This article was supported by Award Number R01GM087227 from the National Institute of General Medical Sciences, the Norman Ackerman Advanced Research Program, and the Robert A. Welch foundation (Grant A-1769).

1. SPPS: CK (TMR) TATG (fTAT) التجميعي ملاحظة: يتم إنتاج dfTAT في خطوتين: تجميع للfTAT مونومر عن طريق التخليق المرحلة الببتيد الصلبة تليها ثاني كبريتيد dimerization السندات لتشكيل dfTAT. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنتفخ 500 ملغ من حلبة أميد الراتنج MBHA في ثنائي ميثيل الفورماميد (DMF) في القياسية 50 مل سفينة SPPS لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء Fmoc deprotection التي يحتضنها الراتنج Fmoc المحمية في حل تأكسد 20٪ (20٪ تأكسد في DMF، 10 مل (0.30 ملمول). نفذ الخطوات من deprotection مرتين (1 × 5 دقائق و 1 × 15 دقيقة) مع خطوة الغسيل يستخدم DMF (الخطوة غسل يتضمن الشطف الراتنج عدة مرات مع الحجم الكلي حوالي 150 مل من DMF وإزالة المذيب عن طريق الترشيح فراغ) بين ردود الفعل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليف CK (TMR) RKKRRQRRRG (fTAT) على حلبة أميد MBHA الراتنج. استخدم ما يلي Fmoc المحمية الأحماض الأمينية: Fmoc-ليز (الإنتقالي العسكري) -OH (فقط على N-المحطة)، Fmoc-ليز (بوك) -OH، Fmoc-الغليسين-OH، Fmoc-الارجنتين (PBF) -OH، Fmoc- Gقانون الجنسية (TRT) -OH، وFmoc-السيستئين (TRT) -OH. تنفيذ رد فعل باستخدام N 2 (20 PSI) للتحريض على رد الفعل. أداء جميع ردود الفعل في RT. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ كل الأحماض الأمينية اقتران رد فعل لمدة 4 ساعة. لكل اقتران، استخدم Fmoc المحمية الأحماض الأمينية (1.2 مليمول)، N، N، N، N &#39;-Tetramethyl- O- (1 H -benzotriazol-1-يل) uronium hexafluorophosphate (HBTU) (0.44 غرام، 1.1 مليمول )، وdiisopropylethylamine (DIEA) (0.51 مل، 3.0 ملمول) المذاب في DMF. بعد اقتران 4 ساعة، ويغسل الراتنج مع DMF وتنفيذ الخطوة deprotection Fmoc كما هو موضح في الخطوة 1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر حتى سلسلة الببتيد خطية من fTAT: تم تصنيعه (الخطي سلسلة الببتيد CKRKKRRQRRRG لا TMR). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يغسل الراتنج بدقة باستخدام DMF الأول وبعد ذلك مع ثنائي كلورو ميثان (DCM). شطف الراتنج عدة مرات مع الحجم الكلي حوالي 150 مل من DMF أو DCM وإزالة المذيب عن طريق الترشيح فراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Uحد ذاته MALDI-TOF للتأكد من أن الببتيد حصلت لديه الوزن الجزيئي الصحيح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل مزيج المصفوفة بإضافة 1 ملغ من المصفوفة إلى حل مكونة من 50 ميكرولتر من 0.01٪ TFA في محلول من المياه و50 ميكرولتر من أسيتونتريل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتأكيد الخطية سلسلة الببتيد كتلة، استخدم حمض α-Cyano-4-hydroxycinnamic. تشغيل HPLC التحليلي للالببتيد الخام وجمع 50 ميكرولتر من أعلى ذروة نقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد نموذج لوحة على لوحة MALDI: إضافة 8 ميكرولتر من الببتيد إلى 2 ميكرولتر من حل مصفوفة ومكان على لوحة MALDI إلى الهواء الجاف أو على 37 درجة مئوية لوحة الحرارة. ملاحظة: من المعروف ارجينين أن تكون الأحماض الأمينية الصعب الزوجين في SPPS. تم تأسيس ناجح اقتران عن طريق إجراء اختبار كايزر 14 (اختبار على سبيل المثال، النينهيدرين). هذا الاختبار يسمح للكشف عن الأمينات الحرة التي قد تبقى. فصل على الراتنج. في حال تم الكشف عن اللون الأزرق (يدل على وجود الأمينات الحرة)، واقتران الصورةوتتكرر teps. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لCK (-NH-TMR) TATG (fTAT)، يلتصق مجموعة حماية الإنتقالي العسكري في مجموعة -amino من ليز على CK (-NH-الإنتقالي العسكري) TATG بمحلول مكون من حمض 1٪ trifluoroacetic (TFA) و 2٪ triisopropylsilane (TIS) في DCM. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما إزالة MTT مجموعة حماية من شأنه أن يؤدي إلى ظهور اللون الأصفر، واحتضان الراتنج مع 20 مل من محلول أعلاه لمدة 5 دقائق، كرر هذا حتى يتم احترام أي اللون الأصفر. غسل الراتنج مع DCM وDMF بينهما. بالإضافة إلى ذلك منذ TIS هو زبال التي من شأنها أن كنس وMTT، مرة واحدة لم يظهر اللون الأصفر في الحل في وجود MTT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حلا إضافيا مع 1٪ TFA في DCM (لا TIS) إلى الراتنج لضمان لا أكثر MTT تتم إزالة ويبقى الحل واضحة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل المكونات الثلاثة: Carboxytetramethylrhodamine (TMR)، HBTU، وDIEA (4 و 3.9 و 10 التكافؤ في احترام لكمية من الراتنج (في ملغ)) في DMF وإضافة هذا الخليطإلى الراتنج وتنفيذ O رد فعل / N باستخدام N الجاف 2 لتقديم الإثارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد Fmoc-deprotection وتصريف الأحماض الأمينية، وغسل الراتنج مع DCM واتركه حتى يجف. للانشقاق كاملة من الببتيد من راتنج، إضافة محلول يحتوي على 92.5٪ TFA 2.5٪ H 2 O، و 2.5٪، TIS، و 2.5٪ ethanedithiol (بتوقيت شرق الولايات المتحدة) (إجمالي حجم = 4 مل) إلى ببتيديل الراتنجات ل3 ساعة على RT لتحقيق deprotection العالمي والانقسام من الراتنج. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترسيب المنتجات الببتيد الخام باستخدام البارد إثيل الأثير اللامائية (ET 2 O) من خلال استنزاف الحل من الخطوة 1.6 إلى 40 مل من إت 2 O، وتدور هذه أسفل في 4 ° C و 4،000 x ج لمدة 20 - 25 دقيقة. كرر هذه الخطوة للسماح غسل الراسب مع مائي بارد إت 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend والرواسب في الماء (5 مل أو حتى يذوب تماما راسب) ويجفد. ثم resuspend والمنتجات التي تم الحصول عليها في 0.1٪ مائي TFA / الأسيتونتريل. </li></ol></li> &lt;لى&gt; إجراء تحليل HPLC مع عمود C18 التحليلي (5 ميكرون، 4 × 150 مم) لتحليل كل الببتيد. استخدام معدل التدفق من 1 مل / دقيقة، وكشف في 214 نانومتر و 550 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء HPLC شبه إعدادي على C18 10 × 250 ملم عمود لتنقية الببتيد. استخدام معدل تدفق 4 مل / دقيقة، وكشف في 214 نانومتر و 550 نانومتر. لجميع أشواط، استخدام تدرجات خطية من 0.1٪ مائي TFA (A المذيبات) و 90٪ الأسيتونتريل، 9.9٪ من المياه، و 0.1٪ TFA (المذيبات B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد الهوية الصحيحة من الببتيدات بواسطة MALDI-TOF وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة: fTAT، الكتلة المتوقعة: 2،041.17 والكتلة لاحظ: 2040.66. لاحظ 1،412.97 والكتلة: DEAC-K9، يتوقع كتلة 1،415.59. استخدام cyano-4-hydroxycinnamic مصفوفة حمض ألفا لMALDI-TOF. </li></ol> 2. الأكسدة رد فعل: الجيل dfTAT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تهوية الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ودرجة الحموضة 7.4 لمدة 1 ساعة (5 مل على الأقل للتفاعل أدناه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل fTAT (0.3 ملغ، 1.5 × 10 -4 ملمول) في آيرATED PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 (5 مل). تأكد من أن درجة الحموضة ما بين 7،0-7،5 بعد إضافة الببتيد. إن لم يكن إضافة هيدروكسيد الصوديوم (1 M، بزيادات صغيرة 1-5 ميكرولتر) لتحقيق قيمة الأس الهيدروجيني إلى ما يصل إلى 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملاحظة: الأوكسجين المذاب في برنامج تلفزيوني يعمل على أكسدة المجموعات ثيول على fTAT وتشكيل السندات ثاني كبريتيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Nutate يا رد فعل / N لتمكينه من الرد حتى الانتهاء (100٪ العائد على أساس تحليل HPLC). تنقية المنتج باستخدام عكس المرحلة HPLC وتحليل الطيف الكتلي (MALDI-TOF) كما في الخطوة 1.9. ولاحظ 4،080.34 والكتلة: الكتلة المتوقعة 4،084.21. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجفد النقي dfTAT (0.71 X10 -4 ملمول) و resuspend في 200 ميكرولتر المياه (تركيز النقي dfTAT = 356،3 ميكرومتر). </li></ol> 3. قياس تركيز dfTAT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و resuspend قسامة من المنقى dfTAT (عادة 1 ميكرولتر اعتمادا على كمية من الببتيد المنقى) في 149 ميكرولتر من 50 ملي TCEP الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملاحظة: في هذه الخطوة يتم تقليل dfTAT إلى mo لهاnomer نظيره fTAT للقضاء على التبريد الامتصاصية الذي يحدث نتيجة لقربها من fluorophore TMR في dfTAT (يتم تقليل ε معامل انقراض TMR في dfTAT بالمقارنة مع ε من TMR في خفض fTAT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للعينة للرد على ما يقرب من 20 دقيقة (HPLC التحليلية يمكن استخدامها لتأكيد تشكيل fTAT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة كافة الحل لكفيت الكوارتز وقياس الامتصاصية في 556 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام قانون بير (A = εcl: ε = 91500 M -1 سم -1) لحساب تركيز fTAT، تحديد تركيز dfTAT، وتقسيم [fTAT] من قبل اثنين. </li></ol> 4. التسليم التجارب الخلوية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور خلايا (هيلا، HDF، الخ.) في طبق في confluency من 80-90٪ (على سبيل المثال، 8 جيدا أو 24 جيدا طبق). زراعة خلايا في المتوسط ​​المناسب (على سبيل المثال، DMEM تستكمل مع 10٪ FBS والقلم / بكتيريا) حتى 80-90٪ confluency في 37 ° Cجو مرطب يحتوي على 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا ثلاث مرات (3X) مع PBS (بإضافة 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ومن ثم إزالته ثلاث مرات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل تركيز العمل 5 ميكرومتر من dfTAT عن طريق تمييع مخزون من dfTAT (في الماء) في المختبر الوطني المرجعي-15 وسائل الإعلام (ل8 طبق بشكل جيد يجب أن يكون الحجم الكلي 200 ميكرولتر). هناك تركيز 5 ميكرومتر dfTAT يؤدي إلى التنفيذ الفعال (مستوى عال من تسليم عصاري خلوي في أكثر من 90٪ من الخلايا الموجودة في طبق) في معظم أنواع الخلايا اختبار حتى الآن (الشكل 3). ومع ذلك، وتركيزات أقل أو أعلى قد يكون أكثر ملاءمة لأنواع الخلايا مع ميل ارتفاع أو انخفاض لاختراق. ملاحظة حول وسائل الإعلام: يستخدم المختبر الوطني المرجعي-15 للتسليم dfTAT لأنها لا تحتوي على السيستين التي يمكن أن تقلل من السندات ثاني كبريتيد في dfTAT. ومع ذلك، البيانات المتوفرة لدينا تشير إلى أن كلا العادي L-15 (مع السيستين) وDMEM يمكن أن تستخدم وسائل الإعلام التسليم. L-15 يحتوي على الحد من الحمض الأميني السيستين ولكن presumab السيستينلاي يتأكسد في وسائل الإعلام لتشكيل السيستين (وضعت DMEM مع السيستين). لذا يبقى dfTAT سليمة في وسائل الإعلام هذه ويعمل تسليم في بنفس الفعالية التي تم الحصول عليها مع nrL15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا مع dfTAT (5 ميكرومتر) مع أو بدون البضائع (على سبيل المثال، EGFP (10 ميكرومتر)) والحفاظ على 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة (يمكن تخفيض فترة حضانة لكن dfTAT يتطلب عادة حوالي 30-45 دقيقة للحث على تسرب endosomal ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع الهيبارين (1 ملغ / مل) في L-15 (يوصى 3 يغسل) لإزالة dfTAT بد أن الغشاء البلازمي للخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا مع وصمة عار النووية خلايا كتيمة، على سبيل المثال، Sytox الأزرق، Sytox الأخضر (2 ميكرومتر في المختبر الوطني المرجعي-15)، لتحديد ما إذا كان خطر الغشاء البلازمي للخلايا (لن تكون ملطخة الخلايا الميتة في حين أن الخلايا الحية لن) وفقا ل بروتوكول الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا صورة باستخدام مجهر مضان (100X الغمر النفط أو الهدف 20X). صورة dfTAT باستخدام فلتر RFP (خر =560 ± 20 نانومتر / م = 630 ± 35 نانومتر). ملاحظة: نجاح تسليم يؤدي إلى مضان منتشر في جميع أنحاء dfTAT الخلية (تقييم إيصال البروتين أو الببتيد من الفائدة سوف تعتمد على التطبيق). تلطيخ من الأنوية التي كتبها fTAT (المنتج انخفاض dfTAT عند الدخول عصاري خلوي) يمكن أن تستخدم كمؤشر على أن مضان الكشف هو داخل الخلايا. سوف fTAT تتحلل في غضون ساعات قليلة. عند هذه النقطة، فإن مضان من شظايا تدهور تظهر كما منقط. هذا لا ينبغي أن يكون الخلط لتوزيع منقط أن ينظر أيضا إذا بقيت dfTAT محاصرين دون جدوى داخل الإندوسومات (هذا يمكن أن يحدث إذا هي موجودة في منخفض جدا من تركيز dfTAT). </li></ol> 5. السيطرة تركيز وزارة الداخلية سلمت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد &quot;تسليم الأمثل&quot; التركيز المطلوب لتحقيق الافراج عصاري خلوي كفاءة dfTAT في نوع من الخلايا المستخدمة. أداء مضان المجهر على الخلايا المحتضنة في التزايد معتركيزات غرام من dfTAT. يتم تعريف تركيز dfTAT على النحو الأمثل وتركيز الحد الأدنى الذي يؤدي إلى مسح عصاري خلوي &quot;نزع فتيل&quot; TMR مضان في ما يقرب من 100٪ من الخلايا في الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تختلف تركيز وزارة الداخلية المستخدمة في بروتوكول التعاون الحضانة مع الحفاظ على تركيز dfTAT ثابت (على سبيل المثال، وذلك باستخدام تركيز تسليم الأمثل dfTAT ل). يمكن تغيير الوقت الحضانة إلى أقل من 1 ساعة أيضا أن يكون خيارا لتغيير كمية وزارة الداخلية تسليمها. </li></ol>

<ol>
	<li>Didenko, V. V., Ngo, H., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine+as+a+transmembrane+carrier+of+fluorescently+labeled+proteins+and+antibodies.">Polyethyleneimine as a transmembrane carrier of fluorescently labeled proteins and antibodies.</a> Anal Biochem. 344, 168-173 (2005).</li><li>Takeuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+Rapid+Cytosolic+Delivery+Using+Cell-Penetrating+Peptides+Mediated+by+Pyrenebutyrate.">Direct and Rapid Cytosolic Delivery Using Cell-Penetrating Peptides Mediated by Pyrenebutyrate.</a> ACS Chem Biol. 1, 299-303 (2006).</li><li>Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peptide+carrier+for+the+delivery+of+biologically+active+proteins+into+mammalian+cells.">A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells.</a> Nat Biotech. 19, 1173-1176 (2001).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+somatic+cells+via+TAT-mediated+protein+transduction+of+recombinant+factors.">Reprogramming of somatic cells via TAT-mediated protein transduction of recombinant factors.</a> Biomaterials. 33, 5047-5055 (2012).</li><li>Torchilin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+delivery+of+protein+and+peptide+therapeutics.">Intracellular delivery of protein and peptide therapeutics.</a> Drug Discov Today: Technol. 5, e95-e103 (2005).</li><li>Chakravarty, P., Qian, W., El-Sayed, M. A., Prausnitz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+molecules+into+cells+using+carbon+nanoparticles+activated+by+femtosecond+laser+pulses.">Delivery of molecules into cells using carbon nanoparticles activated by femtosecond laser pulses.</a> Nature nanotechnol. 5, 607-611 (2010).</li><li>Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+delivery+using+engineered+virus-like+particles.">Protein delivery using engineered virus-like particles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 16998-17003 (2011).</li><li>Pan, C., Lu, B., Chen, H., Bishop, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+human+fibroblasts+using+HIV-1+TAT+recombinant+proteins+OCT4,+SOX2,+KLF4+and+c-MYC.">Reprogramming human fibroblasts using HIV-1 TAT recombinant proteins OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC.</a> Mol Biol Rep. 37, 2117-2124 (2010).</li><li>Fittipaldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Membrane+Lipid+Rafts+Mediate+Caveolar+Endocytosis+of+HIV-1+Tat+Fusion+Proteins.">Cell Membrane Lipid Rafts Mediate Caveolar Endocytosis of HIV-1 Tat Fusion Proteins.</a> J Biol Chem. 278, 34141-34149 (2003).</li><li>Lee, Y. J., Erazo-Oliveras, A., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+macromolecules+into+live+cells+by+simple+co-incubation+with+a+peptide.">Delivery of macromolecules into live cells by simple co-incubation with a peptide.</a> Chembiochem. 11, 325-330 (2010).</li><li>Angeles-Boza, A. M., Erazo-Oliveras, A., Lee, Y. J., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+endosomolytic+reagents+by+branching+of+cell-penetrating+peptides:+tools+for+the+delivery+of+bioactive+compounds+to+live+cells+in+cis+or+trans.">Generation of endosomolytic reagents by branching of cell-penetrating peptides: tools for the delivery of bioactive compounds to live cells in cis or trans.</a> Bioconjugate chem. 21, 2164-2167 (2010).</li><li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O.">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3185-3190 (2001).</li><li>Erazo-Oliveras, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+delivery+into+live+cells+by+incubation+with+an+endosomolytic+agent.">Protein delivery into live cells by incubation with an endosomolytic agent.</a> Nat methods. 11, 861-867 (2014).</li><li>Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+test+for+detection+of+free+terminal+amino+groups+in+the+solid-phase+synthesis+of+peptides.">Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides.</a> Anal Biochem. 34, 595-598 (1970).</li><li>Muthukrishnan, N., Johnson, G. A., Lim, J., Simanek, E. E., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAT-mediated+photochemical+internalization+results+in+cell+killing+by+causing+the+release+of+calcium+into+the+cytosol+of+cells.">TAT-mediated photochemical internalization results in cell killing by causing the release of calcium into the cytosol of cells.</a> Biochim biophys acta. 1820, 1734-1743 (2012).</li><li>Lautwein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+B+lymphoblastoid+cells+contain+distinct+patterns+of+cathepsin+activity+in+endocytic+compartments+and+regulate+MHC+class+II+transport+in+a+cathepsin+S-independent+manner.">Human B lymphoblastoid cells contain distinct patterns of cathepsin activity in endocytic compartments and regulate MHC class II transport in a cathepsin S-independent manner.</a> J Leukoc Biol. 75, 844-855 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

الخلايا المستخدمة للتسليم dfTAT لا ينبغي أن تكون متموجة بشكل مفرط (&gt; 90٪ confluency) لأن هذا قد يؤثر على كفاءة التسليم. وينبغي أيضا أن تكون الخلايا السليمة: الخلايا الميتة في الثقافة يمكن أن يطلق شظايا أفكارك التي dfTAT يمكن أن تتفاعل (على سبيل المثال، الحمض النووي من ?...

<html> تسليم البروتينات والببتيدات أو خلايا غير منفذة جزيئات صغيرة في الخلايا الحية أمر مرغوب فيه في العديد من التطبيقات البيولوجية أو التكنولوجيا الحيوية (التصوير الخلوي، المقايسات الفنية، إعادة برمجة الخلايا، الخ.) 1-4. وقد سبق أن ذكرت العديد من المناهج التسليم، بما في ذلك microinjection، Electroporation لل، أو استخدام وكلاء الناقل (على سبيل المثال، الببتيدات اختراق الخلية مثل TAT، والدهون) 5-7. كل تقنية وعادة إيجابيات وسلبيات المحددة التي قد تجعل هذه النهج كافية لبعض التطبيقات ولكن ليس للآخرين. وتشمل القضايا المشتركة الكفاءة تسليم الفقيرة و / أو عدم وجود رقابة من كمية المواد يتم تسليم 8،9، سمية أو ضار تأثير الفسيولوجية 10،11، عدم وجود رقابة الزمنية، والتسليم في خلايا قليلة ولكن ليس في السكان (على سبيل المثال، microinjection) 12، ومعقدة الاقتران الكيميائية أو صياغة خطط 11. <html> الصورة = &quot;jove_content&quot;&gt; في الآونة الأخيرة، قمنا بتطوير استراتيجية تسليم الرواية التي تلتف حول هذه القيود. وتعتمد هذه الاستراتيجية على الببتيد اسمه dfTAT (ديمر TAT الفلورسنت) 13. مشتق dfTAT من الببتيد نعرف جيدا اختراق خلايا (CPP) TAT. dfTAT يحتوي على اثنين من كبريتيد العبودي نسخ من TAT المسمى مع tetramethylrhodamine fluorophore. وعلى الرغم من أوجه الشبه بينهما، TAT وdfTAT تختلف اختلافا كبيرا في النشاط. وعادة ما المنضوية TAT في الخلايا عن طريق الإلتقام. ولكن هذا CPP لا يزال محتجزا في الغالب داخل الإندوسومات (هذا يؤدي عادة إلى توزيع منقط من الببتيد داخل الخلايا عندما فحصت بواسطة المجهر مضان). مثل TAT، وendocytosed dfTAT بكفاءة عن طريق الخلايا. ومع ذلك، dfTAT لا البقاء محاصرين داخل الإندوسومات. بدلا من ذلك، انها تتوسط تسرب endosomal بطريقة غير فعالة للغاية. النشاط endosomolytic من dfTAT ثم يمكن استغلاله لتقديم الجزيئات عن طريق فحص بسيط الحضانة. ntent &quot;&gt; والفهم الحالي لعملية التسليم على النحو التالي. dfTAT يدفع macropinocytosis. ونتيجة لذلك، والخلايا المحتضنة مع dfTAT يستغرق بروتينات قابلة للذوبان، والببتيدات، أو جزيئات صغيرة (جزيئات من الفائدة، وزارة الداخلية) موجودة في وسائل الإعلام من قبل المائع- الإلتقام (انظر الشكل 1). التفاعلات بين dfTAT وزارة الداخلية ليست ضرورية ما دام كل حركة المرور الكيانات معا ضمن مسار التقامي. وتصل dfTAT عتبة معينة داخل تجويف العضيات التقامي، فإنها تعرب عن النشاط تسرب endosomal لها (التفاصيل الجزيئية يبقى أن يميز تماما). مضمون لمعة من العضيات تتسرب منها المياه، وبالتالي فإن وزارة الداخلية، ثم يتم إطلاقها في الخلايا، وبالتالي هذا النهج غير مريحة للغاية كما ليس هناك حاجة لتصريف الافعال أو صياغة خطط مع وزارة الداخلية. وعلاوة على ذلك، لأن dfTAT هو لا تعديل وزارة الداخلية مباشرة، فإنه ينبغي أيضا أن لا تتداخل مع وظيفة موييس مرة واحدة ويتحقق تسليم داخل الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تركيزتستخدم dfTAT التسليم مستقل من أن من وزارة الداخلية في وسائل الإعلام. على سبيل المثال، تركيز dfTAT يمكن أن تظل ثابتة بين التجارب المختلفة لضمان الكفاءة استنساخه في تسرب endosomal. في المقابل، وتركيز وزارة الداخلية في وسائل الإعلام يمكن أن تتغير تدريجيا لتحقيق المستويات المنشودة من وزارة الداخلية تسليمها في العصارة الخلوية. ارتفاع endosomal كفاءة تسرب تحقق مع dfTAT هي غير ضارة بشكل ملحوظ إلى العديد من الخلايا اختبار حتى الآن. هذا هو مفاجأة لأن العضيات التقامي هي عنصر هام من عناصر الخلايا ويتوقع المرء أن تسرب مثيرة بوساطة dfTAT سيرافق الاستجابات الخلوية الضارة. ومع ذلك، وتتكاثر الخلايا المعالجة في نفس معدل الخلايا غير المعالجة وعدم عرض أي تغييرات كبيرة في Transcriptome على الخاصة بهم. وعلاوة على ذلك، يمكن تكرار التسليم في غضون دقائق مع كفاءات تسليم استنساخه، مشيرا إلى أن الخلايا إما أن يتسامح أو التعافي من عملية التسليم دون أن تفقدقدرتها على الإلتقام أو تسرب endosomal. الاستجابات الخلوية خفية قد يتحقق أثناء الولادة dfTAT والتفاصيل الجزيئية ما يمكن أن تبقى هذه الردود من يكتشفها. بعد، من خلال الجمع بين الكفاءة العالية، والراحة من البروتوكولات، وعدم وجود سمية، يجب أن هذا النهج تسليم يكون مفيدا على الفور في العديد من التطبيقات المستندة إلى الخلية. وتهدف البروتوكولات الواردة في هذه الوثيقة إلى جعل هذه التكنولوجيا في متناول المجتمع البحثي.

<table><tbody><tr><td>Heparin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>CAS 9041-08-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Blue</td><td>Invitrogen</td><td>S11348</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Invitrogen</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>nrL15 L-15 (&amp;ndash;) cysteine</td><td>Hyclone</td><td></td><td>Special order</td></tr><tr><td>Fmoc-protected Amino acids</td><td>Novabiochem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dfTAT</td><td></td><td></td><td>Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu)</td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted epifluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td>model IXB1</td><td>equipped with a heating stage maintained at 37 &amp;deg;C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C humidified, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

delivery of proteins, peptides or cell-impermeable small molecules into live cells by incubation with the endosomolytic reagent dftat

استراتيجيات تسليم الجزيئات عادة الاستفادة من مسار التقامي كطريق من دخول الخلوية. ومع ذلك، endosomal انحباس يحد بشدة من الكفاءة التي الجزيئات تخترق الفضاء عصاري خلوي من الخلايا. مؤخرا، قمنا التحايل على هذه المشكلة عن طريق تحديد كاشف dfTAT، وديمر السندات ثاني كبريتيد من TAT الببتيد المسمى مع tetramethylrhodamine fluorophore. لقد ولدت ديمر fluorescently المسمى من تنميط الببتيد اختراق الخلية (CPP) TAT، dfTAT، التي تخترق الخلايا الحية وتصل مساحة عصاري خلوي من الخلايا مع كفاءة عالية للغاية. ويتحقق تسليم عصاري خلوي من dfTAT في خطوط الخلايا متعددة، بما في ذلك الخلايا الأولية. وعلاوة على ذلك، والتسليم لا يؤثر بشكل ملحوظ بقاء الخلية، وانتشار أو التعبير الجيني. dfTAT يمكن أن يحقق الجزيئات، والببتيدات، والأجسام المضادة، والانزيمات النشطة بيولوجيا صغيرة وعامل النسخ. في هذا التقرير، وصفنا البروتوكولات تشارك في dfTAالتوليف T والتسليم الخلوية. يصف المخطوطة كيفية السيطرة على كمية من البروتين تسليمها إلى الفضاء عصاري خلوي الخلايا من خلال تغيير كمية البروتين تدار خارج الخلية. وأخيرا، تناقش القيود الحالية من هذه التكنولوجيا الجديدة والخطوات المتبعة في التحقق من صحة التسليم. يجب أن تكون البروتوكولات المذكورة مفيدة للغاية لفحوصات خلية القاعدة فضلا عن التلاعب فيفو السابقين وإعادة برمجة الخلايا.

لتقييم الفرق بين fTAT وdfTAT، يتم تحضين الخلايا هيلا لمدة 1 ساعة مع كل الببتيد لتحديد الفرق في توطين الخلوي. تم تقييم واستيعاب اثنين CPP باستخدام المجهر مضان. ويبين الشكل 2 أن fTAT (20 ميكرومتر) يموضع في توزيع منقط. هذا التوزيع يتسق مع الببتيد المتبقية محاصر داخل الإندو...

Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT at JoVE.com

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

تسليم والبروتينات، والببتيدات أو خلية بردة الجزيئات الصغيرة إلى الخلايا الحية التي الحضانة مع Endosomolytic الكاشف dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

delivery-proteins-peptides-or-cell-impermeable-small-molecules-into

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K Views.  Texas A&M University. We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky. 

Video: Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Physical interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane protein complexes and in dynamic processes such as transmembrane (TM) signaling and regulation of cell-surface protein levels. Understanding the structural features driving the association of particular sequences requires sophisticated biophysical and biochemical analyses of TM peptide complexes. However, the extreme hydrophobicity of TM domains makes them very difficult to manipulate using standard peptide chemistry techniques, and production of suitable study material often proves prohibitively challenging. Identifying conditions under which peptides can adopt stable helical conformations and form complexes spontaneously adds a further level of difficulty. Here we present a procedure for the production of homo- or hetero-dimeric TM peptide complexes from materials that are expressed in E. coli, thus allowing incorporation of stable isotope labels for nuclear magnetic resonance (NMR) or non-natural amino acids for other applications relatively inexpensively. The key innovation in this method is that TM complexes are produced and purified as covalently associated (disulfide-crosslinked) assemblies that can form stable, stoichiometric and homogeneous structures when reconstituted into detergent, lipid or other membrane-mimetic materials. We also present carefully optimized procedures for expression and purification that are equally applicable whether producing single TM domains or crosslinked complexes and provide advice for adapting these methods to new TM sequences.

Biophysical and biochemical studies of interactions among membrane-embedded protein domains face many technical challenges, the first of which is obtaining appropriate study material. This article describes a protocol for producing and purifying disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes that are suitable for structural analysis by solution nuclear magnetic resonance (NMR) and other analytical applications.

إنتاج ثاني كبريتيد استقرت مجمعات الببتيد عبر الغشاء الدراسات الإنشائية

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Chemistry

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

الضغط خلية باعتبارها قوية، ميكروفلويديك بين الخلايا توصيل منصة

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum (ER) resident proteins implicated in homotypic fusion of the ER. We detail here a method for purifying a glutathione S-transferase (GST) and poly-histidine tagged Drosophila atlastin by two rounds of affinity chromatography. Studying fusion reactions in vitro requires purified fusion proteins to be inserted into a lipid bilayer. Liposomes are ideal model membranes, as lipid composition and size may be adjusted. To this end, we describe a reconstitution method by detergent removal for Drosophila atlastin into preformed liposomes. While several reconstitution methods are available, reconstitution by detergent removal has several advantages that make it suitable for atlastins and other similar proteins. The advantage of this method includes a high reconstitution yield and correct orientation of the reconstituted protein. This method can be extended to other membrane proteins and for other applications that require proteoliposomes. Additionally, we describe a FRET based lipid mixing assay of proteoliposomes used as a measurement of membrane fusion.

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Biological membrane fusion is catalyzed by specialized fusion proteins. Measuring the fusogenic properties of proteins can be achieved by lipid mixing assays. We present a method for purifying recombinant Drosophila atlastin, a protein that mediates homotypic fusion of the ER, reconstituting it to preformed liposomes, and testing for fusion capacity.

إعادة تشكيل المستحضرات المؤتلفة Drosophila Atlastin في Liposomes لفحوصات خلط الدهون

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Biochemistry

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. This information is particularly valuable in the context of host-pathogen interactions. Many pathogen proteins function within host cells in a variety of way such as, enabling evasion of the host immune system and survival within the intracellular environment. To study these pathogen-protein host-cell interactions, several approaches are commonly used, including: in vivo infection with a strain expressing a tagged or mutant protein, or introduction of pathogen genes via transfection or transduction. Each of these approaches has advantages and disadvantages. We sought a means to directly introduce exogenous proteins into cells. Electroporation is commonly used to introduce nucleic acids into cells, but has been more rarely applied to proteins although the biophysical basis is exactly the same. A standard electroporator was used to introduce affinity-tagged bacterial effectors into mammalian cells. Human epithelial and mouse macrophage cells were cultured by traditional methods, detached, and placed in 0.4 cm gap electroporation cuvettes with an exogenous bacterial pathogen protein of interest (e.g. Salmonella Typhimurium GtgE). After electroporation (0.3 kV) and a short (4 hr) recovery period, intracellular protein was verified by fluorescently labeling the protein via its affinity tag and examining spatial and temporal distribution by confocal microscopy. The electroporated protein was also shown to be functional inside the cell and capable of correct subcellular trafficking and protein-protein interaction. While the exogenous proteins tended to accumulate on the surface of the cells, the electroporated samples had large increases in intracellular effector concentration relative to incubation alone. The protocol is simple and fast enough to be done in a parallel fashion, allowing for high-throughput characterization of pathogen proteins in host cells including subcellular targeting and function of virulence proteins.

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

Electroporation للمن المستجيبات البكتيرية وظيفية في خلايا الثدييات

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Immunology and Infection

Engineering Cell-permeable Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can make use of the translocating ability of so-called cell penetrating peptides (CPPs), also designated as protein transduction domains (PTDs). The TAT-CPP derived from the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Tat (trans-activator of transcription) protein has been widely used. The positively charged TAT promotes cell permeability thereby overcoming the barriers of the cellular membrane by endocytosis or/and direct membrane penetration2. In combination with a nuclear localization signal (NLS) fusion proteins are able to enter the nucleus exhibiting functionality. Our video presentation demonstrates, as an exemplification for the engineering of cell-permeable proteins, the construction, production and application of a cell-permeable version of the DNA-modifying enzyme Cre.
Cre is a site-specific recombinase that is able to recognize and recombine 34 base pair loxP sites in mammalian cells in vitro and in vivo. Therefore the Cre/loxP system is widely used to conditionally induce mutations in the genome of living cells3,4. The delivery of active Cre recombinase to cells, however, represents a limitation.
We describe the pSESAME vector system, which allows a direct insertion of the gene-of-interest and provides a platform to rapidly clone different domains and tags used within the vector in a convenient and standardized manner. Rearranging of the different tags has been shown to modify the biochemical properties of the fusion proteins providing a possibility to achieve higher yield and better solubility. We demonstrate how to express and purify recombinant cell-permeant proteins in and from E. coli. The functionality of the recombinant Cre protein is finally validated in cell culture by assessing its intracellular recombinase activity.

Protein transduction enables the direct delivery of biologically active proteins into cells. In contrast to conventional methods such as DNA transfection or viral transduction this non-invasive paradigm allows highly efficient cellular manipulation in a titratable manner circumventing cellular toxicity and the risk of oncogenic transformation by permanent genetic modification.

هندسة الخلايا المنفذة للبروتين

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can ...

Biology

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1. Many of these are referred to as cell-penetrating peptides, which are frequently noted for their potential as drug delivery vectors1-3. Moreover, there is increasing interest in antimicrobial peptides that operate via non-membrane lytic mechanisms4,5, particularly those that cross bacterial membranes without causing cell lysis and kill cells by interfering with intracellular processes6,7. In fact, authors have increasingly pointed out the relationship between cell-penetrating and antimicrobial peptides1,8. A firm understanding of the process of membrane translocation and the relationship between peptide structure and its ability to translocate requires effective, reproducible assays for translocation. Several groups have proposed methods to measure translocation into large unilamellar lipid vesicles (LUVs)9-13. LUVs serve as useful models for bacterial and eukaryotic cell membranes and are frequently used in peptide fluorescent studies14,15. Here, we describe our application of the method first developed by Matsuzaki and co-workers to consider antimicrobial peptides, such as magainin and buforin II16,17. In addition to providing our protocol for this method, we also present a straightforward approach to data analysis that quantifies translocation ability using this assay. The advantages of this translocation assay compared to others are that it has the potential to provide information about the rate of membrane translocation and does not require the addition of a fluorescent label, which can alter peptide properties18, to tryptophan-containing peptides. Briefly, translocation ability into lipid vesicles is measured as a function of the Foster Resonance Energy Transfer (FRET) between native tryptophan residues and dansyl phosphatidylethanolamine when proteins are associated with the external LUV membrane (Figure 1). Cell-penetrating peptides are cleaved as they encounter uninhibited trypsin encapsulated with the LUVs, leading to disassociation from the LUV membrane and a drop in FRET signal. The drop in FRET signal observed for a translocating peptide is significantly greater than that observed for the same peptide when the LUVs contain both trypsin and trypsin inhibitor, or when a peptide that does not spontaneously cross lipid membranes is exposed to trypsin-containing LUVs. This change in fluorescence provides a direct quantification of peptide translocation over time.

This protocol details a method for the quantitative measure of peptide translocation into large unilamellar lipid vesicles. This method also provides information about the rate of membrane translocation and can be used to identify peptides that efficiently and spontaneously cross lipid bilayers.

قياس إزفاء الببتيد في الحويصلات الكبيرة Unilamellar

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

البروتين التسليم المباشر للخلايا الثدييات عن طريق خلية قابلة للاختراق السيستئين<sub&gt; 2</sub&gt; العاهل<sub&gt; 2</sub&gt; مجالات الزنك الاصبع

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated exocytosis is fundamental for intercellular communication and is a key mechanism for the secretion of neurotransmitters, hormones, inflammatory mediators, and other compounds, by a variety of cells. At least three distinct mechanisms are known for regulated exocytosis: full exocytosis, where a single SG fully fuses with the plasma membrane, kiss-and-run exocytosis, where a single SG transiently fuses with the plasma membrane, and compound exocytosis, where several SGs fuse with each other, prior to or after SG fusion with the plasma membrane. The type of regulated exocytosis undertaken by a cell is often dictated by the type of secretory trigger. However, in many cells, a single secretory trigger can activate multiple modes of regulated exocytosis simultaneously. Despite their abundance and importance across cell types and species, the mechanisms that determine the different modes of secretion are largely unresolved. One of the main challenges in investigating the different modes of regulated exocytosis, is the difficulty in distinguishing between them as well as exploring them separately. Here we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran as an exocytosis reporter, and live cell imaging, to differentiate between the different pathways of regulated exocytosis, focusing on compound exocytosis, based on the robustness and duration of the exocytic events.

Here we detail a method for live cell imaging of regulated exocytosis. This method utilizes FITC-dextran, which accumulates in lysosome-related organelles, as a reporter. This simple method also allows distinguishing between different modes of regulated exocytosis in cells that are difficult to manipulate genetically.

تصوير فيتك-ديكستران كمراسل للرقابة الخاضعة للتنظيم

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...

Bead Loading Proteins and Nucleic Acids into Adherent Human Cells

Many live-cell imaging experiments use exogenous particles (e.g., peptides, antibodies, beads) to label or function within cells. However, introducing proteins into a cell across its membrane is difficult. The limited selection of current methods struggles with low efficiency, requires expensive and technically demanding equipment, or functions within narrow parameters. Here, we describe a relatively simple and cost-effective technique for loading DNA, RNA, and proteins into live human cells. Bead loading induces a temporary mechanical disruption to the cell membrane, allowing macromolecules to enter adherent, live mammalian cells. At less than 0.01 USD per experiment, bead loading is the least expensive cell loading method available. Moreover, bead loading does not substantially stress cells or impact their viability or proliferation. This manuscript describes the steps of the bead loading procedure, adaptations, variations, and technical limitations. This methodology is especially suited for live-cell imaging but provides a practical solution for other applications requiring the introduction of proteins, beads, RNA, or plasmids into living, adherent mammalian cells.

Bead loading introduces proteins, plasmids, and particles into adherent mammalian cells. This cell loading technique is inexpensive, rapid, and does not substantially affect cell health. It is best suited for live-cell imaging.

حبة تحميل البروتينات والأحماض النووية في الخلايا البشرية الملتصقة

Many live-cell imaging experiments use exogenous particles (e.g., peptides, antibodies, beads) to label or function within cells. However, introducing ...

Live Fluorescence, Inverse Imaging of Cell Ruffling, and Macropinocytosis

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase nutrients and other material in cells. The dramatic extension of cell surface ruffles, their closure to form macropinosomes, and the maturation of internalized macropinosomes are key events in this pathway that can be difficult to capture using conventional confocal imaging based on tracking a bolus of fluorescent cargo. Fluorescent dextrans are commonly used experimentally as fluid phase markers for macropinosomes and for other endocytic pathways. A method the lab has adopted to optimize the imaging of dextran uptake involves using live imaging of cells bathed in high concentrations of fluorescent dextran in the medium, with the unlabeled cells appearing in relief (as black). The cell ruffles are highlighted to visualize ruffle closure, and internalized macropinosomes appear as fluorescent vacuoles in the cell interior. This method is optimal for visualizing macropinosome features and allows for easy segmentation and quantification. This paper describes dual-labeling of pathways with different sized dextrans and the co-expression of lipid probes and fluorescent membrane proteins to demark macropinosomes and other endosomes. The detection of internalized dextran at an ultrastructural level using correlative light and electron microscopy (CLEM) is also demonstrated. These cell processes can be imaged using multiple live imaging modalities, including in 3D. Taken together, these approaches optimize macropinosome imaging for many different settings and experimental systems.

<meta charset="utf8"></head><body>التألق الحي ، والتصوير العكسي لكشكشة الخلايا ، وكثرة الخلايا

This protocol demonstrates dextran imaging in live cells using continuous uptake and inverse images to optimize visualization of ruffling, macropinosome maturation, and analysis of dextran and other cell labelings.

التألق الحي ، والتصوير العكسي لكشكشة الخلايا ، وكثرة الخلايا

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase ...