Para comenzar, coloque el ratón afeitado y anestesiado sobre una almohadilla térmica. Pellizque la piel con pinzas cerca del cuarto pezón y corte la piel levantada con unas tijeras afiladas para hacer una incisión en la línea media de aproximadamente un centímetro. Haga incisiones circulares alrededor de la glándula en dirección craneal y caudal, y retire con cuidado la piel del abdomen.
Eliminar rápidamente la sangre exógena con solución salina fisiológica para evitar la pérdida posterior de la resolución óptica. Para minimizar la pérdida de sangre, selle los vasos sanguíneos prominentes con un cauterizador manual. A continuación, cepille suavemente la capa superficial con pinzas finas para eliminar el tejido conectivo y adiposo superficial.
Mantenga la glándula expuesta húmeda con solución salina fisiológica. Si es necesario, trate la glándula con agentes exógenos, por ejemplo, agentes farmacológicos o tintes específicos de orgánulos bañando las glándulas expuestas durante la cirugía. Proteja la pared abdominal con una película termoplástica semitransparente y flexible.
Coloque cuidadosamente el ratón con el lado abdominal hacia abajo en una platina de microscopio invertida, de modo que el colgajo de piel se extienda sobre el cubreobjetos central. Proteja las áreas expuestas con una fina capa de gel. Pega la pata trasera y la cola al escenario.
Luego, coloque un espaciador con muescas hecho a medida preparado con tres palitos de algodón pegados con cinta adhesiva entre el colgajo de piel y la pared del cuerpo para amortiguar la glándula de los artefactos de movimiento causados por la respiración y los latidos del corazón. Tape firmemente una cubierta de plástico en cada extremo de la abertura de la platina para evitar que el colgajo de piel se deslice durante la toma de imágenes. Inserte un catéter permanente subcutáneo debajo de la piel dorsal conectado a un tubo, una jeringa y una bomba.
Utilizando microscopía de fluorescencia convencional, confirme que el colgajo de piel es estable con un flujo sanguíneo adecuado. Realizar microscopía confocal convencional del ratón con citocito/EGFP o ratón de membrana EGFP marcado con 665676 BODIPY y microscopía de dos fotones del ratón de membrana EGFP marcado con monodansilpentano y ratón de membrana tdTomato marcado con monodansilpentano. En ratones citocitos EGFP, el citoplasma de las células epiteliales secretoras fue marcado claramente por EGFP.
Al mismo tiempo, las gotas de lípidos teñidas con BODIPY 665676 aparecieron como cuerpos fluorescentes redondos, especialmente hacia la superficie apical. El análisis de lapso de tiempo mostró que BODIPY 665676 gotas de lípidos teñidas se movían de las regiones basales a las apicales a velocidades variables y se fusionaban entre sí en tránsito. En ratones con membrana de EGFP, EGFP destacó las membranas plasmáticas de las células epiteliales capilares y secretoras y las gotas de lípidos teñidas con BODIPY fueron visibles en todo el citoplasma.
Dos microscopías de fotones de las glándulas mamarias de ratones con membrana EGFP o con membrana tdTomato permitieron un estudio más exhaustivo de la morfología de la glándula. Las fibras de colágeno en la superficie se visualizan en el canal monodansilpentano a través de la segunda generación de armónicos. Más adentro del parénquima, se revela el epitelio secretor con membranas plasmáticas basales, laterales y apicales y gotas lipídicas teñidas con monodansilpentano.
La luz central se hace evidente más adentro del alvéolo. El fluoróforo rojo tdTomato fue especialmente útil para marcar el endotelio capilar, a diferencia del EGFP en los ratones citos EGFP.
