Wir danken Drs. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria und Frau Ximena Optiz-Araya für die erste Unterstützung bei der Protokollierung und zur Bereitstellung von Plasmiden. Diese Arbeit wurde von NIH / NIDCD Grant DC013841 (JTS) unterstützt.

Alle Verfahren wurden von Northwestern University Institutional Animal Care und Use Committees genehmigt und durchgeführt in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guidelines für die Pflege und Verwendung von Labortieren. 1. Eierbearbeitung <ol><li> Kaufen Sie befruchtete Eier von einem örtlichen Verkäufer. Eier bei 13 ° C im Kühlschrank für höchstens 5 Tage vor der Inkubation aufbewahren. Die Embryo-Lebensfähigkeit verringert sich nach 1 Woche deutlich. </li><li> Tupfe jedes Ei mit 70% Ethanol vor dem Einstellen in den Inkubator. </li><li> Setzen Sie 1-2 Dutzend Eier an ihren Seiten in einem Inkubator mit der Temperatur auf 38 ° C bei ~ 50% Feuchtigkeit eingestellt. Dies gewährleistet eine korrekte Embryo-Positionierung für die Elektroporation und eine optimale Lebensfähigkeit. HINWEIS: Nach 48-52 h Inkubation werden die Eier bei Hamburger-Hamilton (HH) Bühne ~ 12-13 und bereit für Elektroporation. </li></ol> 2. Vorbereitung <ol><li> Plasmid MiXing <ol><li> Füge 1 μl 0,1% Fast Green (0,1% in 18 MΩ deionisiertem und destilliertem H 2 O [ddH 2 O]) für jede 7 μl DNA Mischung hinzu. </li><li> Zur Co-Elektroporation von mehreren Plasmiden, vermischen Sie Plasmide im Verhältnis 1: 1. Die endgültige DNA-Konzentration sollte 5-8 μg / μL betragen. </li></ol></li><li> Einfüllpipette füllen <ol><li> Pipetten auf einen Mikropipettenabzieher ziehen. Füllen Sie die Pipette mit 1-2 μl Plasmiden mit einer 28G Spritzenadel. </li><li> Pipettenspitze mit Pinzette auf 10 - 20 μm pipettieren. Verwenden Sie ein Mikroskop, um bei der Bestimmung der Größe der gebrochenen Pipettenspitze zu helfen. Bringen Sie die Pipette an den Pipettenhalter des Picospritzers an. </li></ol></li></ol> 3. Fenster HINWEIS: Das Fensterverfahren wurde vor 13 veröffentlicht. Bitte beachten Sie bitte die Referenz 13 für weitere visuelle Informationen. <ol><li> Wischen Sie alle Instrumente und den Arbeitsbereich mit 70%Ethanol. </li><li> Nehmen Sie die gewünschte Anzahl von Eier aus dem Inkubator (zwischen 6-10), lassen Sie bei Raumtemperatur ab und tauschen Sie Eier mit 70% Ethanol wieder ab. Eier bleiben für mindestens 2 Stunden nach der Inkubatorentfernung lebensfähig. </li><li> Legen Sie das Ei auf eine Licht-Illuminator, um die Embryo-Positionierung zu identifizieren. Umkreisen Sie die Mitte des dunklen Bereichs ( dh Embryo) mit einem Bleistift. </li><li> Mit einer 19G-Nadel, stoße ein Loch in das stumpfe Ende des Eies. </li><li> Stoßen Sie ein anderes Loch in der Nähe des gezogenen Kreises auf die spitze Seite des Eies. Entfernen Sie ein kleines Stück der äußeren Eierschale (ca. 16 mm 2 ) mit der 19G-Nadel und entfernen Sie dann ein kleines Stück der inneren Eierschale (ca. 8 mm 2 ) mit einer Pinzette. </li><li> Mit einer 3-ml-Spritze, die mit einer 19G-Nadel ausgestattet ist, entziehen Sie 1,5-2,5 ml Albumin aus dem Ei durch das Stumpfloch. Achten Sie darauf, die Nadel bei 45 ° nach unten zu schlagen. </li><li> Decken Sie das stumpfe Ende mit einem kleinen Stück Klebeband (1 cm x 1 cm) ab. Bedecken den gezeichneten Kreis undD das zweite Loch mit Klebeband (2,5 cm x 4 cm). </li><li> Mit geschwungener Schere (Schneide = 2,5 cm) schneide ein Fenster im Kreis. Schere sollte parallel zur Eierschale sein und der Durchmesser des Fensters sollte weniger als 2 cm betragen. </li></ol> 4. Plasmid-Injektion <ol><li> Schalte den Pikospritzer ein. Stellen Sie den Druck auf 18 psi und die Dauer auf 5 μs. Schalten Sie den Luftbehälter und die Lampe für das Sektionsmikroskop ein. </li><li> Mischen Sie 30 mL Stammlösung einer 1: 10-Verdünnung der gekauften indischen Tinte, die in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gemischt wurde. Bei 4 ° C aufbewahren. Die Injektion der indischen Tinte ist ein wichtiger Schritt, um eine bessere Visualisierung des Hühnerembryos zu erhalten. <ol><li> Füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit der verdünnten indischen Tintenlösung. Bringen Sie eine 27G-Nadel an und vertreiben Sie alle Blasen, die in der Spritze vorhanden sind. </li><li> Setzen Sie die Nadel gerade unter die Eigelb Membran ~ 2 - 3 mm aus dem Embryo und injizieren ~ 0,2 ml indischen Tinte sanft unter dem Embryo. MachenNicht mehr als 0,5 ml der indischen Tinte injizieren, da es das Überleben des Embryos verringern kann. </li></ol></li><li> Legen Sie das Fenster-Ei auf einen Eierhalter unter dem Sektionsmikroskop. Verwenden Sie die höchste Vergrößerung für die beste Visualisierung der Plasmid-Injektionsstelle. </li><li> Mit der Pinzette die Membran über den Injektionsbereich entfernen. Von den Rhombomeren 5 und 6 (R5 / R6) entstehen akustische Hirnstammregionen von Interesse ( dh NM und NL). R5 / R6 befinden sich neben den Otozysten (eine embryonale Struktur bei Wirbeltieren, die sich in das Innenohr entwickeln), die als Orientierungspunkte für R5 / R6-Plasmidinjektionen dienen. </li><li> Senken Sie die DNA-gefüllte Pipette in das Neuralrohr, das über dem R5 / R6-Bereich liegt, und zwischen den Otocysten unter Verwendung des Mikromanipulators. Ein Schema der idealen Platzierung ist in Fig. 1A gezeigt . </li><li> Tragen Sie Luftdruck (18 psi, 5 μs Dauer) von der Picospritzer, um DNA in der Neuralröhre auszustoßen. </li></ol> 5. Elektroporation <ol><li> Einschalten tEr Strom / Spannung Stimulator. </li><li> Füllen Sie eine 3-ml-Spritze mit PBS und befestigen Sie den Spritzenfilter. Füge 1-2 Tropfen PBS auf den Embryo hinzu. </li><li> Senken Sie die bipolare Elektrode zum Embryo unter Verwendung des Mikromanipulators mit der negativen Elektrode oberhalb der Injektionsstelle (medial) und der positiven Elektrode lateral zum R5 / R6 (Abbildung 1A ). Vermeiden Sie direkten Kontakt mit dem Embryo. Verwenden Sie bipolare Elektroden, bei denen das Elektrodenmaterial Platin-Iridium ist. Den Abstand zwischen den Spitzen auf 0,5 mm mit Pinzette einstellen. </li><li> Mit einem Strom- / Spannungsstimulator, Puls 20 mal bei 50 V für 1 ms in 1 s Intervallen. </li><li> Nach der Elektroporation fügen Sie einen Tropfen PBS über den exponierten Bereich hinzu. Entfernen Sie die Elektrode vorsichtig und reinigen Sie sie mit einem Laborgewebe und 70% Ethanol. Schließen Sie das Fenster, das den Embryo mit Klebeband aussetzt. </li><li> Etikett Eierschale mit dem injizierten Plasmid-Typ und die Luke Datum. </li><li> Lege die Eier wieder in den Inkubator mit der Fensterseite nach oben. Inkubieren bei 38 ° C mit 50% Luftfeuchtigkeit bis zur gewünschten Entwicklungsstufe erreicht. </li><li> Wenn ein Tet-on-Vektor für die zeitliche Kontrolle der Genexpression elektroporiert wird, müssen alle 24 h Doxycyclin (Dox) angewendet werden, um die Genexpression zu induzieren (siehe Abschnitt 6). </li></ol> 6. Tet-on-System zur zeitlichen Kontrolle der Genexpression <ol><li> Verwenden Sie die folgenden Plasmide: PCAGGS-T2TP: eine Transposase, die Plasmid exprimiert. PT2K-CAGGS-rtTA-M2: ein Plasmid, das das Dox-bindende Protein stabil exprimiert. PT2K-BI-TRE-EGFP: ein Plasmid, das einen bidirektionalen Tet-on-Promotor (TRE) -abhängige Expression des EGFP-Reporters und ein zweites Gen von Interesse enthält. HINWEIS: Die obigen drei Plasmide müssen im Verhältnis 1: 1: 1 co-elektroporiert werden. </li><li> Lagerlösungsvorbereitung: <ol><li> Dox in sterilem PBS auflösen, um eine 1 mg / ml Stammlösung zu erzeugen. Bei -20 ° C aufbewahren. </li></ol></li><li> Dox Anwendung: <ol><li> Um das expressio zu induzierenN des Gens von Interesse während bestimmter Entwicklungsstadien, gelten Dox alle 24 Stunden. </li><li> Bei der Anwendung von Dox nehmen Sie das Ei heraus, öffnen Sie das Fenster, pipettieren Sie 50 μL Dox auf die chorioallointoische Membran, schließen Sie das Fenster und legen Sie das Ei wieder in den Inkubator. </li></ol></li></ol> 7. Vorbereitung der Dissektionsfläche für Hirnstammscheiben HINWEIS: Die folgenden Abschnitte (7 - 9) und Verfahren wurden vor 14 veröffentlicht. Bitte beachten Sie diese Hinweise für weitere visuelle Informationen. <ol><li> Eine Agarlösung (40 mg / ml Agarose, dh 4% in ddH 2 O) zubereiten. Agar-Lösung in eine Petrischale geben und bei Raumtemperatur erstarren lassen. Lagern Sie die gedeckte Agarplatte im Kühlschrank für die zukünftige Verwendung während des Hirnstammes, der das Gewebe schneidet. </li><li> Kontinuierliche Blase künstliche zerebrale Spinalflüssigkeit (ACSF) mit 95% O 2 und 5% CO 2 (pH 7,2-7,4 und Osmolarität: 295-310 mOsm / L).</li><li> Den Arbeitsbereich und Vibratom mit 70% EtOH reinigen und die Klinge mit destilliertem Wasser spülen. </li><li> Legen Sie einen sauberen Flüssigkeitsabsorptionskissen auf den Arbeitsbereich mit geeigneten Sektionswerkzeugen. </li><li> Nehmen Sie die Agarplatte aus dem Kühlschrank, schneiden Sie einen kleinen Agarwürfel (10 mm x 10 mm x 8 mm). Kleben Sie den Agarblock auf die Stufe einer Vibrationsschneidkammer mit handelsüblichem Sekundenkleber. </li></ol> 8. Isolierung des Hühnchen-akustischen Hirnstamms <ol><li> Öffnen Sie das Ei an der Taped-Fenster-Seite. Punktion der Membran Sac mit einem Skalpell und entfernen Sie den Kopf des Hühnerembryos. </li><li> Enthaupte das Huhn mit scharfer Schere. </li><li> Legen Sie die Rasierklingenspitze etwas nach hinten in die Augen. Schneide durch den Schädel an der rostral-to-caudalen Mittellinie. Tragen Sie leichten Druck je nach Alter des Embryos. Ältere Embryonen erfordern mehr Druck. </li><li> Schieben Sie die Haut und die Federn vorsichtig ab, um Schädel auszusetzen und den Mittellinienschnitt zu überprüfen. </li><li> Anwenden sDrehen Sie den rostralen Teil des Schädels mit einer Rasierklinge. Setzen Sie die Klinge sofort nach hinten und schneiden Sie durch den ganzen Schädel und das Gehirngewebe. </li><li> Machen Sie Mittellinie-zu-laterale Schnitte mit einer Schere im Schädel &quot;sududalen Bereich, etwas anterior bis Nackenmuskeln auf beiden Seiten des Kopfes. Expose Gehirn und Kleinhirn durch Ziehen weg Schädel und überschüssiges Gewebe. </li><li> Schneide Gewebe an den Hirnstamm mit Schere befestigt und entfernen Sie die Hirnstamm, die frei löst sich vom Schädel. </li></ol> 9. Vorbereitung von Hirnstammscheiben für In-vivo- Elektrophysiologie oder Imaging <ol><li> Pin Hirnstamm durch die Optik tecta. </li><li> Entfernen Sie das Kleinhirn, indem Sie Stöcke mit einer Schere schneiden und den Boden des vierten Ventrikels aussetzen. </li><li> Mit Pinzetten, entfernen Sie alle membranösen Gewebe und Blutgefäße aus der Hirnstamm Oberfläche. </li><li> Um den Hirnstamm zu blockieren, machen Sie einen horizontalen Schnitt am östlichsten Ende des Bodens der vierTh ventrikel, nur kaudal der kortex Setzen Sie seitliche Schnitte senkrecht durch die Optik tecta, um den Hirnstamm zu isolieren. </li><li> Legen Sie eine kleine Menge von Leim auf die Vibrationsstufe direkt vor dem Agarblock. </li><li> Heben Sie den Hirnstamm am Rückenmark mit Pinzette an und legen Sie ihn auf den Superleim mit rostraler Seite nach unten und dorsaler Seite zur Vibrationsklinge. Entfernen Sie überschüssigen Kleber mit einem Laborgewebe oder Filterpapier. </li><li> Gießen Sie sauerstoffhaltiges ACSF in die Vibrationsstufe. Setzen Sie die Vibrationsklinge auf einen Winkel von 20-22 °. Start Vibratom bei maximaler Amplitude Oszillation. Bewege die Bühne in Richtung der Klinge, so dass die Oberseite des Gewebes parallel zur Klinge ist. </li><li> Die Klinge schnell in Richtung Hirnstammgewebe bewegen. Verlangsamen Sie die Klinge erheblich vor dem Kontakt der Klinge mit dem Gewebe. </li><li> Scheibengewebe mit der langsamsten Vorwärtsgeschwindigkeit. Sobald die Klinge durch den gesamten koronalen Gewebeabschnitt ist, entfernen Sie die Scheibe vorsichtig mit einer Transferpipette/ Li&gt; <li> Die Stufe 200-300 μm absenken und wieder schneiden. Wiederholen, bis anatomische Landmarken von Hörkernen sichtbar werden, zB die deutliche dorsale / ventrale Neuropilregion NL und die mediale Lage von NM im Vergleich zu NL. </li><li> Sorgfältige Aufbewahrung von Scheiben in ACFS. Dies kann bei Raumtemperatur (22 ° C) oder in der Nähe von physiologischen Bedingungen (~ 41 ° C) mit einem warmen Wasserbad erfolgen. Beachten Sie die Reihenfolge des Schneidens. Die erste Scheibe entspricht der kaudalsten Gewebsfläche und die letzte Scheibe entspricht der rostralen Region. Dies stellt grob die tonotopische Organisation des auditorischen Hirnstamms dar, von Nieder- bis Hochfrequenz-Kodierungsregionen. </li></ol>

<ol><li>Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20664077">Mechanisms of sound localization in mammals.</a> Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).</li>
<li>Anderson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+timing+is+linked+to+speech+perception+in+noise%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural timing is linked to speech perception in noise.</a> J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).</li>
<li>Shannon, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speech+recognition+with+primarily+temporal+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Speech recognition with primarily temporal cues.</a> Science. 270 (5234), 303-304 (1995).</li>
<li>Carr, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+development+of+time+coding+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Evolution and development of time coding systems.</a> Curr Opin Neurobiol. 11 (6), 727-733 (2001).</li>
<li>Carr, C. E., Soares, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+convergence+and+shared+computational+principles+in+the+auditory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Evol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary convergence and shared computational principles in the auditory system.</a> Brain Behav Evol. 59 (5-6), 294-311 (2002).</li>
<li>Rubel, E. W., Parks, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken%3A+tonotopic+organization+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> J Comp Neurol. 164 (4), 411-433 (1975).</li>
<li>Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken%3A+ontogeny+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> J Comp Neurol. 166 (4), 469-489 (1976).</li>
<li>Schecterson, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrkB+downregulation+is+required+for+dendrite+retraction+in+developing+neurons+of+chicken+nucleus+magnocellularis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis.</a> J Neurosci. 32 (40), 14000-14009 (2012).</li>
<li>Chesnutt, C., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid-based+short-hairpin+RNA+interference+in+the+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo.</a> Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).</li>
<li>Oertel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+of+timing+in+the+brain+stem+auditory+nuclei+of+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Encoding of timing in the brain stem auditory nuclei of vertebrates.</a> Neuron. 19 (5), 959-962 (1997).</li>
<li>Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origins+of+auditory+brain-stem+nuclei+in+the+chick+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain.</a> Dev Biol. 224 (2), 138-151 (2000).</li>
<li>Cramer, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphA4+signaling+promotes+axon+segregation+in+the+developing+auditory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system.</a> Dev Biol. 269 (1), 26-35 (2004).</li>
<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J Vis Exp. (8), e306(2007).</li>
<li>Sanchez, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+culture+of+chicken+auditory+brainstem+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Jhaveri, S., Morest, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+architecture+in+nucleus+magnocellularis+of+the+chicken+auditory+system+with+observations+on+nucleus+laminaris%3A+a+light+and+electron+microscope+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the chicken auditory system with observations on nucleus laminaris: a light and electron microscope study.</a> Neuroscience. 7 (4), 809-836 (1982).</li>
<li>Matsui, R., Tanabe, Y., Watanabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+adeno-associated+virus+vector+efficiently+transduces+neurons+in+the+embryonic+and+post-embryonic+chicken+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Avian adeno-associated virus vector efficiently transduces neurons in the embryonic and post-embryonic chicken brain.</a> PLoS One. 7 (11), e48730(2012).</li>
<li>Koppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+nerve+terminals+in+the+cochlear+nucleus+magnocellularis%3A+differences+between+low+and+high+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies.</a> J Comp Neurol. 339 (3), 438-446 (1994).</li>
<li>Hyson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analysis+of+interaural+time+differences+in+the+chick+brain+stem%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">The analysis of interaural time differences in the chick brain stem.</a> Physiol Behav. 86 (3), 297-305 (2005).</li>
<li>Jones, T. A., Jones, S. M., Paggett, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+hearing+in+the+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Emergence of hearing in the chicken embryo.</a> J Neurophysiol. 96 (1), 128-141 (2006).</li>
<li>Saunders, J. C., Coles, R. B., Gates, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+auditory+evoked+responses+in+the+cochlea+and+cochlear+nuclei+of+the+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The development of auditory evoked responses in the cochlea and cochlear nuclei of the chick.</a> Brain Res. 63, 59-74 (1973).</li>
<li>Woolf, N. K., Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+auditory+function+in+the+cochlea+of+the+mongolian+gerbil%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">The development of auditory function in the cochlea of the mongolian gerbil.</a> Hear Res. 13 (3), 277-283 (1984).</li>
<li>Walsh, E. J., McGee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+development+of+auditory+nerve+and+cochlear+nucleus+neuronal+responses+in+kittens%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Postnatal development of auditory nerve and cochlear nucleus neuronal responses in kittens.</a> Hear Res. 28 (1), 97-116 (1987).</li>
<li>Uziel, A., Romand, R., Marot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cochlear+potentials+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Audiology%22%5BJournal%5D)">Development of cochlear potentials in rats.</a> Audiology. 20 (2), 89-100 (1981).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In ovo Elektroporation ist eine Methode zur Expression oder Klopfen von Genen von Interesse, um in vivo Gen-Funktion 8 , 9 zu analysieren. Im Hühnerembryo ist es eine innovative Methode zur Expression von Plasmid-codierten Genen in verschiedene akustische Hirnstammregionen 8 . Um einen optimalen Ausdruck zu gewährleisten, sind mehrere kritische Schritte erforderlich. Zuerst nur Embryonen injizieren, deren Otozysten deu...

Eine schnelle neuronale Kodierung von Klängen ist für normale Hörfunktionen unerlässlich. Dazu gehören die Klanglokalisierungsfähigkeiten 1 , die Sprache in der Rauschunterscheidung 2 und das Verständnis anderer verhaltensrelevanter Kommunikationssignale 3 . Analoge Neuronen, die sich im auditorischen Hirnstamm von Vogel und Säugetieren befinden, sind hochspezialisiert für eine schnelle neuronale Kodierung 4 . Dazu gehören der Hühnerkern Magnocellularis (NM), der Nucleus laminaris (NL) und deren Säugetieranaloga, der anteroventrale Cochlearkern (AVCN) und der mediale Superior Olive (MSO) bzw. 5 . Allerdings sind Entwicklungsmechanismen, die eine schnelle neuronale Kodierung regulieren, im auditorischen Hirnstamm schlecht verstanden. Daher ist es vorteilhaft, spezifische Gene zu studieren, die für eine schnelle neuronale Kodierung verantwortlich sind, um ihren Ausdruck, ihre Regulierung und ihre Funktion in au zu verstehenDitory Entwicklung. Der Entwicklung von Hühnerembryo ist ein wirksames und etabliertes Forschungsinstrument, um grundlegende biologische Fragen der auditorischen Systementwicklung zu untersuchen 6 , 7 . Jüngste molekulare Fortschritte haben diese biologischen Fragen in den sich entwickelnden Hühnerembryo durch Ausdrücken oder Klopfen von Genen von Interesse, um in vivo Gen-Funktion 8 , 9 zu analysieren. Die Untersuchung der regulatorischen Rolle von spezifischen Genen ist ein wichtiger Fortschritt beim Verständnis von Pathologien im Zusammenhang mit akustischen Defiziten. Hier präsentieren wir in der Ovo- Elektroporation von Plasmid-codierten Genen in den Hühner-Hirnstamm, wo eine schnelle neuronale Kodierung des Klangs auftritt 10 . Durch die Ausrichtung auf auditorische neuronale Vorläuferregionen, die mit den Rhombomeren 5 und 6, 11 , 12 (R5 /R6) zeigen wir die räumliche Kontrolle der Plasmid-Transfektion in NM und NL. Darüber hinaus zeigen wir eine zeitliche Regulierung des Ausdrucks durch die Annahme eines Tet-on-Vektorsystems. Dies ist ein Arzneimittel-induzierbares Verfahren, das die interessierenden Gene in Gegenwart von Doxycyclin (Dox) 8 exprimiert.

<table><tbody><tr><td>Fertilized white leghorn chicken eggs</td><td>Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Hannifin</td><td>052-0500-900</td><td>Picospritzer III, single or dual channel</td></tr><tr><td>Current/voltage stimulator</td><td>Grass Technologies</td><td>SD9</td><td>SD9</td></tr><tr><td>Microfil syringe needles</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G67-5</td><td>28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)</td></tr><tr><td>Electrode holder</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1280</td><td>MP Series: Non-Electrical Pressure Applications</td></tr><tr><td>Stimulating microelectrode</td><td>FHC</td><td>PBSA1075</td><td>PBSA1075</td></tr><tr><td>Air tank/regulator</td><td>NU Laboratory Services</td><td></td><td>Air dry 300 CF</td></tr><tr><td>Fast green</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7258-25G</td><td>F7258-25G</td></tr><tr><td>Clear plastic tape</td><td>Scotch</td><td>191</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline hyclate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Egg refrigerator</td><td>Vissani Wine Refrigerator</td><td></td><td>13.3 - 16.1 &amp;deg;C (56-61&amp;deg; F)</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Hova-Bator</td><td></td><td>38 &amp;deg; C (100 &amp;deg; F), ~50% humidity</td></tr><tr><td>Dissection scope</td><td>Zeiss</td><td>4.35E+15</td><td>SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X</td></tr><tr><td>Cold-light source</td><td>Zeiss</td><td>4.36E+15</td><td>CL6000 LED</td></tr><tr><td>Micromanipulators</td><td>Narishige Japan</td><td>Model: MM-3</td><td>2 Micromanipulators</td></tr><tr><td>Capillary tubes</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-86-10</td><td>Thick-walled borosilicate (dimensions)</td></tr><tr><td>Syringes</td><td></td><td></td><td>1 mL, 3 mL</td></tr><tr><td>Needles</td><td>BD Precision Glide&amp;nbsp;</td><td></td><td>27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Stoelting</td><td></td><td>No. 5 Super Fine Dumont</td></tr><tr><td>Egg holder</td><td>Custom Made</td><td></td><td>Clay base works as well</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td>Model P-97</td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>Ultra Cruz</td><td>sc-358811</td><td>PVDF 0.22 &amp;mu;m</td></tr></tbody></table>

in ovo electroporation in the chicken auditory brainstem

Elektroporation ist eine Methode, die interessante Gene in biologisch relevante Organismen wie den Hühnerembryo einführt. Es ist lange festzustellen, dass der Hühnerembryo ein wirksames Forschungsmodell für das Studium der grundlegenden biologischen Funktionen der auditorischen Systementwicklung ist. In jüngster Zeit ist der Hühnerembryo besonders wertvoll bei der Untersuchung von Genexpression, Regulation und Funktion, die mit dem Hören verbunden ist. In ovo Elektroporation kann verwendet werden, um auditorische Hirnstammregionen zu bestimmen, die für hochspezialisierte auditive Funktionen verantwortlich sind. Zu diesen Regionen gehören der Hühnerkern Magnozellularis (NM) und der Kernlaminaris (NL). NM- und NL-Neuronen entstehen aus verschiedenen Vorläufern der Rhombomere 5 und 6 (R5 / R6). Hier präsentieren wir in der Ovo- Elektroporation von Plasmid-codierten Genen, um gen-bezogene Eigenschaften in diesen Regionen zu untersuchen. Wir zeigen eine Methode zur räumlichen und zeitlichen Kontrolle der Genexpression, die entweder Gewinn oder Verlust des funktionellen Phänotyps fördernEs Durch die Ausrichtung auf auditorische neuronale Progenitorregionen, die mit R5 / R6 assoziiert sind, zeigen wir die Plasmid-Transfektion in NM und NL. Die zeitliche Regulation der Genexpression kann durch die Annahme eines Tet-on-Vektorsystems erreicht werden. Dies ist ein Arzneimittel-induzierbares Verfahren, das die interessierenden Gene in Gegenwart von Doxycyclin (Dox) exprimiert. Die in ovo- Elektroporationstechnik - zusammen mit biochemischen, pharmakologischen und oder in vivo funktionellen Assays - bietet einen innovativen Ansatz zur Untersuchung der auditorischen Neuronenentwicklung und der damit verbundenen pathophysiologischen Phänomene.

Wir zeigen hier, dass in ovo Elektroporation die Genexpression in einem normal sich entwickelnden biologischen System erlaubt. Plasmid-codierte Gene werden fokal in das Neuralrohr injiziert, das über R5 / R6 liegt. Ein schematisches Beispiel für die Elektroden- und Pipettenplatzierungen relativ zu wichtigen anatomischen Markern ist in Fig. 1A gezeigt . Die korrekte Position der Plasmidinjektion wird 24 h nach der Elektroporation bestätigt und in 1B ge...

Watch this Scientific Journal Video about In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem at JoVE.com

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Auditorische Hirnstamm Neuronen von Vogel und Säugetiere sind spezialisiert auf schnelle neuronale Kodierung, ein grundlegendes Verfahren für normale Hörfunktionen. Diese Neuronen entstehen aus verschiedenen Vorläufern des embryonalen Hinterhirns. Wir präsentieren Techniken, die die Elektroporation verwenden, um Gene im Hirnhirn von Hühnerembryonen zu exprimieren, um die Genfunktion während der auditorischen Entwicklung zu untersuchen.

In Ovo Electroporation im Hühnchen auditorischen Hirnstamm

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

in-ovo-electroporation-in-the-chicken-auditory-brainstem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

8.4K Aufrufe.  Northwestern University.  Auditorische Hirnstamm Neuronen von Vogel und Säugetiere sind spezialisiert auf schnelle neuronale Kodierung, ein grundlegendes Verfahren für normale Hörfunktionen. Diese Neuronen entstehen aus verschiedenen Vorläufern des embryonalen Hinterhirns. Wir präsentieren Techniken, die die Elektroporation verwenden, um Gene im Hirnhirn von Hühnerembryonen zu exprimieren, um die Genfunktion während der auditorischen Entwicklung zu untersuchen. 

Serie: In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at discreet periods of development 1-4 as well as mechanisms for temporal coding in the central nervous system 5-7.
Here we present a method to prepare chicken auditory brainstem slices that can be used for acute experimental procedures or to culture organotypic slices for long-term experimental manipulations.
The chicken auditory brainstem is composed of nucleus angularis, magnocellularis, laminaris and superior olive. These nuclei are responsible for binaural sound processing and single coronal slice preparations preserve the entire circuitry. Ultimately, organotypic slice cultures can provide the opportunity to manipulate several developmental parameters such as synaptic activity, expression of pre and postsynaptic components, expression of aspects controlling excitability and differential gene expression
This approach can be used to broaden general knowledge about neural circuit development, refinement and maturation.

The chicken auditory brainstem is comprised of nuclei responsible for binaural sound processing. A single coronal slice preparation maintains the entire circuitry while the cultured approach provides a unique preparation to study the development of neuronal structure and auditory function at the molecular, cellular and network levels.

Vorbereitung und Kultur von Chicken auditorischen Hirnstamm Slices

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at ...

Forschung

Neurowissenschaften

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

Gentransfer in das Huhn Hörorgan von<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-Elektroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Entwicklungsbiologie

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

In Ovo Electroporations von HH Stage 10 Hühnerembryonen

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Biologie

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

In ovo Elektroporation in Mittelhirn-Küken für Studien über Genfunktion in dopaminergen Neuronen Entwicklung

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

Elektroporation des Hinterhirn zu Axonal Trajectories und Synaptic Treffer in der Embryo-Küken Trace

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

Employment of enhancer elements to drive expression of reporter genes in neurons is a widely used paradigm for tracking axonal projection. For tracking axonal projection of spinal interneurons in vertebrates, germ line-targeted reporter genes yield bilaterally symmetric labeling. Therefore, it is hard to distinguish between the ipsi- and contra-laterally projecting axons. Unilateral electroporation into the chick neural tube provides a useful means to restrict expression of a reporter gene to one side of the central nervous system, and to follow axonal projection on both sides 1 ,2-5. This video demonstrates first how to handle the eggs prior to injection. At HH stage 18-20, DNA is injected into the sacral level of the neural tube, then tungsten electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator. The egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development. Three days later (E6) the spinal cord is removed as an open book preparation from embryo, fixed, and processed for whole mount antibody staining. The stained spinal cord is mounted on slide and visualized using confocal microscopy.

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

This video demonstrates how to visualize axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the embryonic chick spinal cord utilizing in ovo electroporation of reporter genes under the control of specific enhancer elements.

Die Entzifferung Axonal Pathways von genetisch definierte Gruppen von Neuronen in der Küken Neuralrohr Verwendung In ovo Elektroporation

Employment of enhancer elements to drive expression of reporter genes in neurons is a widely used paradigm for tracking axonal projection. For tracking ...

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as the hair cell. Basic research in the inner ear has led to a deep understanding of how the hair cell functions, and how dysregulation can lead to hearing loss and vertigo. For this research, the mouse has been the pre-eminent model system. However, mice, like all mammals, have lost the ability to replace hair cells. Thus, when trying to understand cellular therapies for restoring inner ear function, complementary studies in other vertebrate species could provide further insights. The auditory epithelium of birds, the basilar papilla (BP), is a sheet of epithelium composed of mechanosensory hair cells (HCs) intercalated by supporting cells (SCs). Although the anatomical architecture of the basilar papilla and the mammalian cochlea differ, the molecular mechanisms of inner ear development and hearing are similar. This makes the basilar papilla a useful system for not only comparative studies but also to understand regeneration. Here, we describe dissection and manipulation techniques for the chicken inner ear. The technique shows genetic and small molecule inhibition methods, which offer a potent tool for studying the molecular mechanisms of inner ear development. In this paper, we discuss in ovo electroporation techniques to genetically perturb the basilar papilla using CRIPSR-Cas9 deletions, followed by dissection of the basilar papilla. We also demonstrate the BP organ culture and optimal use of culture matrices, to observe the development of the epithelium and the hair cells.

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The chick is a cost-effective, accessible, and widely available model organism for a variety of studies. Here, a series of protocols is detailed to understand the molecular mechanisms underlying avian inner ear development and regeneration.

In Ovo und Ex Ovo Methoden zur Untersuchung der Entwicklung des Vogelinnenohrs

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

Slicing the Embryonic Chicken Auditory Brainstem to Evaluate Tonotopic Gradients and Microcircuits

The chicken embryo is a widely accepted animal model to study the auditory brainstem, composed of highly specialized microcircuitry and neuronal topology differentially oriented along a tonotopic (i.e., frequency) axis. The tonotopic axis permits the segregated encoding of high-frequency sounds in the rostral-medial plane and low-frequency encoding in caudo-lateral regions. Traditionally, coronal brainstem slices of embryonic tissue permit the study of relative individual iso-frequency lamina. Although sufficient to investigate anatomical and physiological questions pertaining to individual iso-frequency regions, the study of tonotopic variation and its development across larger auditory brainstem areas is somewhat limited. This protocol reports brainstem slicing techniques from chicken embryos that encompass larger gradients of frequency regions in the lower auditory brainstem. The utilization of different slicing methods for chicken auditory brainstem tissue permits electrophysiological and anatomical experiments within one brainstem slice, where larger gradients of tonotopic properties and developmental trajectories are better preserved than coronal sections. Multiple slicing techniques allow for improved investigation of the diverse anatomical, biophysical, and tonotopic properties of auditory brainstem microcircuits.

Here we present a protocol for obtaining non-coronal auditory brainstem slices of the chicken embryo for the investigation of tonotopic properties and developmental trajectories within one brainstem slice. These slices include sagittal, horizontal, and horizontal/transverse sections encompassing larger tonotopic regions within an individual slice plane that the traditional coronal sections.

Schneiden des embryonalen Hühnerhirnstamms zur Bewertung tonotopischer Gradienten und Mikroschaltkreise

The chicken embryo is a widely accepted animal model to study the auditory brainstem, composed of highly specialized microcircuitry and neuronal topology ...

Evaluation of Auditory Brainstem Response in Chicken Hatchlings

The auditory brainstem response (ABR) is an invaluable assay in clinical audiology, non-human animals, and human research. Despite the widespread use of ABRs in measuring auditory neural synchrony and estimating hearing sensitivity in other vertebrate model systems, methods for recording ABRs in the chicken have not been reported in nearly four decades. Chickens provide a robust animal research model because their auditory system is near functional maturation during late embryonic and early hatchling stages. We have demonstrated methods used to elicit one or two-channel ABR recordings using subdermal needle electrode arrays in chicken hatchlings. Regardless of electrode recording configuration (i.e., montage), ABR recordings included 3-4 positive-going peak waveforms within the first 6 ms of a suprathreshold click stimulus. Peak-to-trough waveform amplitudes ranged from 2-11 &#181;V at high-intensity levels, with positive peaks exhibiting expected latency-intensity functions (i.e., increase in latency as a function of decreased intensity). Standardized earphone position was critical for optimal recordings as loose skin can occlude the ear canal, and animal movement can dislodge the stimulus transducer. Peak amplitudes were smaller, and latencies were longer as animal body temperature lowered, supporting the need for maintaining physiological body temperature. For young hatchlings (&#60;3 h post-hatch day 1), thresholds were elevated by ~5 dB, peak latencies increased ~1-2 ms, and peak to trough amplitudes were decreased ~1 &#181;V compared to older hatchlings. This suggests a potential conductive-related issue (i.e., fluid in the middle ear cavity) and should be considered for young hatchlings. Overall, the ABR methods outlined here permit accurate and reproducible recording of in-vivo auditory function in chicken hatchlings that could be applied to different stages of development. Such findings are easily compared to human and mammalian models of hearing loss, aging, or other auditory-related manipulations.

We have used standard auditory brainstem response (ABR) techniques and applied them to hatchling chickens, a precocious avian model for auditory function. The protocol outlines animal preparation and ABR acquisition techniques in detail, with steps that could translate to other avian or rodent models.

Bewertung der auditiven Hirnstammreaktion bei Hühnerschlüpflingen

The auditory brainstem response (ABR) is an invaluable assay in clinical audiology, non-human animals, and human research. Despite the widespread use of ...

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Fragile X mental retardation protein (FMRP) is an mRNA-binding protein that regulates local protein translation. FMRP loss or dysfunction leads to aberrant neuronal and synaptic activities in fragile X syndrome (FXS), which is characterized by intellectual disability, sensory abnormalities, and social communication problems. Studies of FMRP function and FXS pathogenesis have primarily been conducted with Fmr1 (the gene encoding FMRP) knockout in transgenic animals. Here we report an in vivo method for determining the cell-autonomous function of FMRP during the period of circuit assembly and synaptic formation using chicken embryos. This method employs stage-, site-, and direction-specific electroporation of a drug-inducible vector system containing Fmr1 small hairpin RNA (shRNA) and an EGFP reporter. With this method, we achieved selective FMRP knockdown in the auditory ganglion (AG) and in one of its brainstem targets, the nucleus magnocellularis (NM), thus providing a component-specific manipulation within the AG-NM circuit. Additionally, the mosaic pattern of the transfection allows within-animal controls and neighboring neuron/fiber comparisons for enhanced reliability and sensitivity in data analyzing. The inducible vector system provides temporal control of gene editing onset to minimize accumulating developmental effects. The combination of these strategies provides an innovative tool to dissect the cell-autonomous function of FMRP in synaptic and circuit development.

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Using in ovo electroporation, we devised a method to selectively transfect the auditory inner ear and cochlear nucleus in chicken embryos to achieve a cell-group-specific knockdown of fragile X mental retardation protein during discrete periods of circuit assembly.

Sezieren der zellautonomen Funktion des fragilen X-mentalen Retardierungsproteins in einem auditorischen Schaltkreis durch In-Ovo-Elektroporation