أو الببتيدات على استخدام الكيمياء الضوئية للتطبيقات البيولوجية المائية

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

تطوير أجهزة موائع جزيئية لدراسة قدرة استطالة نصيحة زراعة الخلايا النباتية في المساحات الصغيرة للغاية

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all variations are based on the 20 canonical amino acids (cAAs). As a way to introduce additional physicochemical properties into polypeptides, the incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) is increasingly used in protein engineering. Due to their relatively short length, the modification of ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides by ncAAs is particularly attractive. New functionalities and chemical handles can be generated by specific modifications of individual residues. The selective pressure incorporation (SPI) method utilizes auxotrophic host strains that are deprived of an essential amino acid in chemically defined growth media. Several structurally and chemically similar amino acid analogs can then be activated by the corresponding aminoacyl-tRNA synthetase and provide residue-specific cAA(s) &#8594; ncAA(s) substitutions in the target peptide or protein sequence. Although, in the context of the SPI method, ncAAs are also incorporated into the host proteome during the phase of recombinant gene expression, the majority of the cell&#39;s resources are assigned to the expression of the target gene. This enables efficient residue-specific incorporation of ncAAs often accompanied with high amounts of modified target. The presented work describes the in vivo incorporation of six proline analogs into the antimicrobial peptide nisin, a lantibiotic naturally produced by Lactococcus lactis. Antimicrobial properties of nisin can be changed and further expanded during its fermentation and expression in auxotrophic Escherichia coli strains in defined growth media. Thereby, the effects of residue-specific replacement of cAAs with ncAAs can deliver changes in antimicrobial activity and specificity. Antimicrobial activity assays and fluorescence microscopy are used to test the new nisin variants for growth inhibition of a Gram-positive Lactococcus lactis indicator strain. Mass spectroscopy is used to confirm ncAA incorporation in bioactive nisin variants.

The protocol presents the Escherichia coli-based selective pressure incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) into the lactococcal antimicrobial peptide nisin. Its properties can be changed during recombinant expression via substitution with desired ncAAs in defined growth media. Resulting changes in bioactivity are mapped by growth inhibition assays and fluorescence microscopy.

مضادات الميكروبات الببتيدات ينتجها إدماج الضغط الانتقائي من الأحماض الأمينية غير متعارف عليه

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different infectious diseases. In this article we demonstrate a method to produce a SAPN core containing a six-helix bundle (SHB) assembly that is capable of presenting antigens in a trimeric conformation. We describe the expression of the SHB-SAPN in an E. coli system, as well as the necessary protein purification steps. We included an isopropanol wash step to reduce the residual bacterial lipopolysaccharide. As an indication of the protein identity and purity, the protein reacted with known monoclonal antibodies in Western blot analyses. After refolding, the size of the particles fell in the expected range (20 to 100 nm), which was confirmed by dynamic light scattering, nanoparticle tracking analysis, and transmission electron microscopy. The methodology described here is optimized for the SHB-SAPN, however, with only slight modifications it can be applied to other SAPN constructs. This method is also easily transferable to large scale production for GMP manufacturing for human vaccines.

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

A detailed method is provided here describing the purification, refolding, and characterization of self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) for use in vaccine development.

إنتاج E.القولونية - أعرب الذاتي تجميع البروتين الجسيمات النانوية لللقاحات التي تتطلب عرض الإبإبيلة الانتهازية

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...