This article was supported by Award Number R01GM087227 from the National Institute of General Medical Sciences, the Norman Ackerman Advanced Research Program, and the Robert A. Welch foundation (Grant A-1769).

1. SPPS: CK (TMR) TATG (fTAT) Synthese Anmerkung: dfTAT wird in zwei Schritten hergestellt: Synthese des Monomers fTAT durch Festphasenpeptidsynthese, gefolgt von einer Disulfidbindung Dimerisierung dfTAT bilden. <ol><li> Quellen 500 mg Rink-Amid-MBHA-Harz in Dimethylformamid (DMF) in einem Standard-50 ml-SPPS-Gefß 1 Stunde. </li><li> Zuführen Fmoc-Abspaltung durch Inkubieren der Fmoc geschützten Harzes in einer 20% igen Piperidin-Lösung (20% Piperidin in DMF, 10 ml (0,30 mmol). Führen Entschützungsschritte zweimal (1 x 5 min und 1 x 15 min) mit einem Waschschritt mit DMF (der Waschschritt ein Spülen des Harzes mehrere Male mit einem Gesamtvolumen von etwa 150 ml DMF gelöst und das Lösungsmittel durch Vakuumfiltration) dazwischen Reaktionen. </li><li> Synthetisieren CK (TMR) RKKRRQRRRG (fTAT) auf der Rink-Amid-MBHA-Harz. Verwenden der folgenden Fmoc-geschützten Aminosäuren Fmoc-Lys (Mtt) -OH (nur am N-Terminus), Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc- Gln (Trt) -OH und Fmoc-Cys (Trt) -OH. Die Reaktion mit N 2 (20 psi), um die Reaktion zu rühren. Führen Sie alle Reaktionen bei RT. <ol><li> Führen Sie jede Aminosäure Kupplungsreaktion 4 Stunden. Für jede Kupplung Verwenden der Fmoc geschützten Aminosäure (1,2 mmol), N, N, N &#39;, N&#39; -Tetramethyl- O- (1-benzotriazol-1-yl) uroniumhexafluorphosphat (HBTU) (0,44 g, 1,1 mmol ) und Diisopropylethylamin (DIEA) (0,51 ml, 3,0 mmol) in DMF gelöst. Nach 4 Stunden Kopplung, Waschen des Harzes mit DMF und führen Sie die Fmoc Entschützungsschritt, wie in Schritt 1.2 beschrieben. </li><li> Wiederholen, bis die lineare Peptidkette fTAT (Linear Peptidkette: CKRKKRRQRRRG kein TMR) synthetisiert. </li><li> Dann waschen Harz gründlich mit ersten DMF und nach, dass mit Dichlormethan (DCM). Mit einem Gesamtvolumen von etwa 150 ml DMF oder DCM Spülen Sie den Harz mehrere Male und das Lösemittel durch Vakuumfiltration. </li><li> Use MALDI-TOF, um zu bestätigen, dass das erhaltene Peptid hat das korrekte Molekulargewicht. <ol><li> Einen Matrixmischung durch Zugabe von 1 mg Matrix zu einer Lösung von 50 ul 0,01% TFA in Wasser-Lösung und 50 ul Acetonitril besteht. </li><li> Um linearen Peptidkette Masse zu bestätigen, verwenden α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure. Führen Sie eine analytische HPLC des rohen Peptids und sammeln Sie 50 ul von der Oberseite des reinen Peak. </li><li> Um die Probe vorzubereiten, um auf der MALDI Teller Teller: In 8 ul der Peptid bis 2 &amp; mgr; l der Matrix-Lösung und auf den MALDI-Platte trocken oder auf einer 37 ° C Wärmeplatte in die Luft. Anmerkung: Arginin ist bekannt, dass eine Aminosäure schwierig Paar in SPPS sein. Erfolgreiche Kopplung durch Ausführen einer Kaiser-Test 14 (zB Ninhydrintest) etabliert. Dieser Test ermöglicht den Nachweis von freien Aminen, die auf dem Harz abgekoppelt bleiben könnten. Im Falle einer blauen Farbe festgestellt wird (Anzeichen für die Anwesenheit freier Amine), Kupplungs sTEPs werden wiederholt. </li></ol></li></ol></li><li> CK (-NH-TMR) TATG (fTAT), spalten die Mtt-Schutzgruppe an der &amp; egr; -Aminogruppe von Lys an CK (-NH-Mtt) TATG mit einer Lösung aus 1% Trifluoressigsäure (TFA) und 2% Triisopropylsilan zusammen (TIS) in DCM. <ol><li> Die Entfernung von MTT Schutzgruppe würde das Auftreten einer gelben Farbe führen, Inkubation des Harzes mit 20 ml der obigen Lösung für 5 min, wiederholen, bis keine gelbe Farbe beobachtet wird. Dazwischen das Harz mit DCM und DMF. Zusätzlich seit TIS ist ein Aasfresser, die die MTT abfangen würde, sobald keine gelbe Farbe erscheint in der Lösung in Gegenwart von MTT. </li><li> Hinzufügen eines zusätzlichen Lösung mit 1% TFA in DCM (kein TIS) zu dem Harz keine MTT mehr versichern wird entfernt und die Lösung bleibt klar. </li></ol></li><li> Lösen die drei Komponenten: Carboxytetramethylrhodamin (TMR), HBTU und DIEA (4, 3,9 und 10 Äquivalenz in Bezug auf die Menge des Harzes (in mg)) in DMF und diese Mischungzu dem Harz und die Reaktion O / N mit trockenem N 2, um Unruhe zu schaffen. </li><li> Nach der Fmoc-Entschützung und Aminosäure-Konjugation, das Harz mit DCM und trocknen lassen. Für eine vollständige Spaltung des Peptids von dem Harz, wird eine Lösung aus 92,5% TFA, 2,5% H 2 O, 2,5% TIS, 2,5% Ethandithiol (EDT) (Gesamtvolumen = 4 ml), um die Peptidyl-Harz für 3 h bei RT zur Entfernung der Schutzgruppen und Abspaltung vom Harz zu erzielen. <ol><li> Ausfällung der rohen Peptidprodukte mit kaltem wasserfreiem Ethylether (Et 2 O) durch Ablassen der Lösung aus Stufe 1.6 werden in 40 ml Et 2 O, drehen diese hinunter auf 4 ° C und 4.000 × g für 20 - 25 min. Wiederholen Sie diesen Schritt, um Waschen des Niederschlags mit kaltem wasserfreiem Et 2 O ermöglichen </li><li> Resuspendieren des Präzipitats in Wasser (5 ml, oder bis Niederschlag vollständig gelöst ist), und lyophilisiere. Dann resuspendieren in 0,1% wässriger TFA / Acetonitril erhaltenen Produkte. </li></ol></li> &lt;li&gt; Eine HPLC-Analyse mit einer analytischen C18-Säule (5 &amp; mgr; m, 4 x 150 mm), um jedes Peptid zu analysieren. Verwenden einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml / min und Detektion bei 214 nm und 550 nm. </li><li> Zuführen semipräparative HPLC auf einer C18 10 x 250 mm-Säule zur Peptidreinigung. Verwenden einer Fließgeschwindigkeit von 4 ml / min und Detektion bei 214 nm und 550 nm. Für alle Durchläufe verwenden linearen Gradienten von 0,1% wässriger TFA (Lösungsmittel A) und 90% Acetonitril, 9,9% Wasser und 0,1% TFA (Lösungsmittel B). </li><li> Bestätigen Sie die korrekte Identität der Peptide durch MALDI-TOF nach Herstellerprotokoll: fTAT, erwartete Masse: 2,041.17, beobachtete Masse: 2.040,66. DEAC-K9, erwartete Masse: 1,412.97, beobachtete Masse: 1,415.59. Verwenden ein α- Cyano-4-hydroxyzimtsäure-Matrix für den MALDI-TOF. </li></ol> 2. Oxidation: dfTAT Erstellung <ol><li> Belüften phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,4 für 1 Stunde (mindestens 5 ml für die Reaktion weiter unten). </li><li> Löse fTAT (0,3 mg, 1,5 x 10 -4 mmol) in aerATED PBS pH 7,4 (5 ml). Sicherzustellen, dass der pH-Wert zwischen 7,0 bis 7,5 nach der Zugabe des Peptids. Wenn nicht Natriumhydroxid hinzufügen (1 M, in kleinen Schritten 1-5 ul), um den pH-Wert wieder auf 7,4 zu bringen. </li><li> Anmerkung: Sauerstoff, gelöst in PBS wirkt die Thiolgruppen auf fTAT oxidieren und eine Disulfidbindung bilden. </li><li> Nutiert die Reaktion O / N, damit sie bis zum Abschluß (100% Ausbeute, basierend auf HPLC-Analyse) zu reagieren. Man reinigt das Produkt mittels Umkehrphasen-HPLC und Massenspektrometrie (MALDI-TOF) analysiert, wie in Schritt 1.9. Erwartete Masse: 4,080.34, beobachtete Masse: 4,084.21. </li><li> Lyophilisiere reinen dfTAT (0,71 x10 -4 mmol) und resuspendieren in 200 ul Wasser (Konzentration reiner dfTAT = 356,3 &amp; mgr; M). </li></ol> 3. Mess dfTAT Konzentration <ol><li> Resuspendieren eines Aliquots des gereinigten dfTAT (typischerweise 1 &amp; mgr; l in Abhängigkeit von der Menge an Peptid gereinigt) in einem 149 ul 50 mM TCEP Lösung. </li><li> Anmerkung: In diesem Schritt dfTAT in seine mo reduziertennomer Gegen fTAT um die Absorption Abschrecken, der aufgrund der großen Nähe des TMR-Fluorophor in dfTAT (der Extinktionskoeffizient ε der TMR in dfTAT wird im Vergleich zu der ε von TMR in reduzierter fTAT reduziert) zu eliminieren. </li><li> Die Probe wird für etwa 20 min reagieren (analytische HPLC kann verwendet werden, um die Bildung von fTAT bestätigen). </li><li> Hinzufügen all der Lösung auf die Quarzküvette und Messung der Absorption bei 556 nm. </li><li> Unter Verwendung des Beerschen Gesetzes (A = εcl: ε = 91.500 M -1 cm -1), um die Konzentration von fTAT berechnen, bestimmen die Konzentration von dfTAT, und teilen [fTAT] durch zwei. </li></ol> 4. Cellular Lieferung Experimente <ol><li> Pflanzensamen, die Zellen (HeLa, HDF, etc.) In einer Schale auf einer Konfluenz von 80-90% (zB 8-Well-oder 24-Well-Schale). 90% Konfluenz in einer 37 ° C - wachsen Zellen in einem geeigneten Medium, bis 80 (zB DMEM mit 10% FBS und Pen / Strep ergänzt)befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2. </li><li> Die Zellen werden dreimal (3x) mit PBS (durch Zugabe von 200 ul PBS und dann Entfernen dreimal). </li><li> Einen 5 uM Arbeitskonzentration von dfTAT durch in NRL-15 Medien Verdünnen einer Stamm der dfTAT (in Wasser) (für ein 8 gut austeilen das Gesamtvolumen sollte 200 ul sein). Eine Konzentration von 5 uM dfTAT führt zu effizienten Lieferung (hohe cytosolische Lieferung in über 90% der in einer Schale vorhanden Zellen) in den meisten auf dem neuesten Stand (Abbildung 3) getesteten Zelltypen. Jedoch können niedrigere oder höhere Konzentrationen für Zelltypen mit einem hohen oder niedrigen Neigung zum Eindringen mehr ausreichend sein. HINWEIS ÜBER DIE MEDIEN: NRL-15 ist für die Lieferung von dfTAT verwendet, da es nicht Cystein, das die Disulfidbindung in dfTAT reduzieren könnten. Jedoch zeigen unsere Daten, dass sowohl reguläre L-15 (mit Cystein) und DMEM kann als Abgabemedien verwendet werden. L-15 das Reduktions Aminosäure Cystein, aber Cystein presumab enthältly oxidiert in den Medien, um Cystin bilden (DMEM mit Cystin formuliert). dfTAT bleibt daher intakt in diesen Medien und Lieferwerk in der gleichen Effizienz wie die mit nrL15 erhalten. </li><li> Inkubieren Zellen mit dfTAT (5 &amp; mgr; M) mit oder ohne Ladung (z. B. EGFP (10 &amp; mgr; M)) und halten bei 37 ° C für 1 Stunde (Inkubationszeit reduziert, sondern dfTAT erfordert typischerweise etwa 30 bis 45 min, um die endosomale Leck induzieren ). </li><li> In L-15-Zellen zu waschen mit Heparin (1 mg / ml) (3 Waschungen werden empfohlen) zu dfTAT entfernen, um die Plasmamembran der Zellen gebunden wird. </li><li> Zellen mit Zell-undurchlässige Kernfärbung, Inkubation z. B. Sytox Blau, Sytox Green (2 uM in NRL-15), um zu bestimmen, ob die Plasmamembran der Zellen beeinträchtigt wird gemäß (toten Zellen, die während lebende Zellen werden nicht gefärbt werden) Protokoll des Herstellers. </li><li> Bildzellen mit einem Fluoreszenzmikroskop (100x Ölimmersion oder 20x-Objektiv). Bild dfTAT mit einem RFP-Filter (Ex =560 ± 20 nm / Em = 630 ± 35 nm). Anmerkung: Die erfolgreiche Bereitstellung führt zu einer diffuse Fluoreszenz dfTAT gesamten Zelle (Beurteilung der Abgabe von Protein oder Peptid von Interesse wird auf Anwendung abhängt). Färbung von Nukleoli von fTAT (das reduzierte Produkt der dfTAT auf cytosolischen Eingabe) kann als Indiz dafür, dass die nachgewiesene Fluoreszenz intrazellulär verwendet werden. fTAT wird innerhalb weniger Stunden abgebaut. Zu diesem Zeitpunkt wird die Fluoreszenz der Abbaufragmente als punktförmige angezeigt. Dies ist nicht zu verwechseln für die punktförmige Verteilung, die auch zu sehen ist, wenn dfTAT bleibt erfolglos Inneren Endosomen gefangen (dies kann passieren, wenn dfTAT bei zu niedrigen Konzentration vorhanden ist) sein. </li></ol> 5. Controling Konzentration der MOI Lieferung <ol><li> Identifizieren Sie die erforderlich ist, um eine effiziente Freisetzung von zytosolischen dfTAT in der verwendeten Zelltyp zu erreichen &quot;optimale Lieferung&quot; Konzentration. Führen Fluoreszenzmikroskopie auf Zellen mit increasin inkubiertg Konzentrationen dfTAT. Die optimale dfTAT Konzentration wird als die minimale Konzentration, die zum Löschen cytosolischen führt definierten &quot;Diffus&quot; TMR Fluoreszenz in etwa 100% der Zellen in einer Kultur. </li><li> Variiert die Konzentration des MOI in Coinkubation Protokoll verwendet, während die Konzentration von dfTAT Konstante (zB unter Verwendung von optimalen Lieferkonzentration dfTAT&#39;S). Änderung der Inkubationszeit auf weniger als 1 Stunde könnte auch eine Option, um die Menge zu variieren MOI geliefert werden. </li></ol>

<ol>
	<li>Didenko, V. V., Ngo, H., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine+as+a+transmembrane+carrier+of+fluorescently+labeled+proteins+and+antibodies.">Polyethyleneimine as a transmembrane carrier of fluorescently labeled proteins and antibodies.</a> Anal Biochem. 344, 168-173 (2005).</li><li>Takeuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+Rapid+Cytosolic+Delivery+Using+Cell-Penetrating+Peptides+Mediated+by+Pyrenebutyrate.">Direct and Rapid Cytosolic Delivery Using Cell-Penetrating Peptides Mediated by Pyrenebutyrate.</a> ACS Chem Biol. 1, 299-303 (2006).</li><li>Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peptide+carrier+for+the+delivery+of+biologically+active+proteins+into+mammalian+cells.">A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells.</a> Nat Biotech. 19, 1173-1176 (2001).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+somatic+cells+via+TAT-mediated+protein+transduction+of+recombinant+factors.">Reprogramming of somatic cells via TAT-mediated protein transduction of recombinant factors.</a> Biomaterials. 33, 5047-5055 (2012).</li><li>Torchilin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+delivery+of+protein+and+peptide+therapeutics.">Intracellular delivery of protein and peptide therapeutics.</a> Drug Discov Today: Technol. 5, e95-e103 (2005).</li><li>Chakravarty, P., Qian, W., El-Sayed, M. A., Prausnitz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+molecules+into+cells+using+carbon+nanoparticles+activated+by+femtosecond+laser+pulses.">Delivery of molecules into cells using carbon nanoparticles activated by femtosecond laser pulses.</a> Nature nanotechnol. 5, 607-611 (2010).</li><li>Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+delivery+using+engineered+virus-like+particles.">Protein delivery using engineered virus-like particles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 16998-17003 (2011).</li><li>Pan, C., Lu, B., Chen, H., Bishop, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+human+fibroblasts+using+HIV-1+TAT+recombinant+proteins+OCT4,+SOX2,+KLF4+and+c-MYC.">Reprogramming human fibroblasts using HIV-1 TAT recombinant proteins OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC.</a> Mol Biol Rep. 37, 2117-2124 (2010).</li><li>Fittipaldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Membrane+Lipid+Rafts+Mediate+Caveolar+Endocytosis+of+HIV-1+Tat+Fusion+Proteins.">Cell Membrane Lipid Rafts Mediate Caveolar Endocytosis of HIV-1 Tat Fusion Proteins.</a> J Biol Chem. 278, 34141-34149 (2003).</li><li>Lee, Y. J., Erazo-Oliveras, A., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+macromolecules+into+live+cells+by+simple+co-incubation+with+a+peptide.">Delivery of macromolecules into live cells by simple co-incubation with a peptide.</a> Chembiochem. 11, 325-330 (2010).</li><li>Angeles-Boza, A. M., Erazo-Oliveras, A., Lee, Y. J., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+endosomolytic+reagents+by+branching+of+cell-penetrating+peptides:+tools+for+the+delivery+of+bioactive+compounds+to+live+cells+in+cis+or+trans.">Generation of endosomolytic reagents by branching of cell-penetrating peptides: tools for the delivery of bioactive compounds to live cells in cis or trans.</a> Bioconjugate chem. 21, 2164-2167 (2010).</li><li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O.">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3185-3190 (2001).</li><li>Erazo-Oliveras, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+delivery+into+live+cells+by+incubation+with+an+endosomolytic+agent.">Protein delivery into live cells by incubation with an endosomolytic agent.</a> Nat methods. 11, 861-867 (2014).</li><li>Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+test+for+detection+of+free+terminal+amino+groups+in+the+solid-phase+synthesis+of+peptides.">Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides.</a> Anal Biochem. 34, 595-598 (1970).</li><li>Muthukrishnan, N., Johnson, G. A., Lim, J., Simanek, E. E., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAT-mediated+photochemical+internalization+results+in+cell+killing+by+causing+the+release+of+calcium+into+the+cytosol+of+cells.">TAT-mediated photochemical internalization results in cell killing by causing the release of calcium into the cytosol of cells.</a> Biochim biophys acta. 1820, 1734-1743 (2012).</li><li>Lautwein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+B+lymphoblastoid+cells+contain+distinct+patterns+of+cathepsin+activity+in+endocytic+compartments+and+regulate+MHC+class+II+transport+in+a+cathepsin+S-independent+manner.">Human B lymphoblastoid cells contain distinct patterns of cathepsin activity in endocytic compartments and regulate MHC class II transport in a cathepsin S-independent manner.</a> J Leukoc Biol. 75, 844-855 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die zur dfTAT Lieferung verwendet wird, sollte nicht übermäßig sein konfluenten Zellen (&gt; 90% Konfluenz), da dies die Abgabeeffizienz beeinflussen könnten. Die Zellen sollten auch gesund sein: toten Zellen in der Kultur kann apoptotischen Fragmente mit dem dfTAT können (zB DNA aus degradierten Kerne) interagieren, zu lösen. Dies wiederum kann mit der Lieferung Effizienz und die Qualität der Bildgebung stören. Zellen sollten gründlich gewaschen werden, um FBS zu entfernen, bevor dfTAT. BSA vorhanden ...

Die Verabreichung von Proteinen, Peptiden oder zell undurchlässigen kleinen Molekülen in lebende Zellen ist häufig bei vielen biologischen oder biotechnologischen Anwendungen (zelluläre Bildgebung, funktionelle Assays Reprogrammierung, etc.) 1-4 wünschenswert. Vielen Lieferansätze bereits berichtet wurden, einschließlich Mikroinjektion, Elektroporation oder Verwendung von Trägermitteln (z. B. zellpenetrierenden Peptide wie TAT, Lipide) 5-7. Jede Technik hat in der Regel spezifische Vor- und Nachteile, die diese Ansätze angemessen für bestimmte Anwendungen, aber nicht für andere machen könnten. Häufige Probleme beinhalten schlechte Lieferung Effizienzen und / oder Mangel an Kontrolle, wie viel Material 8,9 geliefert, Toxizität oder nachteilige physiologische Auswirkungen 10,11, mangelnde zeitliche Kontrolle, Lieferung in wenigen Zellen, nicht aber in einer Gesamtbevölkerung (z. B. Mikroinjektion) 12, und komplexe chemische Konjugation oder Formulierungssysteme 11. s = &quot;jove_content&quot;&gt; Kürzlich haben wir einen neuen Liefer Strategie, die diese Einschränkungen umgeht entwickelt. Diese Strategie stützt sich auf ein Peptid mit dem Namen dfTAT (Dimer Fluoreszenz TAT) 13. dfTAT wird aus der gut bekannten zellpenetrierenden Peptid (CPP) TAT abgeleitet. dfTAT enthält zwei disulfidgebundenen Kopien TAT mit dem Fluorophor Tetramethylrhodamin markiert. Trotz ihrer Ähnlichkeiten, TAT und dfTAT unterscheiden sich erheblich in der Aktivität. TAT wird typischerweise durch Endozytose in die Zellen internalisiert. Das CPP bleibt jedoch meist innerhalb Endosomen gefangen (dies in der Regel auf eine punktförmige Verteilung des Peptids in Zellen führen, wenn durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht). Wie TAT wird dfTAT effizient von Zellen Endozytose. Allerdings bedeutet dfTAT nicht in Endosomen gefangen zu bleiben. Stattdessen vermittelt es endosomalen Leckage in einer Weise, die sehr effizient ist. Die endosomolytische Aktivität dfTAT können dann genutzt werden, um Makromoleküle durch eine einfache Inkubation Assay zu liefern. ntent &quot;&gt; Das aktuelle Verständnis der Lieferprozess ist wie folgt. dfTAT induziert Makropinozytose. Dadurch Zellen mit dfTAT inkubiert nehmen lösliche Proteine, Peptide oder kleine Moleküle (Moleküle von Interesse, MOI) in Medien präsent durch Flüssigkeitsphasen- Endozytose (siehe Abbildung 1). Die Wechselwirkungen zwischen dfTAT und MOI sind nicht erforderlich, solange beide Entitäten Verkehr zusammen im endocytischen. Wie dfTAT erreicht eine bestimmte Schwelle im Lumen endozytischen Organellen, ihre endosomalen Leckageaktivität (die molekularen Details ausdrückt bleiben werden vollständig charakterisiert). Der Inhalt des Lumens leaky Organellen und damit die MOI, wird dann in den Zellen freigesetzt wird. Dieser Ansatz ist daher sehr praktisch, da keine Konjugation oder Zubereitung Schemata mit MOI erforderlich. Da außerdem dfTAT ist nicht direkt Modifizieren einer MOI, sollte es auch nicht mit MOIs Funktion stören, wenn intrazelluläre Abgabe erreicht wird. Darüber hinaus ist die Konzentration vondfTAT verwendet Lieferung ist unabhängig von jenem des Innenministeriums in Medien. Zum Beispiel kann dfTAT Konzentration zwischen verschiedenen Versuchen konstant gehalten wird, um reproduzierbare Effizienzen in endosomalen Leckage zu gewährleisten. Im Gegensatz dazu kann die Konzentration des MOI in Medien allmählich geändert werden, um gewünschte Niveaus erreichen MOI in Cytosol abgegeben. Die hohe Effizienz bei der endosomalen Leck dfTAT erreicht ist bemerkens unschädlich, viele der Zellen, die bisher getestet. Das ist eine Überraschung, weil endozytischen Organellen sind wichtiger Bestandteil der Zellen und würde man erwarten, dass die dramatische Leckage durch dfTAT vermittelt würden von schädlichen Zellreaktionen begleitet werden. Doch behandelten Zellen vermehren sich mit der gleichen Geschwindigkeit wie unbehandelte Zellen und keine wesentlichen Veränderungen in ihrem Transkriptom anzuzeigen. Darüber hinaus können innerhalb von Minuten mit reproduzierbaren Abgabeeffizienzen wiederholt werden, was darauf hinweist, dass die Zellen entweder toleriert oder erholen sich von den Lieferprozess ohne Verlustihre Fähigkeit zur Endozytose oder endosomalen Leckage. Subtile zellulären Reaktionen während dfTAT Lieferung und die molekularen Details, was diese Reaktionen könnte bleiben, erkundet zu werden werden stattfinden könnte. Doch durch das hohe Wirtschaftlichkeit, Bequemlichkeit der Protokolle, und das Fehlen von Toxizität, diese Lieferansatz sofort in vielen zellbasierten Anwendungen als nützlich erweisen. Die hier angegebenen Protokollen arbeiten daran, dass diese Technologie zugänglich zu der Forschungsgemeinschaft ausgerichtet.

<table><tbody><tr><td>Heparin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>CAS 9041-08-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Blue</td><td>Invitrogen</td><td>S11348</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Invitrogen</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>nrL15 L-15 (&amp;ndash;) cysteine</td><td>Hyclone</td><td></td><td>Special order</td></tr><tr><td>Fmoc-protected Amino acids</td><td>Novabiochem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dfTAT</td><td></td><td></td><td>Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu)</td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted epifluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td>model IXB1</td><td>equipped with a heating stage maintained at 37 &amp;deg;C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C humidified, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

delivery of proteins, peptides or cell-impermeable small molecules into live cells by incubation with the endosomolytic reagent dftat

Makromolekulare Lieferstrategien verwenden typischerweise die endozytischen Weg als Weg der zellulären Eintrag. Jedoch schränkt endosomalen Einschluß der Effizienz bei der Makromoleküle eine cytosolische Raum der Zellen einzudringen. Vor kurzem haben wir dieses Problem durch die Identifizierung der Reagenzien dfTAT, eine Disulfidbindung Dimer des Peptids TAT ​​mit dem Fluorophor Tetramethylrhodamin markiert umgangen. Wir haben eine fluoreszenzmarkierte Dimer des prototypischen zellpenetrierende Peptid (CPP) TAT dfTAT, die lebende Zellen eindringt und erreicht den cytosolischen Raum von Zellen mit einem besonders hohen Wirkungsgrad erzeugt wird. Cytosolische Lieferung dfTAT in mehreren Zelllinien, einschließlich Primärzellen erreicht. Außerdem dauert die Lieferung nicht merklich beeinträchtigen die Lebensfähigkeit der Zellen, Proliferation oder Genexpression. dfTAT können kleine Moleküle, Peptide, Antikörper, biologisch aktive Enzyme und einen Transkriptionsfaktor zu liefern. In diesem Bericht beschreiben wir die Protokolle DfTa beteiligtT-Synthese und Zell Lieferung. Die Handschrift beschreibt, wie die Menge des Proteins an das cytosolische Raum der Zellen zugeführt, indem die Menge an Protein extrazellulär verabreicht steuern. Schließlich werden die jeweiligen Einschränkungen dieser neuen Technologie und Schritte bei der Validierung Lieferung beteiligt diskutiert. Die beschriebenen Protokolle sollten für zellbasierte Assays als auch für die ex vivo-Manipulation und Reprogrammierung von Zellen extrem nützlich sein.

Um die Differenz zwischen fTAT und dfTAT beurteilen, werden HeLa-Zellen für 1 Stunde mit jedem Peptid inkubiert, um den Unterschied in ihrer zellulären Lokalisation zu bestimmen. Die Internalisierung der beiden CPP wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. 2 zeigt, dass fTAT (20 uM) lokalisiert in einem punktförmige Verteilung. Diese Verteilung steht im Einklang mit dem Peptid noch im Gerät befindliche Endosomen eingeschlossen. Im Gegensatz dazu das Fluoreszenzsignal dfTAT (5 uM) zeigt eine h...

Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT at JoVE.com

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

Lieferung von Proteinen, Peptiden oder Handy-undurchlässige kleine Moleküle in lebenden Zellen durch Inkubation mit dem endosomolytische Reagenz dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

delivery-proteins-peptides-or-cell-impermeable-small-molecules-into

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K Aufrufe.  Texas A&M University. We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky. 

Serie: Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Physical interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane protein complexes and in dynamic processes such as transmembrane (TM) signaling and regulation of cell-surface protein levels. Understanding the structural features driving the association of particular sequences requires sophisticated biophysical and biochemical analyses of TM peptide complexes. However, the extreme hydrophobicity of TM domains makes them very difficult to manipulate using standard peptide chemistry techniques, and production of suitable study material often proves prohibitively challenging. Identifying conditions under which peptides can adopt stable helical conformations and form complexes spontaneously adds a further level of difficulty. Here we present a procedure for the production of homo- or hetero-dimeric TM peptide complexes from materials that are expressed in E. coli, thus allowing incorporation of stable isotope labels for nuclear magnetic resonance (NMR) or non-natural amino acids for other applications relatively inexpensively. The key innovation in this method is that TM complexes are produced and purified as covalently associated (disulfide-crosslinked) assemblies that can form stable, stoichiometric and homogeneous structures when reconstituted into detergent, lipid or other membrane-mimetic materials. We also present carefully optimized procedures for expression and purification that are equally applicable whether producing single TM domains or crosslinked complexes and provide advice for adapting these methods to new TM sequences.

Biophysical and biochemical studies of interactions among membrane-embedded protein domains face many technical challenges, the first of which is obtaining appropriate study material. This article describes a protocol for producing and purifying disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes that are suitable for structural analysis by solution nuclear magnetic resonance (NMR) and other analytical applications.

Produktion von Disulfid-stabilisierte Transmembrane Peptid-Komplexe für Structural Studies

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Forschung

Chemie

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

Zellzusammendrücken als Robust, Mikrofluidik Intrazelluläre Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Biotechnik

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum (ER) resident proteins implicated in homotypic fusion of the ER. We detail here a method for purifying a glutathione S-transferase (GST) and poly-histidine tagged Drosophila atlastin by two rounds of affinity chromatography. Studying fusion reactions in vitro requires purified fusion proteins to be inserted into a lipid bilayer. Liposomes are ideal model membranes, as lipid composition and size may be adjusted. To this end, we describe a reconstitution method by detergent removal for Drosophila atlastin into preformed liposomes. While several reconstitution methods are available, reconstitution by detergent removal has several advantages that make it suitable for atlastins and other similar proteins. The advantage of this method includes a high reconstitution yield and correct orientation of the reconstituted protein. This method can be extended to other membrane proteins and for other applications that require proteoliposomes. Additionally, we describe a FRET based lipid mixing assay of proteoliposomes used as a measurement of membrane fusion.

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Biological membrane fusion is catalyzed by specialized fusion proteins. Measuring the fusogenic properties of proteins can be achieved by lipid mixing assays. We present a method for purifying recombinant Drosophila atlastin, a protein that mediates homotypic fusion of the ER, reconstituting it to preformed liposomes, and testing for fusion capacity.

Waschmittelunterstützte Rekonstitution von rekombinantem Drosophila Atlastin in Liposomen für Lipid-Mischtests

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Biochemie

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. This information is particularly valuable in the context of host-pathogen interactions. Many pathogen proteins function within host cells in a variety of way such as, enabling evasion of the host immune system and survival within the intracellular environment. To study these pathogen-protein host-cell interactions, several approaches are commonly used, including: in vivo infection with a strain expressing a tagged or mutant protein, or introduction of pathogen genes via transfection or transduction. Each of these approaches has advantages and disadvantages. We sought a means to directly introduce exogenous proteins into cells. Electroporation is commonly used to introduce nucleic acids into cells, but has been more rarely applied to proteins although the biophysical basis is exactly the same. A standard electroporator was used to introduce affinity-tagged bacterial effectors into mammalian cells. Human epithelial and mouse macrophage cells were cultured by traditional methods, detached, and placed in 0.4 cm gap electroporation cuvettes with an exogenous bacterial pathogen protein of interest (e.g. Salmonella Typhimurium GtgE). After electroporation (0.3 kV) and a short (4 hr) recovery period, intracellular protein was verified by fluorescently labeling the protein via its affinity tag and examining spatial and temporal distribution by confocal microscopy. The electroporated protein was also shown to be functional inside the cell and capable of correct subcellular trafficking and protein-protein interaction. While the exogenous proteins tended to accumulate on the surface of the cells, the electroporated samples had large increases in intracellular effector concentration relative to incubation alone. The protocol is simple and fast enough to be done in a parallel fashion, allowing for high-throughput characterization of pathogen proteins in host cells including subcellular targeting and function of virulence proteins.

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

Elektroporation von Functional bakterielle Effektoren in Säugerzellen

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Immunologie und Infektion

Engineering Cell-permeable Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can make use of the translocating ability of so-called cell penetrating peptides (CPPs), also designated as protein transduction domains (PTDs). The TAT-CPP derived from the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Tat (trans-activator of transcription) protein has been widely used. The positively charged TAT promotes cell permeability thereby overcoming the barriers of the cellular membrane by endocytosis or/and direct membrane penetration2. In combination with a nuclear localization signal (NLS) fusion proteins are able to enter the nucleus exhibiting functionality. Our video presentation demonstrates, as an exemplification for the engineering of cell-permeable proteins, the construction, production and application of a cell-permeable version of the DNA-modifying enzyme Cre.
Cre is a site-specific recombinase that is able to recognize and recombine 34 base pair loxP sites in mammalian cells in vitro and in vivo. Therefore the Cre/loxP system is widely used to conditionally induce mutations in the genome of living cells3,4. The delivery of active Cre recombinase to cells, however, represents a limitation.
We describe the pSESAME vector system, which allows a direct insertion of the gene-of-interest and provides a platform to rapidly clone different domains and tags used within the vector in a convenient and standardized manner. Rearranging of the different tags has been shown to modify the biochemical properties of the fusion proteins providing a possibility to achieve higher yield and better solubility. We demonstrate how to express and purify recombinant cell-permeant proteins in and from E. coli. The functionality of the recombinant Cre protein is finally validated in cell culture by assessing its intracellular recombinase activity.

Protein transduction enables the direct delivery of biologically active proteins into cells. In contrast to conventional methods such as DNA transfection or viral transduction this non-invasive paradigm allows highly efficient cellular manipulation in a titratable manner circumventing cellular toxicity and the risk of oncogenic transformation by permanent genetic modification.

Engineering zellpermeablen Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can ...

Biologie

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1. Many of these are referred to as cell-penetrating peptides, which are frequently noted for their potential as drug delivery vectors1-3. Moreover, there is increasing interest in antimicrobial peptides that operate via non-membrane lytic mechanisms4,5, particularly those that cross bacterial membranes without causing cell lysis and kill cells by interfering with intracellular processes6,7. In fact, authors have increasingly pointed out the relationship between cell-penetrating and antimicrobial peptides1,8. A firm understanding of the process of membrane translocation and the relationship between peptide structure and its ability to translocate requires effective, reproducible assays for translocation. Several groups have proposed methods to measure translocation into large unilamellar lipid vesicles (LUVs)9-13. LUVs serve as useful models for bacterial and eukaryotic cell membranes and are frequently used in peptide fluorescent studies14,15. Here, we describe our application of the method first developed by Matsuzaki and co-workers to consider antimicrobial peptides, such as magainin and buforin II16,17. In addition to providing our protocol for this method, we also present a straightforward approach to data analysis that quantifies translocation ability using this assay. The advantages of this translocation assay compared to others are that it has the potential to provide information about the rate of membrane translocation and does not require the addition of a fluorescent label, which can alter peptide properties18, to tryptophan-containing peptides. Briefly, translocation ability into lipid vesicles is measured as a function of the Foster Resonance Energy Transfer (FRET) between native tryptophan residues and dansyl phosphatidylethanolamine when proteins are associated with the external LUV membrane (Figure 1). Cell-penetrating peptides are cleaved as they encounter uninhibited trypsin encapsulated with the LUVs, leading to disassociation from the LUV membrane and a drop in FRET signal. The drop in FRET signal observed for a translocating peptide is significantly greater than that observed for the same peptide when the LUVs contain both trypsin and trypsin inhibitor, or when a peptide that does not spontaneously cross lipid membranes is exposed to trypsin-containing LUVs. This change in fluorescence provides a direct quantification of peptide translocation over time.

This protocol details a method for the quantitative measure of peptide translocation into large unilamellar lipid vesicles. This method also provides information about the rate of membrane translocation and can be used to identify peptides that efficiently and spontaneously cross lipid bilayers.

Mess-Peptide Translokation in große unilamellare Vesikel

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

Direkter Protein Lieferung Säugerzellen mit Zellpermeable Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt; Zink-Finger-Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated exocytosis is fundamental for intercellular communication and is a key mechanism for the secretion of neurotransmitters, hormones, inflammatory mediators, and other compounds, by a variety of cells. At least three distinct mechanisms are known for regulated exocytosis: full exocytosis, where a single SG fully fuses with the plasma membrane, kiss-and-run exocytosis, where a single SG transiently fuses with the plasma membrane, and compound exocytosis, where several SGs fuse with each other, prior to or after SG fusion with the plasma membrane. The type of regulated exocytosis undertaken by a cell is often dictated by the type of secretory trigger. However, in many cells, a single secretory trigger can activate multiple modes of regulated exocytosis simultaneously. Despite their abundance and importance across cell types and species, the mechanisms that determine the different modes of secretion are largely unresolved. One of the main challenges in investigating the different modes of regulated exocytosis, is the difficulty in distinguishing between them as well as exploring them separately. Here we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran as an exocytosis reporter, and live cell imaging, to differentiate between the different pathways of regulated exocytosis, focusing on compound exocytosis, based on the robustness and duration of the exocytic events.

Here we detail a method for live cell imaging of regulated exocytosis. This method utilizes FITC-dextran, which accumulates in lysosome-related organelles, as a reporter. This simple method also allows distinguishing between different modes of regulated exocytosis in cells that are difficult to manipulate genetically.

Imaging-FITC-Dextran als Reporter für regulierte Exozytose

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...

Bead Loading Proteins and Nucleic Acids into Adherent Human Cells

Many live-cell imaging experiments use exogenous particles (e.g., peptides, antibodies, beads) to label or function within cells. However, introducing proteins into a cell across its membrane is difficult. The limited selection of current methods struggles with low efficiency, requires expensive and technically demanding equipment, or functions within narrow parameters. Here, we describe a relatively simple and cost-effective technique for loading DNA, RNA, and proteins into live human cells. Bead loading induces a temporary mechanical disruption to the cell membrane, allowing macromolecules to enter adherent, live mammalian cells. At less than 0.01 USD per experiment, bead loading is the least expensive cell loading method available. Moreover, bead loading does not substantially stress cells or impact their viability or proliferation. This manuscript describes the steps of the bead loading procedure, adaptations, variations, and technical limitations. This methodology is especially suited for live-cell imaging but provides a practical solution for other applications requiring the introduction of proteins, beads, RNA, or plasmids into living, adherent mammalian cells.

Bead loading introduces proteins, plasmids, and particles into adherent mammalian cells. This cell loading technique is inexpensive, rapid, and does not substantially affect cell health. It is best suited for live-cell imaging.

Perlenladen von Proteinen und Nukleinsäuren in anhaftende menschliche Zellen

Many live-cell imaging experiments use exogenous particles (e.g., peptides, antibodies, beads) to label or function within cells. However, introducing ...

Live Fluorescence, Inverse Imaging of Cell Ruffling, and Macropinocytosis

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase nutrients and other material in cells. The dramatic extension of cell surface ruffles, their closure to form macropinosomes, and the maturation of internalized macropinosomes are key events in this pathway that can be difficult to capture using conventional confocal imaging based on tracking a bolus of fluorescent cargo. Fluorescent dextrans are commonly used experimentally as fluid phase markers for macropinosomes and for other endocytic pathways. A method the lab has adopted to optimize the imaging of dextran uptake involves using live imaging of cells bathed in high concentrations of fluorescent dextran in the medium, with the unlabeled cells appearing in relief (as black). The cell ruffles are highlighted to visualize ruffle closure, and internalized macropinosomes appear as fluorescent vacuoles in the cell interior. This method is optimal for visualizing macropinosome features and allows for easy segmentation and quantification. This paper describes dual-labeling of pathways with different sized dextrans and the co-expression of lipid probes and fluorescent membrane proteins to demark macropinosomes and other endosomes. The detection of internalized dextran at an ultrastructural level using correlative light and electron microscopy (CLEM) is also demonstrated. These cell processes can be imaged using multiple live imaging modalities, including in 3D. Taken together, these approaches optimize macropinosome imaging for many different settings and experimental systems.

<meta charset="utf8"></head><body>Live-Fluoreszenz, inverse Bildgebung von Zellkräuseln und Macropinozytose

This protocol demonstrates dextran imaging in live cells using continuous uptake and inverse images to optimize visualization of ruffling, macropinosome maturation, and analysis of dextran and other cell labelings.

Live-Fluoreszenz, inverse Bildgebung von Zellkräuseln und Macropinozytose

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase ...