GVdB, via the University of Leuven (KU Leuven), receives long-term structural research support from the Methusalem Program funded by the Flemish Government (METH08/07) and holds a European Research Council Advanced Grant AdvG-2012-321670 from the Ideas Program of the European Union seventh framework program. SET received a Research Foundation-Flanders (FWO) Research Assistant Fellowship.

El protocolo fue aprobado por la Universidad de Lovaina Junta de Revisión Ética de Investigación Animal. 1. Preparación de la línea venosa <ol><li> Preparar la punta del catéter venoso sumergiendo rápidamente la parte media del tubo de 60 cm microrenathane (MRE) en aceite de sésamo caliente (&gt; 220 ° C). estirar Posteriormente la parte media del tubo para producir un diámetro estrecho (diámetro exterior (OD) &lt;0,5 mm) moviendo suavemente los extremos de la tubería de distancia unos de otros. </li><li> Utilice una hoja de bisturí para cortar el tubo en dos partes de 30 cm cada una (véase la Figura 1, Tabla 1). </li><li> Conectar el tubo de ERM al polietileno PE10 de mangueras mediante conector PE50 polietileno y conectar este tubo PE10 a la parte inferior de la pieza giratoria. Conectar la parte superior de la pieza giratoria a un tubo de PE10, y conectar esta a una aguja stub Luer con un tubo conector PE50 según la Figura 1. </li><li> Aplicar fuerte rápido acting pegamento adhesivo a todas las conexiones y probar el catéter de fugas mediante el lavado con aire. Gas esterilizar el catéter antes de su uso. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55553/55553fig1.jpg" /> Figura 1: Construcción de venoso Line. Líneas venosas se preparan por estirar el tubo MRE a un diámetro pequeño y de la conexión a través de un tubo de polietileno a un dispositivo de roedor giratoria. Véase la Tabla 1 para obtener instrucciones sobre longitudes de las diferentes partes. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55553/55553fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Leyenda </td><td> Longitud </td><td> Volumen </td></tr><tr><td> 1) de la aguja Luer stub 22GRAMO </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2) PE50 - polietileno de 0,023&quot; x 0,038&quot; </td><td> 5 cm </td><td> 13 l </td></tr><tr><td> 3) PE10 - polietileno de 0,011&quot; x 0,024” </td><td> 50 cm </td><td> 30 l </td></tr><tr><td> 4) Roedor giratorio 20 G </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5) PE-10 </td><td> 15 cm </td><td> 9 l </td></tr><tr><td> 6) PE-50 (conector) </td><td> 5 cm </td><td> 13 l </td></tr><tr><td> 7) MRE025 Tip extendió microrenathane 0,025&quot; x 0,012&quot; </td><td> 30 cm </td><td> 27 l </td></tr><tr><td> Suma total </td><td> 105 cm </td><td> 92 l </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Construcción de la línea venosa. Esta tabla proporciona una leyenda para la Figura 1. 2. Anestesia y Manejo pre-cirugía <ol><li> Use 24-semanas de edad C57BL / 6J (27 - 32 g). NOTA: Nosotros usamos ratones de 24 semanas de edad (adulto maduro), ya que la edad se corresponde mejor con la edad media de los pacientes de cuidados intensivos. Utilizamos sólo los ratones machos para evitar la influencia cíclica de estrógenos. La técnica también se puede utilizar en los animales más jóvenes (probado en ratones de edad de 16 semanas) y hembras, si se prefiere. </li><li> Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos antes de su uso. Enjuague el catéter venoso hecho en casa estéril con solución salina para eliminar las burbujas de aire y para la prueba de permeabilidad y fugas potenciales. </li><li> Cortar un alambre de metal (0,8 mm de diámetro) de 80 cm de longitud, el doble que por plegado y hacer un bucle. Lead 3 perlas sobre el alambre doblado al bucle. Una el catéter hasta el alambre de metal, guiando la punta del catéter a través de los 3 perlas. NOTA: El alambre de unión de metal es necesario para la rotación de la pieza giratoria a la que está conectado el catéter. Como tal, el ratón se puede mover libremente, sin bloquear la línea venosa. </li><li> Anestesiar al mouse por una inyección intraperitoneal (IP) de una mezcla de 0,03 ml de ketamina (100 mg / kg) y 0,02 ml de xilazina (13 mg / kg). Asegúrese de que la anestesia es adecuada comprobando la ausencia de reflejos. Tire suavemente de la lengua del ratón fuera con pinzas para evitar la asfixia por la ingestión de la lengua. NOTA: Si después de 10 min, el ratón todavía intenta retirar sus extremidades dan ketamina adicional como mL bolus 0,01. </li><li> Afeitar el área quirúrgica incluyendo abdomen, lado ventral del cuello (triángulo entre la barbilla, el esternón y la clavícula), y entre los omóplatos en la base de la cabeza). </li><li> Coloque el ratón en la posición de decúbito prono sobre una almohadilla de calefacción precalentado, la desinfección de la piel con 70% de etanol y aplicar una pequeña cantidad de lubricante oftálmica para proteger los ojos de la desecación. Infiltrarse en los sitios quirúrgicos (abdomen, cuello-frente y parte posterior) con 0,2 ml de ropivacaína (0,67 mg / kg). </li><li> Mientras que el ratón está todavía en posición de decúbito prono, hacer una pequeña incisión en la base de la cara dorsalde la cabeza con bisturí o tijeras. Exponer los músculos cervicales posteriores, y atar el músculo al bucle del alambre de fijación con 3,0 nylon, llevando un hilo 3,0 de nylon bajo el músculo. </li><li> Coloca el ratón sobre su lado derecho. Hacer una pequeña incisión vertical en la piel de la parte ventral del cuello con un bisturí o tijeras. Bajo la guía visual, túnel una vía subcutánea aguja de calibre 18 a través de esta incisión ventral hacia la incisión en la parte posterior hecha previamente y enroscar el catéter a través de la aguja para exteriorizar que en el lado ventral. </li><li> Coloca el ratón sobre su espalda. Pasar un hilo 3,0 de nylon detrás de los dientes incisivos superiores del ratón y la cinta hacia abajo a la almohadilla de calefacción. Fije la cabeza en una máscara de la cara para la entrega de oxígeno (2 L / min). Fijar el ratón en una posición estirada con cinta adhesiva por la cola y las dos patas delanteras. NOTA: Si la anestesia de ketamina-xilazina sola no es suficiente, isoflurano inhalado (0,5 - 1,5%) puede ser entregado durante la cirugía. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. La colocación de una sonda permanente crónica <ol><li> Coloca el ratón bajo el microscopio de disección. En la incisión hecha previamente en el cuello ventral, se burlan suavemente el tejido adiposo y glándulas de distancia con una pinza hasta la vena yugular puede ser visualizado. </li><li> Sin rodeos diseccionar para liberar la vena yugular del tejido conectivo y subcutánea encima del recipiente y alrededor colocando la punta de las pinzas entre la vena y el tejido conectivo y la apertura de las pinzas repetidamente en paralelo con la vena. Como tal, se evitará el daño a la vena. </li><li> Aislar la vena yugular mediante la colocación de pinzas romas bajo la vena. Alimentar a tres trozos de hilo de seda 3.0 bajo la vena, la posición de una pieza proximal a la bifurcación de la vena yugular (ligadura craneal) y una pieza cerca del músculo esternocleidomastoideo (caudal ligadura). Apretar la ligadura craneal y la ligadura caudal para estirar la vena y prevenir el sangrado excesivo mientras que la colocación del catéter. Tes decir, una ligadura floja con el hilo medio para asegurar la fácil fijación del catéter más adelante. </li><li> El uso de micro tijeras, hacer una incisión a lo largo de la vena entre las ligaduras craneal y caudal y lo suficientemente grande para pasar el catéter. Coge el catéter con fórceps, e insertar el catéter 11 mm en la vena. Sin apretar asegurar el catéter por la ligadura de la ligadura media y confirmar la colocación correcta enjuagando suavemente con solución salina estéril. </li><li> Asegurar el catéter por firmemente la ligadura de la ligadura media y caudal alrededor del vaso y el catéter. Tie termina de ligadura caudal y medio juntos para sujetar firmemente el catéter. Asegúrese de que los nudos no ocluyen la vena, por lavado del catéter después de cada nudo hecho. Por último, atar el caudal y ligaduras craneales. Cerrar la incisión con suturas de seda 5,0. </li></ol> 4. La ligadura y punción cecal <ol><li> Se practica una incisión en la línea media de 1 cm a través de la piel de la mitad inferior del abdomen con el escalpelo o las tijeras;tener cuidado de no penetrar en la cavidad peritoneal. </li><li> Identificar la línea alba de la musculatura abdominal y hacer una incisión intermuscular para ganar la entrada a la cavidad peritoneal. Localizar el ciego, y el uso de fórceps anatómicas contundentes para aislar el ciego y exteriorizar ella. </li><li> Ligar el ciego en 50% de su longitud con suturas de seda 3,0. Asegúrese de no ligar la válvula íleo-cecal de manera que se mantiene la continuidad intestinal. </li><li> Perforar el ciego con una aguja de calibre 18 por un solo a través de-y-a través de la mitad de punción entre la ligadura y la punta del ciego. Después de retirar la aguja, extruir una pequeña cantidad de heces desde el agujero para asegurar la permeabilidad. </li><li> Volver a colocar el intestino en la cavidad abdominal, y cerrar el peritoneo y la piel con suturas de seda 5,0. NOTA: En promedio, un nuevo aprendiz requiere de 10 a 15 animales para ser capaz de colocar suavemente el catéter venoso y realizar CLP dentro de 45 min. Después del período de entrenamiento, una anestesia / cirugía relaTed mortalidad del 10% se puede esperar. </li></ol> 5. El tratamiento post-quirúrgico y la reposición de líquidos <ol><li> Coloque el ratón en la posición supina y asegurar el catéter al cable de unión con cinta adhesiva. Mover el ratón a una jaula individual. Utilice un soporte con la abrazadera ajustable para sostener el dispositivo de giro 25 cm por encima del ratón y cinta firmemente la parte libre del cable de fijación de metal hasta el punto de la pieza giratoria en rotación. </li><li> Adjuntar una jeringa que contiene la mezcla de coloides y cristaloides equilibradas (1: 4) a la línea venosa para iniciar la reposición de líquidos. </li><li> Coloque la jaula en una temperatura controlada (27 ° C) gabinete animal con 12 h ciclos de luz y oscuridad y empezar la reposición de líquidos por vía intravenosa (10 ml / kg / h) a través de una bomba de infusión de jeringa impulsada precisa. Proporcionar enriquecimiento jaula tal como material de anidación y un bloque de madera. </li></ol> 6. Cuidados Intensivos <ol><li> A las 6 h después de la operación, por vía subcutánea inyectar medicamen dolorn y antibióticos (0,3 ml buprenorfina (0,15 mg / kg) y 0,2 ml imipenem (16.67mg / kg)). NOTA: Siguiendo la práctica estándar de medicina de animales de laboratorio, la primera dosis de medicamentos para el dolor se administra antes de la incisión quirúrgica inicial y luego según las indicaciones de las políticas veterinarias de la institución. Las inyecciones subcutáneas se deben inyectar cuidadosamente en el espacio subcutáneo. </li><li> Después de 20 - 24 h de la reanimación con líquidos, reemplazar los cristaloides / coloides de nutrición parenteral total (6,67 ml / kg / h). NOTA: la nutrición parenteral total administrada (5,8 kcal / 24 h) cubre alrededor de 40% de las necesidades calóricas diarias de ratones, similar a la ingesta calórica precoz de los pacientes en la unidad de cuidados intensivos. </li><li> Por vía subcutánea administrar medicación para el dolor y antibióticos (0,6 ml buprenorfina (0,3 mg / kg) y 0,2 ml imipenem (16,67 mg / kg) cada 12 h durante todo el período de enfermedad crítica. </li><li> Compruebe los animales al menos cada 3 h durante el día. Evaluar sufrimiento dando un dolorpuntuación basada en la escala de ratón mueca validado 11. Intensificar la vigilancia de los animales con una alta puntuación de dolor. </li></ol> 7. final del experimento NOTA: La aprobación de las recomendaciones sobre el nivel de gravedad del modelo y las directrices y políticas para puntos finales humanos deben buscarse desde la ética local de la Directiva de Revisión Institucional para la Investigación Animal. NOTA: En caso de una línea venosa no funcional tal como el catéter bloqueado, deslocalización del catéter, problemas con la bomba de jeringa, el animal se excluyeron del estudio y se sacrificaron. <ol><li> Al final del período experimental, profundamente anestesiar el ratón utilizando una mezcla de 0,03 ml de ketamina (100 mg / kg) y 0,02 ml (13 mg / kg) xilazina. La eutanasia el ratón mediante la retirada de sangre por punción cardiaca. Tienda complemento muestras de tejido congelado de interés a -80 ° C. </li></ol>

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	<li>Angus, D. C., van der Poll, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+sepsis+and+septic+shock.">Severe sepsis and septic shock.</a> N Engl J Med. 369 (9), 840-851 (2013).</li><li>Singer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Third+International+Consensus+Definitions+for+Sepsis+and+Septic+Shock+(Sepsis-3).">The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3).</a> JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).</li><li>Remick, D. G., Newcomb, D. E., Bolgos, G. L., Call, D. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cecal+ligation+and+puncture+with+total+parenteral+nutrition:+a+clinically+relevant+model+of+the+metabolic,+hormonal,+and+inflammatory+dysfunction+associated+with+critical+illness.">Cecal ligation and puncture with total parenteral nutrition: a clinically relevant model of the metabolic, hormonal, and inflammatory dysfunction associated with critical illness.</a> J Surg Res. 121 (2), 178-186 (2004).</li><li>Conti, M., Merlani, P., Ricou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognosis+and+quality+of+life+of+elderly+patients+after+intensive+care.">Prognosis and quality of life of elderly patients after intensive care.</a> Swiss Med Wkly. 142, (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hemos desarrollado un modelo de ratón clínicamente más relevante de la enfermedad crítica, combinando el método de ligación y punción cecal para inducir sepsis con el uso de una línea venosa central para fluidos, medicamentos y administración de nutrientes. Este montaje experimental es reproducible, permite estudiar la fase prolongada de la enfermedad crítica y da como resultado una tasa de mortalidad estable, por este medio que imita la situación clínica humana 1. <p class="jove_...

enfermedad crítica es un estado de enfermedad en el que la función de uno o más sistemas de órganos se ve obstaculizada en la medida en que el paciente morirá, a menos que se administra apoyo médico intensivo. Mientras que la causa inicial de ingreso en la unidad de cuidados intensivos (UCI) puede variar, desde el trauma, cirugía complicada, quemaduras, exacerbaciones de la enfermedad a la sepsis, todos los pacientes críticamente enfermos sufren de daño celular causado por la hipoperfusión, la hipoxia y la inflamación excesiva entre otros , que conduce a la insuficiencia de órganos. La mayoría de los pacientes sobreviven a su lesión aguda, pero una fracción importante de los pacientes no se recuperan inmediatamente y necesitan cuidados intensivos prolongados. Ellos están en alto riesgo de muerte debido a la no resolución de un fallo multiorgánico. Además, la fase prolongada de la enfermedad crítica hallmarked por la debilidad profunda muscular y endocrino y cambio metabólico, de la que la patogénesis está comprendido de forma incompleta. varios rOdent modelos están siendo utilizados en el marco de la investigación de cuidados críticos. Los dos modelos más utilizados son la administración exógena de lipopolisacárido (LPS) y la ligadura cecal y punción (CLP). Ambos modelos se desarrollan para imitar la fase aguda de la sepsis, definida como una disfunción de órganos potencialmente mortal causada por una respuesta del huésped a la infección desregulada, y una de las principales razones para la admisión en la UCI en todo el mundo 1, 2. El modelo de LPS tiene varias desventajas, ya que sólo transitoriamente afecta a la liberación de citoquinas y el estado hemodinámico del animal 3. A diferencia de los seres humanos, roedores también son particularmente resistentes a la endotoxina y el uso de altas dosis &#39;&#39; de la endotoxina es necesaria para producir la hipotensión y la mortalidad, por la presente elevando aún más preocupaciones de la validez de este método 4, 5. El otro modelo, la ligadura cecal y el modelo de punción (CLP)características de una ligadura de una porción del ciego seguido de una punción con aguja a través de-y-a través. Este procedimiento causa una infección polimicrobiana abdominal con daño tisular, seguido de una translocación de las bacterias en el compartimento de sangre. Esto dará lugar a una respuesta inflamatoria sistémica y el desarrollo de sepsis. El modelo CLP ha sido ampliamente reconocido como un modelo animal de la enfermedad aguda crítica que reproduce las características principales de sepsis: hiperinflamación, vasodilatación, hipotensión y aumento del gasto cardíaco 6, 7. Sin embargo, este modelo no permite el estudio de la insuficiencia no resolver múltiples órganos, pérdida de masa muscular, y endocrinas y metabólicas, que son típicas de la fase prolongada de la enfermedad crítica. Por otra parte, recientemente la validez de los modelos de ratón de la enfermedad crítica ha sido cuestionada, ya que los resultados de los modelos de ratón no siempre pueden ser traducidos a establecer el humano 8, 9, 10. Una posible explicación podría ser que la atención de apoyo que se proporciona a los pacientes críticamente enfermos humanos difiere sustancialmente de la atención que se proporciona a los ratones en estado crítico. Por lo tanto, se asemejan a la configuración humana más de cerca y para permitir la investigación de la fase prolongada de la enfermedad crítica, hemos desarrollado un modelo de ratón que imita la de cuidados intensivos aguda como se da a los seres humanos, tales como extensa administración de líquidos por vía intravenosa y el tratamiento con antibióticos, y que permite para administrar tratamiento de soporte con el fin de sobrevivir a la fase prolongada de la enfermedad crítica, como el soporte nutricional. Para este propósito, se adaptó el modelo de ratón de sepsis CLP-inducida, siendo el estándar de oro para la sepsis, y colocamos una línea venosa central, que permite la administración de fluidos, la nutrición y las drogas.

<table><tbody><tr><td>Buprenorphine</td><td>Ecuphar</td><td></td><td>Vetergesic 0.3 mg/mL</td></tr><tr><td>C57BL/6&amp;nbsp;</td><td>Janvier labs</td><td>C57BL/6JRj</td><td></td></tr><tr><td>colloids</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td>Volulyte 6%</td></tr><tr><td>crystalloids</td><td>Baxter</td><td></td><td>Plasmalyte a viaflo</td></tr><tr><td>Ethilon 3.0</td><td>Ethicon</td><td>F3211</td><td></td></tr><tr><td>Imipenem</td><td>MSD</td><td></td><td>Tienam 500&amp;nbsp;mg powder for injection fluid</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Eurovet</td><td></td><td>Iso-vet</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Eurovet</td><td></td><td>Nimatek 100 mg/mL</td></tr><tr><td>LocTite Super glue3 all plastics&amp;nbsp;</td><td>Rectavit</td><td>119818</td><td></td></tr><tr><td>Mersilk 3.0</td><td>Ethicon</td><td>L192</td><td></td></tr><tr><td>Mersilk 5.0</td><td>Ethicon</td><td>F682</td><td></td></tr><tr><td>Microrenathane .025&quot; O.D. x .012&quot; I.D.</td><td>Bioseb</td><td>MRE-025</td><td></td></tr><tr><td>olimel N7E</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE10 - Polyethylene .011&quot; x .024&quot;&amp;nbsp;</td><td>Instech Solomon</td><td>BTPE-10</td><td></td></tr><tr><td>PE-50 tubing .023&quot; x.038&quot;</td><td>Instech Solomon</td><td>BTPE-50</td><td></td></tr><tr><td>Rodent Swivel 20 G</td><td>Bioseb</td><td>RS-20G&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ropivaca&amp;iuml;ne</td><td>Astrazenica</td><td></td><td>Naropin 2&amp;nbsp;mg/mL</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>VMD</td><td></td><td>Xylazine hydrochloride 2%</td></tr></tbody></table>

use of a central venous line for fluids, drugs and nutrient administration in a mouse model of critical illness

Este protocolo describe un modelo de ratón cateterizado centralmente de enfermedad crítica prolongada. Combinamos la ligadura cecal y punción método para inducir la sepsis con el uso de una línea venosa central para fluidos, medicamentos y administración de nutrientes para imitar el entorno clínico humano. Los pacientes críticos requieren apoyo médico intensivo con el fin de sobrevivir. Mientras que la mayoría de los pacientes se recuperan al cabo de unos días, alrededor de una cuarta parte de los pacientes necesitan cuidados intensivos prolongados y se encuentran en alto riesgo de morir por no resolver un fallo multiorgánico. Además, la fase prolongada de la enfermedad crítica hallmarked por la debilidad profunda del músculo, y los cambios endocrinos y metabólicos, de los cuales la patogénesis está comprendido de forma incompleta. El modelo animal más ampliamente utilizado en la investigación de cuidados críticos es la ligación y punción cecal modelo para inducir la sepsis. Este es un modelo muy reproducible, con cambios inflamatorios y hemodinámicos agudos similares a SEP humanasis, que está diseñado para estudiar la fase aguda de la enfermedad crítica. Sin embargo, este modelo hallmarked por una alta letalidad, que es diferente de la situación clínica humana, y no se ha desarrollado para estudiar la fase prolongada de la enfermedad crítica. Por lo tanto, hemos adaptado la técnica mediante la colocación de un catéter venoso central en la vena yugular que nos permite administrar tratamiento de soporte clínicamente relevante, para imitar mejor la situación clínica humana de la enfermedad crítica. Este modelo de ratón requiere una intervención quirúrgica extensa y cuidados intensivos diaria de los animales, pero el resultado es un modelo relevante de la fase aguda y prolongada de la enfermedad crítica.

ratones C57BL / 6 se hicieron críticamente enfermo como se describe anteriormente. Se realizó dos experimentos para evaluar la supervivencia post-CLP hasta dos puntos de tiempo: la supervivencia hasta el día 5 (n = 15) y la supervivencia hasta el día 7 (n = 22) post-CLP. Las curvas de supervivencia de los dos experimentos no fueron significativamente diferentes (en comparación hasta el día 5), ​​lo que indica la reproducibilidad de la configuración experimental. animales no se...

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Use of a Central Venous Line for Fluids, Drugs and Nutrient Administration in a Mouse Model of Critical Illness

This protocol describes a centrally catheterized mouse model of prolonged critical illness. We combine the cecal ligation and puncture method to induce sepsis with the use of a central venous line for fluids, drugs and nutrient administration to mimic the human clinical setting.

El uso de una línea venosa central para fluidos, Drogas y Administración de nutrientes en un modelo de ratón de la enfermedad crítica

This protocol describes a centrally catheterized mouse model of prolonged critical illness. We combine the cecal ligation and puncture method to induce ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

8.8K vistas.  KU Leuven. This protocol describes a centrally catheterized mouse model of prolonged critical illness. We combine the cecal ligation and puncture method to induce sepsis with the use of a central venous line for fluids, drugs and nutrient administration to mimic the human clinical setting. 

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Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps in Conscious, Unrestrained Mice

Type 2 diabetes is characterized by a defect in insulin action. The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is widely considered the "gold standard" method for assessing insulin action in vivo. During an insulin clamp, hyperinsulinemia is achieved by a constant insulin infusion. Euglycemia is maintained via a concomitant glucose infusion at a variable rate. This variable glucose infusion rate (GIR) is determined by measuring blood glucose at brief intervals throughout the experiment and adjusting the GIR accordingly. The GIR is indicative of whole-body insulin action, as mice with enhanced insulin action require a greater GIR. The insulin clamp can incorporate administration of isotopic 2[14C]deoxyglucose to assess tissue-specific glucose uptake and [3-3H]glucose to assess the ability of insulin to suppress the rate of endogenous glucose appearance (endoRa), a marker of hepatic glucose production, and to stimulate the rate of whole-body glucose disappearance (Rd).
The miniaturization of the insulin clamp for use in genetic mouse models of metabolic disease has led to significant advances in diabetes research. Methods for performing insulin clamps vary between laboratories. It is important to note that the manner in which an insulin clamp is performed can significantly affect the results obtained. We have published a comprehensive assessment of different approaches to performing insulin clamps in conscious mice1 as well as an evaluation of the metabolic response of four commonly used inbred mouse strains using various clamp techniques2. Here we present a protocol for performing insulin clamps on conscious, unrestrained mice developed by the Vanderbilt Mouse Metabolic Phenotyping Center (MMPC; URL: www.mc.vanderbilt.edu/mmpc). This includes a description of the method for implanting catheters used during the insulin clamp. The protocol employed by the Vanderbilt MMPC utilizes a unique two-catheter system3. One catheter is inserted into the jugular vein for infusions. A second catheter is inserted into the carotid artery, which allows for blood sampling without the need to restrain or handle the mouse. This technique provides a significant advantage to the most common method for obtaining blood samples during insulin clamps which is to sample from the severed tip of the tail. Unlike this latter method, sampling from an arterial catheter is not stressful to the mouse1. We also describe methods for using isotopic tracer infusions to assess tissue-specific insulin action. We also provide guidelines for the appropriate presentation of results obtained from insulin clamps.

The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is the gold standard for assessing insulin action in vivo. A method for performing insulin clamps in mice is described. This includes a method for arterial catheterization that permits experiments to be performed in conscious, unrestrained mice with minimal stress.

Hiperinsulinémico euglucémico abrazaderas en ratones conscientes, sin freno

Type 2 diabetes is characterized by a defect in insulin action. The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is widely considered the "gold ...

Investigación

Medicina

Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages of using an IVSA paradigm to study the reinforcing properties of drugs of abuse such as cocaine include the fact that the drug is self-administered instead of experimenter-administered, the schedule of reinforcement can be altered, and accurate measurement of the quantities of drug consumed as well as the timing and pattern of IV injections can be obtained. Furthermore, the intravenous route of administration avoids potential confounds related to first pass metabolism or taste, and produces rapid increases in blood and brain drug levels. As outlined in this video, intravenous self-administration can be obtained without prior food restriction or prior drug training following careful catheter placement during surgery and meticulous daily catheter flushing and maintenance. Experimental procedures outlined in this paper include a description of animal housing and acclimation methods, operant training using sweetened milk solutions, and catheter implantation surgery.

The intravenous self-administration (IVSA) paradigm is considered to be the gold standard in examining the reinforcing properties of drugs of abuse in rodents. This manuscript outlines the experimental procedures and surgical techniques necessary to obtain reliable IVSA data. In particular, meticulous catheter implantation and maintenance are highlighted.

Los métodos para Autoadministración intravenosa en un modelo de ratón

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages ...

Neurociencias

Catheterization of the Carotid Artery and Jugular Vein to Perform Hemodynamic Measures, Infusions and Blood Sampling in a Conscious Rat Model

The success of a small animal model to study critical illness is, in part, dependent on the ability of the model to simulate the human condition. Intra-tracheal inoculation of a known amount of bacteria has been successfully used to reproduce the pathogenesis of pneumonia which then develops into sepsis. Monitoring hemodynamic parameters and providing standard clinical treatment including infusion of antibiotics, fluids and drugs to maintain blood pressure is critical to simulate routine supportive care in this model but to do so requires both arterial and venous vascular access. The video details the surgical technique for implanting carotid artery and common jugular vein catheters in an anesthetized rat. Following a 72 hr recovery period, the animals will be re-anesthetized and connected to a tether and swivel setup attached to the rodent housing which connects the implanted catheters to the hemodynamic monitoring system. This setup allows free movement of the rat during the study while continuously monitoring pressures, infusing fluids and drugs (antibiotics, vasopressors) and performing blood sampling.

Vascular accesses to measure hemodynamics, provide fluids and perform blood sampling are important to any small animal model study. We present a technique for implanting catheters into the carotid artery and the common jugular vein in an anesthetized rat for connecting to a system to perform monitoring, infusions and sampling.

La cateterización de la arteria carótida y la vena yugular para realizar mediciones hemodinámicas, Infusiones y muestras de sangre en un modelo de rata Consciente

The success of a small animal model to study critical illness is, in part, dependent on the ability of the model to simulate the human condition. ...

Monitoring of Systemic and Hepatic Hemodynamic Parameters in Mice

The use of mouse models in experimental research is of enormous importance for the study of hepatic physiology and pathophysiological disturbances. However, due to the small size of the mouse, technical details of the intraoperative monitoring procedure suitable for the mouse were rarely described. Previously we have reported a monitoring procedure to obtain hemodynamic parameters for rats. Now, we adapted the procedure to acquire systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice, a species ten-fold smaller than rats. This film demonstrates the instrumentation of the animals as well as the data acquisition process needed to assess systemic and hepatic hemodynamics in mice. Vital parameters, including body temperature, respiratory&#160;rate&#160;and heart&#160;rate were recorded throughout the whole procedure. Systemic hemodynamic parameters consist of carotid artery pressure (CAP) and central venous pressure (CVP). Hepatic perfusion parameters include portal vein pressure (PVP), portal flow rate as well as the flow rate of the common hepatic artery (table 1). Instrumentation and data acquisition to record the normal values was completed within 1.5 h. Systemic and hepatic hemodynamic parameters remained within normal ranges during this procedure.
This procedure is challenging but feasible. We have already applied this procedure to assess hepatic hemodynamics in normal mice as well as during 70% partial hepatectomy and in liver lobe clamping experiments. Mean PVP after resection (n= 20), was 11.41&#177;2.94 cmH2O which was significantly higher (P&#60;0.05) than before resection (6.87&#177;2.39 cmH2O). The results of liver lobe clamping experiment indicated that this monitoring procedure is sensitive and suitable for detecting small changes in portal pressure and portal flow rate. In conclusion, this procedure is reliable in the hands of an experienced micro-surgeon but should be limited to experiments where mice are absolutely needed.

This film demonstrates how to acquire systemic and hepatic hemodynamics in mice. The whole monitoring includes acquisition of vital parameters, systemic blood pressure, central venous pressure, common hepatic artery flow rate, and portal vein pressure as well as the portal flow rate in mice.

Monitoreo de Parámetros sistémicos y hemodinámicos hepática en ratones

The use of mouse models in experimental research is of enormous importance for the study of hepatic physiology and pathophysiological disturbances. ...

Ensayo de trombosis venosa optimizado en un modelo de cáncer de ratón mediante clips vasculares

Venous Thrombosis Assay in a Mouse Model of Cancer

This methodology paper highlights the surgical nuances of a rodent model of venous thrombosis, specifically in the context of cancer-associated thrombosis (CAT). Deep venous thrombosis is a common complication in cancer survivors and can be potentially fatal. The current murine venous thrombosis models typically involve a complete or partial mechanical occlusion of the inferior vena cava (IVC) using a suture. This procedure induces a total or partial stasis of blood and endothelial damage, triggering thrombogenesis. The current models have limitations such as higher variability in clot weights, significant mortality rate, and prolonged learning curve. This report introduces surgical refinements using vascular clips to address some of these limitations. Using a syngeneic colon cancer xenograft mouse model, we employed customized vascular clips to ligate the infrarenal vena cava. These clips allow residual lip space similar to a 5-0 polypropylene suture after IVC ligations. Mice with the suture method served as controls. The vascular clip method resulted in a consistent reproducible partial vascular occlusion and greater clot weights with less variability than the suture method. The larger clot weights, greater clot mass, and clot to the IVC luminal surface area were expected due to the higher pressure profile of the vascular clips compared to a 6-0 polypropylene suture. The approach was validated by gray scale ultrasonography, which revealed consistently greater clot mass in the infrarenal vena cava with vascular clips compared to the suture method. These observations were further substantiated with the immunofluorescence staining. This study offers an improved method to generate a venous thrombosis model in mice, which can be employed to deepen the mechanistic understanding of CAT and in translational research such as drug discovery.

Autor destacado: Avance en la investigación de la trombosis asociada al cáncer en modelos de roedores 

This article aims to present an optimized method for assessing venous thrombosis in a mouse cancer model, using vascular clips to achieve venous ligation. Optimization minimizes variability in thrombosis-related measurements and enhances relevance to human cancer-associated venous thrombosis.

Ensayo de trombosis venosa en un modelo de cáncer en ratones

This methodology paper highlights the surgical nuances of a rodent model of venous thrombosis, specifically in the context of cancer-associated thrombosis ...

Investigación sobre el cáncer

Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis

Deep vein thrombosis (DVT) and its devastating complication, pulmonary embolism, are a severe health problem with high mortality. Mechanisms of thrombus formation in veins remain obscure. Lack of mobility (e.g., after surgery or long-haul flights) is one of the main factors leading to DVT. The pathophysiological consequence of the lack of mobility is blood flow stagnation in venous valves. Here, a model is described that mimics such flow disturbance as a thrombosis-driving factor. In this model, partial flow restriction (stenosis) in the inferior vena cava (IVC) is created. Closure of about 90% of the IVC lumen for 48 h results in development of thrombi structurally similar to those in humans. The similarities are: i) most of the thrombus volume is red, i.e., consists of red blood cells and fibrin, ii) presence of a white part (lines of Zahn), iii) non-denuded endothelial monolayer, iv) elevated plasma D-Dimer levels, and v) possibility to prevent thrombosis by low molecular weight heparin. Limitations include variable size of thrombi and the fact that a certain percentage of wild-type mice (0 - 35%) may not produce a thrombus. In addition to visual observation and measurement, thrombi may be visualized by non-invasive technologies, such as ultrasonography, which allows for monitoring the dynamics of thrombus development. At shorter time points (1 - 6 h), intravital microscopy may be applied to directly observe events (e.g., recruitment of cells to the vessel wall) preceding thrombus formation. Use of this method by several teams around the world has made it possible to uncover basic mechanisms of DVT initiation and identify potential targets that might be beneficial for its prevention.

We describe here stenosis in the inferior vena cava as a murine model of deep vein thrombosis. This model recapitulates blood flow restriction, one of the major triggers of venous thrombosis in humans.

Estenosis de la Vena Cava Inferior: un modelo murino de trombosis venosa profunda

Deep vein thrombosis (DVT) and its devastating complication, pulmonary embolism, are a severe health problem with high mortality. Mechanisms of thrombus ...

Inmunología e Infección

Veno-Venous Extracorporeal Membrane Oxygenation in a Mouse

The use of extracorporeal membrane oxygenation (ECMO) has increased substantially in recent years. ECMO has become a reliable and effective therapy for acute as well as end-stage lung diseases. With the increase in clinical demand and prolonged use of ECMO, procedural optimization and prevention of multi-organ damage are of critical importance. The aim of this protocol is to present a detailed technique of veno-venous ECMO in a non-intubated, spontaneously breathing mouse. This protocol demonstrates the technical design of the ECMO and surgical steps. This murine ECMO model will facilitate the study of pathophysiology related to ECMO (e.g., inflammation,bleeding and thromboembolic events). Due to the abundance of genetically modified mice, the molecular mechanisms involved in ECMO-related complications can also be dissected.

Here we present a protocol describing the technique of veno-venous extracorporeal membrane oxygenation (ECMO) in a non-intubated, spontaneously breathing mouse. This murine model of ECMO can be effectively implemented in experimental studies of acute and end-stage lung diseases.

Oxigenación por membrana extracorpórea veno-venosa en un ratón

The use of extracorporeal membrane oxygenation (ECMO) has increased substantially in recent years. ECMO has become a reliable and effective therapy for ...

Murine Model of Central Venous Stenosis using Aortocaval Fistula with an Outflow Stenosis

Central venous stenosis is an important entity contributing to arteriovenous fistula (AVF) failure. A murine AVF model was modified to create a partial ligation of the inferior vena cava (IVC) in the outflow of the fistula, mimicking central venous stenosis. Technical aspects of this model are introduced. The aorta and IVC are exposed, following an abdominal incision. The infra-renal aorta and IVC are dissected for proximal clamping, and the distal aorta is exposed for puncture. The IVC at the midpoint between the left renal vein and the aortic bifurcation is carefully dissected to place an 8-0 suture beneath the IVC. After clamping the aorta and IVC, an AVF is created by puncturing the infra-renal aorta through both walls into the IVC with a 25 G needle, followed by ligating a 22 G intra-venous (IV) catheter and IVC together. The catheter is then removed, creating a reproducible venous stenosis without occlusion. The aorta and IVC are unclamped after confirming primary hemostasis. This novel model of central vein stenosis is easy to perform, reproducible, and will facilitate studies on AVF failure.

An aortocaval fistula was created by puncturing the murine infra-renal aorta through both walls into the inferior vena cava and was followed by creation of a stenosis in its outflow via partial ligation of the inferior vena cava. This reproducible model can be used to study central venous stenosis.

Modelo murino de estenosis venosa central usando fístula aortocaval con una estenosis de salida

Central venous stenosis is an important entity contributing to arteriovenous fistula (AVF) failure. A murine AVF model was modified to create a partial ...

El uso de una línea venosa central para fluidos, Drogas y Administración de nutrientes en un modelo de ratón de la enfermedad crítica

Resumen

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Hiperinsulinémico euglucémico abrazaderas en ratones conscientes, sin freno

Los métodos para Autoadministración intravenosa en un modelo de ratón

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Monitoreo de Parámetros sistémicos y hemodinámicos hepática en ratones

Ensayo de trombosis venosa en un modelo de cáncer en ratones

Ensayo de trombosis venosa en un modelo de cáncer en ratones

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Estenosis de la Vena Cava Inferior: un modelo murino de trombosis venosa profunda

Oxigenación por membrana extracorpórea veno-venosa en un ratón

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