This article was supported by Award Number R01GM087227 from the National Institute of General Medical Sciences, the Norman Ackerman Advanced Research Program, and the Robert A. Welch foundation (Grant A-1769).

1. SPPS : CK (TMR) TATG (fTAT) 합성 주 : dfTAT는 두 단계로 생성된다 : dfTAT을 형성하는 디설파이드 결합 이량이어서 고상 펩티드 합성에 의해 모노머의 합성을 fTAT. <ol><li> 1 시간 동안 50 ml의 표준 SPPS 용기에서 디메틸 포름 아미드 (DMF)에 링크 아미드 MBHA 수지 500 mg의 팽창. </li><li> . 20 % 피 페리 딘 용액 (DMF 중 20 % 피 페리 딘 10 ㎖ (0.30 밀리몰)에서의 Fmoc 보호 된 수지를 배양함으로써 및 Fmoc 탈 보호를 수행하여 (1 X 5 분 및 세정 공정으로 1 × 15 분)을 사용하여 두 번 탈 보호 단계를 수행 DMF는 (세정 공정은 DMF 약 150 ml의 총 부피로 수지를 여러 번 세척하고, 진공 여과에 의해 용매를 제거하는 단계를 포함) 사이의 반응. </li><li> 링크 아미드 MBHA 수지에 CK (TMR) RKKRRQRRRG (fTAT)를 합성. 사용의 Fmoc 아미노산 보호 다음의 Fmoc-리스 (MTT) -OH (만​​ N- 말단에)의 Fmoc-리스 (BOC)를 -OH,의 Fmoc-의 Gly-OH,의 Fmoc, 인수 (PBF) -OH,의 Fmoc- GLN (Trt가) -OH, Fmoc 등-개의 Cys (Trt가) -OH. 반응물을 교반하는 N 2 (20 PSI)을 사용하여 반응을 수행한다. 실온에서 모든 반응을 수행합니다. <ol><li> 4 시간에 대한 각각의 아미노산의 커플 링 반응을 수행한다. 각각의 커플 링에 대해,의 Fmoc 아미노산 (1.2 밀리몰), N, N, N &#39;, N&#39;테트라 메틸 -O- (벤조 트리아 졸 1 H -1- ​​일) 우로 늄 헥사 플루오로 포스페이트 (HBTU) (0.44 g, 1.1 밀리몰 보호 사용 DMF에 용해) 및 디 이소 프로필 에틸 아민 (DIEA) (0.51 ㎖, 3.0 밀리몰). 4 시간 커플 링 후, DMF로 수지를 세척하고, 단계 1.2에 기재된대로의 Fmoc 탈 보호 단계를 수행한다. </li><li> (: CKRKKRRQRRRG없는 TMR 선형 펩타이드 체인)를 합성 하였다 fTAT의 선형 펩타이드 체인이 될 때까지 반복합니다. </li><li> 그리고 철저하게 처음으로 DMF를 사용하고, 디클로로 메탄 (DCM)와 그 다음의 수지를 씻는다. DMF 또는 DCM 약 150 ml의 총 부피로 수지를 여러 번 헹구고, 진공 여과에 의해 용매를 제거한다. </li><li> 유SE MALDI-TOF 수득 펩티드 정확한 분자량을 지니는 것으로 확인되었다. <ol><li> 수용액을 0.01 % TFA의 50 μL 아세토 니트릴 50 μL로 이루어지는 용액에 매트릭스 1mg을 첨가하여 혼합 행렬을 만든다. </li><li> 선형 펩티드 사슬 질량을 확인하기 위해, α - 시아 노 -4- 히드 록 시신 남산을 사용한다. 원유 펩타이드의 분석 HPLC를 실행하고 순수한 피크의 정상에서 50 μl를 수집합니다. </li><li> MALDI 접시에 플레이트에 샘플을 준비하려면 다음 건조 또는 37 ° C의 열 접시에 방영하는 MALDI 접시에 매트릭스 솔루션과 장소 2 μL에 펩티드의 8 μl를 추가합니다. 참고 : 아르기닌은 SPPS 부부 어려운 아미노산으로 알려져있다. 성공적인 결합 카이저 테스트 (14) (예를 들어 닌히 드린 시험)을 수행함으로써 성립된다. 이 테스트는 수지에 남아있을 비결 유리 아민의 검출을 허용한다. 경우 청색 (유리 아민의 존재를 나타내는) 검출되고, 결합의TEPS는 반복된다. </li></ol></li></ol></li><li> CK를 들어 (-NH-TMR) TATG (fTAT), 1 % 트리 플루오로 아세트산 (TFA) 및 2 % 트리 이소 프로필 실란으로 이루어지는 용액 CK에 라이신의 아미노 그룹에 (-NH-MTT) TATG을 MTT 보호기를 절단 DCM에서 (TIS). <ol><li> MTT 보호기의 제거는 황색의 외관 초래로서, 5 분 동안 상기 용액 20 mL를 수지 부화에는 황색이 관찰되지 않을 때까지 이것을 반복한다. 사이에서 DCM 및 DMF로 수지를 씻으십시오. TIS는 MTT를 청소할 것 폐품이 또한 있기 때문에, 한 번 더 옐로우 색상은 MTT의 존재 용액에 표시되지 않습니다. </li><li> MTT를 더 이상 보장되지하는 수지에 DCM 중 1 % TFA (NO TIS)와 추가 용액을 첨가하여 제거하고, 맑은 용액이 남아있다. </li></ol></li><li> 의 DMF (() 밀리그램에서 수지의 양에 대하여 4, 3.9, 10 등가) Carboxytetramethylrhodamine (TMR), HBTU 및 DIEA이 혼합물을 추가 세 가지 구성 요소를 녹여수지에 첨가하고, 반응을 실시 O / N는 교반을 제공하기 위해 건조 N 2를 사용. </li><li> 의 Fmoc 탈 보호 및 아미노산 결합 후, DCM으로 수지를 세척하고 건조 할 수 있습니다. 수지로부터 펩티드의 완전한 분해를 위해, 92.5 % TFA, 2.5 %를 함유하는 용액을 첨가 H 2 O, 2.5 %, TIS 및 3 펩 티딜 - 수지에 2.5 %의 에탄 디티 올 (EDT) (전체 부피 = 4 mL) 중 실온에서 시간은 수지에서 세계 탈과 분열을 달성했다. <ol><li> 잇 2 O 40 ml의에 단계 1.6에서 솔루션을 배출하여 추운 무수 에틸 에테르 (ET 2 O)를 사용하여 원유 펩타이드 제품을 침전, 4 ° C에서이 스핀 다운 20 4,000 XG - 25 분. 감기 무수 잇 2 O와 침전물의 세척을 할 수 있도록이 단계를 반복합니다 </li><li> 물 (5 ㎖ 또는 침전이 완전히 용해 될 때까지) 및 동결 건조를 침전물을 재현 탁. 이어서 0.1 % 수성 TFA / 아세토 니트릴에서 얻은 제품을 재현 탁. </li></ol></li> &lt;리&gt; 분석 C18 컬럼 (5 μm의, 4 × 150mm) 각각의 펩타이드를 분석하여 HPLC 분석을 수행합니다. 214 nm 내지 550 nm에서 유량 1 ㎖ / 분의 속도 및 검출을 사용한다. </li><li> 펩타이드 정제를위한 C18 10 × 250mm 컬럼에 반 예비 HPLC를 수행합니다. 214 nm 내지 550 nm에서 유량 4 ml / 분의 속도 및 검출을 사용한다. 모든 실행을위한 0.1 % 수성 TFA (용매 A)와 90 % 아세토 니트릴, 9.9 % 물, 0.1 % TFA (용매 B)의 선형 구배를 사용한다. </li><li> fTAT 예상 질량 : 2,041.17, 관찰 물질 : 2040.66 제조사의 프로토콜에 따라 MALDI-TOF에 의해 펩타이드의 정확한 신원을 확인합니다. 대량 예상 DEAC-K9 : 1,415.59 : 1,412.97을, 질량을 관찰했다. MALDI-TOF에 대한 α- 시아 노 -4- 히드 록 산 행렬을 사용합니다. </li></ol> 2. 산화 반응 : dfTAT 세대 <ol><li> 1 시간 (아래의 반응에 대해 적어도 5 ㎖) 인산염 완충 식염수 (PBS)를 pH 7.4의 통기. </li><li> AER에 fTAT (0.3 ㎎, 1.5 × 10-4 밀리몰) 용해ated PBS pH 7.4의 (5 mL)을 첨가 하였다. 펩타이드를 첨가 한 후 7.5 - pH가 7.0 사이에 있는지 확인합니다. 수산화 나트륨을 추가 할 경우 (작은 단위로 1 M을, 1-5 μL)를 다시 7.4까지 pH를 가지고 있습니다. </li><li> 주 : PBS에 용해 된 산소가 fTAT에 티올 그룹을 산화시키고 이황화 결합을 형성하는 역할을한다. </li><li> 반응을 Nutate O / N은 ​​완료 (HPLC 분석에 기초하여 수율 100 %)까지 반응 할 수있다. 역상 HPLC를 사용하여 생성물을 정제하여 단계 1.9에서와 같이, 질량 스펙트럼 (MALDI-TOF)에 의해 분석한다. 예상 질량 : 4,084.21 : 4,080.34을, 질량을 관찰했다. </li><li> 200 μL 물에 동결 건조 순수 dfTAT (0.71 X10 -4 mmol)을 재현 탁 (농도 순수한 dfTAT = 356.3 μM). </li></ol> 3. dfTAT 농도를 측정 <ol><li> TCEP 50 mM의 용액 149 μL에 dfTAT 정제 (정제 된 펩타이드의 양에 따라 전형적으로 1 μL)의 분취 량을 재현 탁. </li><li> 참고 :이 단계에서 dfTAT이 모로 감소nomer 대응 fTAT 인해 dfTAT에서 TMR의 형광의 근접 (dfTAT에서 TMR의 흡광 계수 ε가 감소 fTAT에서 TMR의 ε에 비해 감소)에 발생하는 흡수 담금질을 제거합니다. </li><li> 샘플을 약 20 분 동안 반응하도록 허용 (HPLC 분석은 fTAT의 형성을 확인하기 위해 사용될 수있다). </li><li> 석영 큐벳에 모든 솔루션을 추가하고 556 nm에서 흡광도를 측정한다. </li><li> 맥주의 법칙을 사용하여 (= εcl : ε = 91,500 M -1 cm -1), fTAT의 농도를 계산 dfTAT의 농도를 결정하고, 2로 [fTAT] 분할합니다. </li></ol> 4. 셀룰러 배달 실험 <ol><li> 90 % (예를 들면,도 8 또는 24 웰 접시) - (80)의 포화 상태로 접시에 세포 (. 헬라, HDF, 등) 시드. 37 ° C에서 90 % 컨 플루 - 적절한 배지에서 세포를 성장 80까지 (예를 들어, DMEM은 10 % FBS 및 펜 / 스트렙토 보충)5 % CO 2를 함유하는 가습 분위기. </li><li> (그 세 번 제거한 다음 PBS 200 μl를 첨가함으로써) 세포를 PBS로 3 회 (3 회) 세척 하였다. </li><li> (8 잘 전체 볼륨이 200 μL해야 요리) NRL-15 미디어 (물) dfTAT의 주식을 희석하여 dfTAT의 5 μm의 작업 농도를 확인합니다. 5 μm의 dfTAT의 농도는 효율적인 배달 날짜 (그림 3)에 테스트 대부분의 세포 유형에 (접시에 존재하는 세포의 90 % 이상에서 세포질 전달의 높은 수준)에 연결됩니다. 그러나 낮거나 높은 농도의 침투에 대한 높은 또는 낮은 성향을 가진 세포 유형에 더 적합 할 수 있습니다. 용지에 대한 참고 :이 dfTAT의 이황화 결합을 감소시킬 수 시스테인을 포함하지 않기 때문에 NRL-15은 dfTAT의 전달에 사용됩니다. 그러나, 우리의 데이타는 모두 정규 L-15 (시스테인)과 DMEM는 전달 매체로서 이용 될 수 있음을 나타낸다. L-15은 감소 아미노산 시스테인 있지만, 시스테인을 포함 presumabLY는 (DMEM은 시스테인과 배합) 시스틴을 형성하는 배지에서 산화. dfTAT 따라서 이러한 미디어에 그대로 남아 및 배달 nrL15 얻은 것과 동일한 효율로 작동합니다. </li><li> 또는화물없이 dfTAT (5 μM) (예., EGFP (10 μM))과 함께 세포를 인큐베이션하고 (배양 시간이 감소 될 수 있지만 dfTAT 전형적 엔도 좀 누출을 유도하는 약 30-45 분을 필요로 1 시간 동안 37 ℃에서 유지 ). </li><li> (3 세척을 권장) 세포의 세포막에 결합 dfTAT을 제거하기 위해 L-15에 헤파린 (1 ㎎ / ㎖)로 세포를 씻으십시오. </li><li> 에 따른 세포 투과성 핵 염색으로 세포를 인큐베이션 예., SYTOX 블루, SYTOX 그린 (NRL-15의 2 μM)을, 세포의 세포막이 손상되는지 여부를 결정하기 위해 (생균은 것은 아니지만 사균은 염색한다) 제조 업체의 프로토콜입니다. </li><li> 형광 현미경 (100X 오일 침지 또는 20X 대물 렌즈)를 사용하여 화상 세포. RFP 필터를 사용하여 이미지 dfTAT (예 =560 ± 20 nm의 / 엠 = 630 ± 35 ㎚). 주 : 성공적인 배달 셀에 걸쳐 dfTAT의 확산 형광 (응용 프로그램에 따라 다릅니다 단백질 또는 관심의 펩타이드의 전달을 평가)에 연결됩니다. fTAT (세포질 엔트리 dfTAT시의 환원 생성물) 핵소체 의해 염색이 검출 형광 세포가 있다는 표시로서 사용될 수있다. fTAT는 몇 시간 내에 저하됩니다. 이 시점에서, 분해 단편의 형광 반점으로 나타나는 것이다. 이 dfTAT가 실패 (dfTAT는 농도가 너무 낮은에있을 경우이 발생할 수 있습니다) 엔도 좀 안에 갇혀 상태를 유지하는 경우도 볼 수있다 반점 배포 혼동하지 마십시오. </li></ol> 배달 MOI 5. 및 관리 농도 <ol><li> 사용되는 세포 유형에 dfTAT의 효율적인 세포질 방출을 달성하는 데 필요한 &quot;최적의 전달&quot;농도를 확인합니다. increasin 배양 세포에 형광 현미경을 수행dfTAT g의 농도. 최적 dfTAT 농도 세포질 취소 리드 최소 농도로 정의된다 배양 세포의 약 100 %에 TMR 형광 &quot;확산&quot;. </li><li> (dfTAT의 최적 농도를 제공하여, 예) dfTAT 농도를 일정하게 유지하면서 MOI의 농도가 공동 배양 프로토콜에서 사용되는 변화한다. 1 시간 미만으로 배양 시간을 변경하면 MOI 전달의 양을 변화 옵션 일 수있다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

사람이 지나치게 합류 안된다 dfTAT 전달을 위해 사용되는 세포 (&gt; 90 % 컨 플루 언시)을 전달 효율에 영향을 미칠 수도있다. 세포는 건강해야한다 : 문화의 죽은 세포는 dfTAT이 (저하 핵에서 예를 들어, DNA)을 상호 작용할 수있는 세포 사멸 조각을 해제 할 수 있습니다. 차례로이 전달 효율과 영상의 품질을 방해 할 수 있습니다. 세포 dfTAT를 추가하기 전에 FBS를 제거하기 위해 철저하게 세척해...

생균에 단백질, 펩타이드 또는 세포 투과성 작은 분자의 전달은 많은 생물 또는 생물 공학적 응용 (셀룰러 이미징 기능 분석, 세포 리 프로그래밍, 등.) 1-4에 종종 바람직하다. 다수의 전달 방법은 이미 미세 주입, 전기 천공, 또는 운반 제의 사용을 포함하여,보고되고있다 (예., 예컨대 TAT 같은 세포 투과 펩티드, 지질) 5-7. 각 기술은 일반적으로 특정 응용 프로그램에 대한 아니라 다른 사람에 대한 이러한 접근 방식이 적절 할 수있는 특정 장단점이 있습니다. 일반적인 문제는 소수의 세포가 아니라 전체 인구 및 / 또는 부족 8,9 전달 얼마나 많은 물질의 제어, 독성 또는 해로운 생리 학적 영향 10, 11, 시간 제어의 부족, 배달의 가난한 전달 효율을 (포함 예 :., 마이크로 인젝션) (12) 및 복소 공액 또는 화학적 제제 스킴 11. S = &quot;jove_content은&quot;&gt; 최근에, 우리는 이러한 한계를 우회하는 새로운 배달 전략을 개발했다. 이 전략은 dfTAT라는 펩타이드 (이량 체 형광 TAT) (13)에 의존한다. dfTAT는 잘 알고 세포 침투 펩타이드 (CPP) TAT에서 파생됩니다. dfTAT는 형광의 테트라 메틸 표지 TAT의 두 이황화 결합 사본이 포함되어 있습니다. 그들의 유사성에도 불구하고, TAT와 dfTAT 활동에 유의 한 차이. TAT는 일반적으로 엔도 시토 시스에 의해 세포로 내재화된다. 이 CPP 그러나 대부분 (형광 현미경으로 관찰 할 때 일반적으로 세포 내부의 펩타이드의 반점이 분포지도) 엔도 좀 안에 갇혀 상태를 유지합니다. TAT처럼 dfTAT 효율적으로 세포에 의해 endocytosed된다. 그러나 dfTAT는 엔도 좀 안에 갇혀 유지하지 않습니다. 대신에, 그것은 매우 효율적 방식으로 엔도 좀 누설을 매개한다. dfTAT의 endosomolytic 활동은 단순한 배양 분석에 의해 고분자를 제공하기 위해 이용 될 수있다. 다음 ntent &quot;&gt; 전달 프로세스의 현재의 이해이다. dfTAT가 macropinocytosis를 유도한다. 따라서, dfTAT 배양 세포는 액체 상으로 배지에서 본 가용성 단백질, 펩타이드, 또는 작은 분자 (관심 분자 MOI) 차지 엔도 시토 시스는 (도 1 참조). dfTAT 및 MOI 사이의 상호 작용이 함께 세포 내 이입 경로 내의 두 엔티티 트래픽 것이면 불필요하다. dfTAT가 이입 소기관의 루멘 내에서 특정 임계 값에 도달 할 때, 그것은 그것의 엔도 좀 누설 활동 (분자량 상세 표현 dfTAT이기 때문에,이 방식 또한. 따라서 MOI와의 접합이나 배합 방식이 필요하지 않다로 매우 편리하다.). 완전히 특성화 될 누설 소기관의 루멘의 내용을 유지하며, 따라서 MOI 후 세포 내로 방출 세포 내 전달이 달성되면 직접 수정하지 MOI, 또한 MOIs 기능을 방해해서는 안된다. 또한, 농도를dfTAT 배달 미디어에서 MOI의 독립적 인 사용. 예를 들어, dfTAT 농도는 엔도 좀 누설 재현성 효율을 보장하기 위해 여러 실험과 일정하게 유지할 수있다. 대조적으로, 미디어 MOI의 농도는 점차 MOI가 시토 졸 전달의 원하는 레벨을 달성하기 위해 변경 될 수있다. dfTAT 달성 높은 엔도 좀 누설 효율은 현재까지 테스트 한 세포의 많은 현저하게 무해하다. 세포 내 이입 세포 소기관이 세포의 중요한 구성 요소이며, 하나 dfTAT에 의해 매개 극적인 누설이 해로운 세포 반응을 동반 할 것이라고 기대하기 때문 놀라운 일이다. 그러나, 처리 된 세포는 비 처리 세포와 동일한 속도로 증식 및 그들의 사체에 상당한 변화를 표시하지 않는다. 또한, 배달 세포 손실없이 전달 프로세스에서 용납 또는 복구 할 수 있음을 나타내는 하나 재현성 전달 효율을 가진 분 내에서 반복 될 수있다엔도 시토 시스 또는 엔도 좀 누설에 대한 자신의 능력. 미묘한 세포 반응은 dfTAT 제공 및 이러한 응답이 탐험 남아있을 수 있습니다 무엇의 분자 세부 동안 자리를 차지할 수 있습니다. 그러나, 높은 효율, 프로토콜의 편의 및 독성 부족을 결합하여, 이러한 전송 방식은 다수의 세포 - 기반 애플리케이션에 즉시 유용한다. 여기에 제시된 프로토콜은 연구 커뮤니티에이 기술이 액세스 할 수 있도록 목표로하고 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Heparin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>CAS 9041-08-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Blue</td><td>Invitrogen</td><td>S11348</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Invitrogen</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>nrL15 L-15 (&amp;ndash;) cysteine</td><td>Hyclone</td><td></td><td>Special order</td></tr><tr><td>Fmoc-protected Amino acids</td><td>Novabiochem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dfTAT</td><td></td><td></td><td>Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu)</td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted epifluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td>model IXB1</td><td>equipped with a heating stage maintained at 37 &amp;deg;C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C humidified, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

delivery of proteins, peptides or cell-impermeable small molecules into live cells by incubation with the endosomolytic reagent dftat

고분자 배달 전략은 일반적으로 세포 항목의 경로로 세포 내 이입 경로를 사용합니다. 하지만, 엔도 좀 포획 심각 세포 세포질 공간에 침투 고분자의 효율성을 제한한다. 최근에는 시약 dfTAT, 형광 물질로 표지 된 테트라 메틸 TAT 펩타이드의 이황화 결합의 이량 체를 식별하여이 문제를 회피하고있다. 우리는 생균을 관통하고, 특히 고효율로 세포의 세포질 공간에 도달 원형 세포 투과 펩티드 (CPP) TAT, dfTAT의 형광 표지 된 이량 체를 생성 하였다. dfTAT의 시토 졸 전달은 일차 세포를 포함한 여러 세포주에서 얻어진다. 또한, 배달 띄게 세포 생존, 증식 또는 유전자 발현에 영향을주지 않는다. dfTAT는 소분자, 펩티드, 항체, 효소 및 생물학적 활성 전사 인자를 전달할 수있다. 이 보고서에서 우리는 DFTA에 포함 된 프로토콜을 설명T 합성 및 세포 배달. 원고는 세포 외로 투여 된 단백질의 양을 변화시켜 세포의 세포질 공간으로 전달 단백질의 양을 제어하는​​ 방법을 설명합니다. 마지막으로,이 새로운 기술 및 배달 검증에 관련된 단계의 현재 제한이 논의된다. 설명 된 프로토콜은 세포 기반 분석법뿐만 아니라 세포의 생체 외 조작 및 리 프로그래밍에 매우 유용 할 것이다.

fTAT dfTAT과의 차이를 평가하기 위해, HeLa 세포들은 세포 지역화의 차이를 결정하기 위해 각각의 펩타이드로 1 시간 동안 배양 하였다. 두개의 CPP의 내재화를 형광 현미경을 사용하여 평가 하였다. fTAT (20 μM)은 점상 분포에 편재 2는 도표. 펩타이드는 엔도 좀 내부에 갇힌 나머지이 분포는 일치한다. 대조적으로, dfTAT (5 μM)의 형광 신호는 세포질 및 핵 걸쳐 균일 분포를 표시한다.?...

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Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

Endosomolytic 시약 dfTAT와 배양 라이브 세포에 단백질, 펩타이드 또는 세포 투과성 작은 ​​분자의 배달

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

delivery-proteins-peptides-or-cell-impermeable-small-molecules-into

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K 조회수.  Texas A&M University. We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky. 

비디오: Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Physical interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane protein complexes and in dynamic processes such as transmembrane (TM) signaling and regulation of cell-surface protein levels. Understanding the structural features driving the association of particular sequences requires sophisticated biophysical and biochemical analyses of TM peptide complexes. However, the extreme hydrophobicity of TM domains makes them very difficult to manipulate using standard peptide chemistry techniques, and production of suitable study material often proves prohibitively challenging. Identifying conditions under which peptides can adopt stable helical conformations and form complexes spontaneously adds a further level of difficulty. Here we present a procedure for the production of homo- or hetero-dimeric TM peptide complexes from materials that are expressed in E. coli, thus allowing incorporation of stable isotope labels for nuclear magnetic resonance (NMR) or non-natural amino acids for other applications relatively inexpensively. The key innovation in this method is that TM complexes are produced and purified as covalently associated (disulfide-crosslinked) assemblies that can form stable, stoichiometric and homogeneous structures when reconstituted into detergent, lipid or other membrane-mimetic materials. We also present carefully optimized procedures for expression and purification that are equally applicable whether producing single TM domains or crosslinked complexes and provide advice for adapting these methods to new TM sequences.

Biophysical and biochemical studies of interactions among membrane-embedded protein domains face many technical challenges, the first of which is obtaining appropriate study material. This article describes a protocol for producing and purifying disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes that are suitable for structural analysis by solution nuclear magnetic resonance (NMR) and other analytical applications.

구조 연구 생산 이황화 - 안정화 Transmembrane의 펩타이드 단지

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

연구

화학

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

강력한, 미세 유체 세포 내 전달 플랫폼으로 휴대 뒤쪽에서

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

생체공학

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum (ER) resident proteins implicated in homotypic fusion of the ER. We detail here a method for purifying a glutathione S-transferase (GST) and poly-histidine tagged Drosophila atlastin by two rounds of affinity chromatography. Studying fusion reactions in vitro requires purified fusion proteins to be inserted into a lipid bilayer. Liposomes are ideal model membranes, as lipid composition and size may be adjusted. To this end, we describe a reconstitution method by detergent removal for Drosophila atlastin into preformed liposomes. While several reconstitution methods are available, reconstitution by detergent removal has several advantages that make it suitable for atlastins and other similar proteins. The advantage of this method includes a high reconstitution yield and correct orientation of the reconstituted protein. This method can be extended to other membrane proteins and for other applications that require proteoliposomes. Additionally, we describe a FRET based lipid mixing assay of proteoliposomes used as a measurement of membrane fusion.

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Biological membrane fusion is catalyzed by specialized fusion proteins. Measuring the fusogenic properties of proteins can be achieved by lipid mixing assays. We present a method for purifying recombinant Drosophila atlastin, a protein that mediates homotypic fusion of the ER, reconstituting it to preformed liposomes, and testing for fusion capacity.

지질 혼합 애신을 위한 리포솜으로 재조합 초파리 아틀라스틴의 세제 지원 재구성

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

생화학

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. This information is particularly valuable in the context of host-pathogen interactions. Many pathogen proteins function within host cells in a variety of way such as, enabling evasion of the host immune system and survival within the intracellular environment. To study these pathogen-protein host-cell interactions, several approaches are commonly used, including: in vivo infection with a strain expressing a tagged or mutant protein, or introduction of pathogen genes via transfection or transduction. Each of these approaches has advantages and disadvantages. We sought a means to directly introduce exogenous proteins into cells. Electroporation is commonly used to introduce nucleic acids into cells, but has been more rarely applied to proteins although the biophysical basis is exactly the same. A standard electroporator was used to introduce affinity-tagged bacterial effectors into mammalian cells. Human epithelial and mouse macrophage cells were cultured by traditional methods, detached, and placed in 0.4 cm gap electroporation cuvettes with an exogenous bacterial pathogen protein of interest (e.g. Salmonella Typhimurium GtgE). After electroporation (0.3 kV) and a short (4 hr) recovery period, intracellular protein was verified by fluorescently labeling the protein via its affinity tag and examining spatial and temporal distribution by confocal microscopy. The electroporated protein was also shown to be functional inside the cell and capable of correct subcellular trafficking and protein-protein interaction. While the exogenous proteins tended to accumulate on the surface of the cells, the electroporated samples had large increases in intracellular effector concentration relative to incubation alone. The protocol is simple and fast enough to be done in a parallel fashion, allowing for high-throughput characterization of pathogen proteins in host cells including subcellular targeting and function of virulence proteins.

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

포유 동물 세포에 기능 세균 이펙터의 전기

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

면역학 및 감염병학

Engineering Cell-permeable Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can make use of the translocating ability of so-called cell penetrating peptides (CPPs), also designated as protein transduction domains (PTDs). The TAT-CPP derived from the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Tat (trans-activator of transcription) protein has been widely used. The positively charged TAT promotes cell permeability thereby overcoming the barriers of the cellular membrane by endocytosis or/and direct membrane penetration2. In combination with a nuclear localization signal (NLS) fusion proteins are able to enter the nucleus exhibiting functionality. Our video presentation demonstrates, as an exemplification for the engineering of cell-permeable proteins, the construction, production and application of a cell-permeable version of the DNA-modifying enzyme Cre.
Cre is a site-specific recombinase that is able to recognize and recombine 34 base pair loxP sites in mammalian cells in vitro and in vivo. Therefore the Cre/loxP system is widely used to conditionally induce mutations in the genome of living cells3,4. The delivery of active Cre recombinase to cells, however, represents a limitation.
We describe the pSESAME vector system, which allows a direct insertion of the gene-of-interest and provides a platform to rapidly clone different domains and tags used within the vector in a convenient and standardized manner. Rearranging of the different tags has been shown to modify the biochemical properties of the fusion proteins providing a possibility to achieve higher yield and better solubility. We demonstrate how to express and purify recombinant cell-permeant proteins in and from E. coli. The functionality of the recombinant Cre protein is finally validated in cell culture by assessing its intracellular recombinase activity.

Protein transduction enables the direct delivery of biologically active proteins into cells. In contrast to conventional methods such as DNA transfection or viral transduction this non-invasive paradigm allows highly efficient cellular manipulation in a titratable manner circumventing cellular toxicity and the risk of oncogenic transformation by permanent genetic modification.

공학 세포 투과 단백질

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can ...

생물학

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1. Many of these are referred to as cell-penetrating peptides, which are frequently noted for their potential as drug delivery vectors1-3. Moreover, there is increasing interest in antimicrobial peptides that operate via non-membrane lytic mechanisms4,5, particularly those that cross bacterial membranes without causing cell lysis and kill cells by interfering with intracellular processes6,7. In fact, authors have increasingly pointed out the relationship between cell-penetrating and antimicrobial peptides1,8. A firm understanding of the process of membrane translocation and the relationship between peptide structure and its ability to translocate requires effective, reproducible assays for translocation. Several groups have proposed methods to measure translocation into large unilamellar lipid vesicles (LUVs)9-13. LUVs serve as useful models for bacterial and eukaryotic cell membranes and are frequently used in peptide fluorescent studies14,15. Here, we describe our application of the method first developed by Matsuzaki and co-workers to consider antimicrobial peptides, such as magainin and buforin II16,17. In addition to providing our protocol for this method, we also present a straightforward approach to data analysis that quantifies translocation ability using this assay. The advantages of this translocation assay compared to others are that it has the potential to provide information about the rate of membrane translocation and does not require the addition of a fluorescent label, which can alter peptide properties18, to tryptophan-containing peptides. Briefly, translocation ability into lipid vesicles is measured as a function of the Foster Resonance Energy Transfer (FRET) between native tryptophan residues and dansyl phosphatidylethanolamine when proteins are associated with the external LUV membrane (Figure 1). Cell-penetrating peptides are cleaved as they encounter uninhibited trypsin encapsulated with the LUVs, leading to disassociation from the LUV membrane and a drop in FRET signal. The drop in FRET signal observed for a translocating peptide is significantly greater than that observed for the same peptide when the LUVs contain both trypsin and trypsin inhibitor, or when a peptide that does not spontaneously cross lipid membranes is exposed to trypsin-containing LUVs. This change in fluorescence provides a direct quantification of peptide translocation over time.

This protocol details a method for the quantitative measure of peptide translocation into large unilamellar lipid vesicles. This method also provides information about the rate of membrane translocation and can be used to identify peptides that efficiently and spontaneously cross lipid bilayers.

대형 Unilamellar Vesicles로 펩타이드의 Translocation 측정

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

세포 투과성의 Cys를 사용하여 포유 동물 세포에 직접 단백질 배달<sub&gt; 2</sub&gt; - 그의<sub&gt; 2</sub&gt; 아연 손가락 도메인

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated exocytosis is fundamental for intercellular communication and is a key mechanism for the secretion of neurotransmitters, hormones, inflammatory mediators, and other compounds, by a variety of cells. At least three distinct mechanisms are known for regulated exocytosis: full exocytosis, where a single SG fully fuses with the plasma membrane, kiss-and-run exocytosis, where a single SG transiently fuses with the plasma membrane, and compound exocytosis, where several SGs fuse with each other, prior to or after SG fusion with the plasma membrane. The type of regulated exocytosis undertaken by a cell is often dictated by the type of secretory trigger. However, in many cells, a single secretory trigger can activate multiple modes of regulated exocytosis simultaneously. Despite their abundance and importance across cell types and species, the mechanisms that determine the different modes of secretion are largely unresolved. One of the main challenges in investigating the different modes of regulated exocytosis, is the difficulty in distinguishing between them as well as exploring them separately. Here we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran as an exocytosis reporter, and live cell imaging, to differentiate between the different pathways of regulated exocytosis, focusing on compound exocytosis, based on the robustness and duration of the exocytic events.

Here we detail a method for live cell imaging of regulated exocytosis. This method utilizes FITC-dextran, which accumulates in lysosome-related organelles, as a reporter. This simple method also allows distinguishing between different modes of regulated exocytosis in cells that are difficult to manipulate genetically.

이미징 FITC-dextran 규제 Exocytosis 위한 기자로 서

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...

Bead Loading Proteins and Nucleic Acids into Adherent Human Cells

Many live-cell imaging experiments use exogenous particles (e.g., peptides, antibodies, beads) to label or function within cells. However, introducing proteins into a cell across its membrane is difficult. The limited selection of current methods struggles with low efficiency, requires expensive and technically demanding equipment, or functions within narrow parameters. Here, we describe a relatively simple and cost-effective technique for loading DNA, RNA, and proteins into live human cells. Bead loading induces a temporary mechanical disruption to the cell membrane, allowing macromolecules to enter adherent, live mammalian cells. At less than 0.01 USD per experiment, bead loading is the least expensive cell loading method available. Moreover, bead loading does not substantially stress cells or impact their viability or proliferation. This manuscript describes the steps of the bead loading procedure, adaptations, variations, and technical limitations. This methodology is especially suited for live-cell imaging but provides a practical solution for other applications requiring the introduction of proteins, beads, RNA, or plasmids into living, adherent mammalian cells.

Bead loading introduces proteins, plasmids, and particles into adherent mammalian cells. This cell loading technique is inexpensive, rapid, and does not substantially affect cell health. It is best suited for live-cell imaging.

구슬로 단백질과 핵산을 부착된 인간 세포로

Many live-cell imaging experiments use exogenous particles (e.g., peptides, antibodies, beads) to label or function within cells. However, introducing ...

Live Fluorescence, Inverse Imaging of Cell Ruffling, and Macropinocytosis

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase nutrients and other material in cells. The dramatic extension of cell surface ruffles, their closure to form macropinosomes, and the maturation of internalized macropinosomes are key events in this pathway that can be difficult to capture using conventional confocal imaging based on tracking a bolus of fluorescent cargo. Fluorescent dextrans are commonly used experimentally as fluid phase markers for macropinosomes and for other endocytic pathways. A method the lab has adopted to optimize the imaging of dextran uptake involves using live imaging of cells bathed in high concentrations of fluorescent dextran in the medium, with the unlabeled cells appearing in relief (as black). The cell ruffles are highlighted to visualize ruffle closure, and internalized macropinosomes appear as fluorescent vacuoles in the cell interior. This method is optimal for visualizing macropinosome features and allows for easy segmentation and quantification. This paper describes dual-labeling of pathways with different sized dextrans and the co-expression of lipid probes and fluorescent membrane proteins to demark macropinosomes and other endosomes. The detection of internalized dextran at an ultrastructural level using correlative light and electron microscopy (CLEM) is also demonstrated. These cell processes can be imaged using multiple live imaging modalities, including in 3D. Taken together, these approaches optimize macropinosome imaging for many different settings and experimental systems.

<meta charset="utf8"></head><body>Live Fluorescence, Inverse Imaging of Cell Ruffling 및 Macropinocytosis

This protocol demonstrates dextran imaging in live cells using continuous uptake and inverse images to optimize visualization of ruffling, macropinosome maturation, and analysis of dextran and other cell labelings.

Live Fluorescence, Inverse Imaging of Cell Ruffling 및 Macropinocytosis

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase ...

Endosomolytic 시약 dfTAT와 배양 라이브 세포에 단백질, 펩타이드 또는 세포 투과성 작은 분자의 배달

요약

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이 비디오의 챕터

구조 연구 생산 이황화 - 안정화 Transmembrane의 펩타이드 단지

강력한, 미세 유체 세포 내 전달 플랫폼으로 휴대 뒤쪽에서

지질 혼합 애신을 위한 리포솜으로 재조합 초파리 아틀라스틴의 세제 지원 재구성

포유 동물 세포에 기능 세균 이펙터의 전기

공학 세포 투과 단백질

대형 Unilamellar Vesicles로 펩타이드의 Translocation 측정

세포 투과성의 Cys를 사용하여 포유 동물 세포에 직접 단백질 배달

이미징 FITC-dextran 규제 Exocytosis 위한 기자로 서

구슬로 단백질과 핵산을 부착된 인간 세포로

Live Fluorescence, Inverse Imaging of Cell Ruffling 및 Macropinocytosis

Endosomolytic 시약 dfTAT와 배양 라이브 세포에 단백질, 펩타이드 또는 세포 투과성 작은 ​​분자의 배달

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구조 연구 생산 이황화 - 안정화 Transmembrane의 펩타이드 단지

강력한, 미세 유체 세포 내 전달 플랫폼으로 휴대 뒤쪽에서

지질 혼합 애신을 위한 리포솜으로 재조합 초파리 아틀라스틴의 세제 지원 재구성

포유 동물 세포에 기능 세균 이펙터의 전기

공학 세포 투과 단백질

대형 Unilamellar Vesicles로 펩타이드의 Translocation 측정

세포 투과성의 Cys를 사용하여 포유 동물 세포에 직접 단백질 배달

이미징 FITC-dextran 규제 Exocytosis 위한 기자로 서

구슬로 단백질과 핵산을 부착된 인간 세포로

Live Fluorescence, Inverse Imaging of Cell Ruffling 및 Macropinocytosis

Endosomolytic 시약 dfTAT와 배양 라이브 세포에 단백질, 펩타이드 또는 세포 투과성 작은 분자의 배달