Wir danken Drs. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria und Frau Ximena Optiz-Araya für die erste Unterstützung bei der Protokollierung und zur Bereitstellung von Plasmiden. Diese Arbeit wurde von NIH / NIDCD Grant DC013841 (JTS) unterstützt.

Alle Verfahren wurden von Northwestern University Institutional Animal Care und Use Committees genehmigt und durchgeführt in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guidelines für die Pflege und Verwendung von Labortieren. 1. Eierbearbeitung <ol><li> Kaufen Sie befruchtete Eier von einem örtlichen Verkäufer. Eier bei 13 ° C im Kühlschrank für höchstens 5 Tage vor der Inkubation aufbewahren. Die Embryo-Lebensfähigkeit verringert sich nach 1 Woche deutlich. </li><li> Tupfe jedes Ei mit 70% Ethanol vor dem Einstellen in den Inkubator. </li><li> Setzen Sie 1-2 Dutzend Eier an ihren Seiten in einem Inkubator mit der Temperatur auf 38 ° C bei ~ 50% Feuchtigkeit eingestellt. Dies gewährleistet eine korrekte Embryo-Positionierung für die Elektroporation und eine optimale Lebensfähigkeit. HINWEIS: Nach 48-52 h Inkubation werden die Eier bei Hamburger-Hamilton (HH) Bühne ~ 12-13 und bereit für Elektroporation. </li></ol> 2. Vorbereitung <ol><li> Plasmid MiXing <ol><li> Füge 1 μl 0,1% Fast Green (0,1% in 18 MΩ deionisiertem und destilliertem H 2 O [ddH 2 O]) für jede 7 μl DNA Mischung hinzu. </li><li> Zur Co-Elektroporation von mehreren Plasmiden, vermischen Sie Plasmide im Verhältnis 1: 1. Die endgültige DNA-Konzentration sollte 5-8 μg / μL betragen. </li></ol></li><li> Einfüllpipette füllen <ol><li> Pipetten auf einen Mikropipettenabzieher ziehen. Füllen Sie die Pipette mit 1-2 μl Plasmiden mit einer 28G Spritzenadel. </li><li> Pipettenspitze mit Pinzette auf 10 - 20 μm pipettieren. Verwenden Sie ein Mikroskop, um bei der Bestimmung der Größe der gebrochenen Pipettenspitze zu helfen. Bringen Sie die Pipette an den Pipettenhalter des Picospritzers an. </li></ol></li></ol> 3. Fenster HINWEIS: Das Fensterverfahren wurde vor 13 veröffentlicht. Bitte beachten Sie bitte die Referenz 13 für weitere visuelle Informationen. <ol><li> Wischen Sie alle Instrumente und den Arbeitsbereich mit 70%Ethanol. </li><li> Nehmen Sie die gewünschte Anzahl von Eier aus dem Inkubator (zwischen 6-10), lassen Sie bei Raumtemperatur ab und tauschen Sie Eier mit 70% Ethanol wieder ab. Eier bleiben für mindestens 2 Stunden nach der Inkubatorentfernung lebensfähig. </li><li> Legen Sie das Ei auf eine Licht-Illuminator, um die Embryo-Positionierung zu identifizieren. Umkreisen Sie die Mitte des dunklen Bereichs ( dh Embryo) mit einem Bleistift. </li><li> Mit einer 19G-Nadel, stoße ein Loch in das stumpfe Ende des Eies. </li><li> Stoßen Sie ein anderes Loch in der Nähe des gezogenen Kreises auf die spitze Seite des Eies. Entfernen Sie ein kleines Stück der äußeren Eierschale (ca. 16 mm 2 ) mit der 19G-Nadel und entfernen Sie dann ein kleines Stück der inneren Eierschale (ca. 8 mm 2 ) mit einer Pinzette. </li><li> Mit einer 3-ml-Spritze, die mit einer 19G-Nadel ausgestattet ist, entziehen Sie 1,5-2,5 ml Albumin aus dem Ei durch das Stumpfloch. Achten Sie darauf, die Nadel bei 45 ° nach unten zu schlagen. </li><li> Decken Sie das stumpfe Ende mit einem kleinen Stück Klebeband (1 cm x 1 cm) ab. Bedecken den gezeichneten Kreis undD das zweite Loch mit Klebeband (2,5 cm x 4 cm). </li><li> Mit geschwungener Schere (Schneide = 2,5 cm) schneide ein Fenster im Kreis. Schere sollte parallel zur Eierschale sein und der Durchmesser des Fensters sollte weniger als 2 cm betragen. </li></ol> 4. Plasmid-Injektion <ol><li> Schalte den Pikospritzer ein. Stellen Sie den Druck auf 18 psi und die Dauer auf 5 μs. Schalten Sie den Luftbehälter und die Lampe für das Sektionsmikroskop ein. </li><li> Mischen Sie 30 mL Stammlösung einer 1: 10-Verdünnung der gekauften indischen Tinte, die in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gemischt wurde. Bei 4 ° C aufbewahren. Die Injektion der indischen Tinte ist ein wichtiger Schritt, um eine bessere Visualisierung des Hühnerembryos zu erhalten. <ol><li> Füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit der verdünnten indischen Tintenlösung. Bringen Sie eine 27G-Nadel an und vertreiben Sie alle Blasen, die in der Spritze vorhanden sind. </li><li> Setzen Sie die Nadel gerade unter die Eigelb Membran ~ 2 - 3 mm aus dem Embryo und injizieren ~ 0,2 ml indischen Tinte sanft unter dem Embryo. MachenNicht mehr als 0,5 ml der indischen Tinte injizieren, da es das Überleben des Embryos verringern kann. </li></ol></li><li> Legen Sie das Fenster-Ei auf einen Eierhalter unter dem Sektionsmikroskop. Verwenden Sie die höchste Vergrößerung für die beste Visualisierung der Plasmid-Injektionsstelle. </li><li> Mit der Pinzette die Membran über den Injektionsbereich entfernen. Von den Rhombomeren 5 und 6 (R5 / R6) entstehen akustische Hirnstammregionen von Interesse ( dh NM und NL). R5 / R6 befinden sich neben den Otozysten (eine embryonale Struktur bei Wirbeltieren, die sich in das Innenohr entwickeln), die als Orientierungspunkte für R5 / R6-Plasmidinjektionen dienen. </li><li> Senken Sie die DNA-gefüllte Pipette in das Neuralrohr, das über dem R5 / R6-Bereich liegt, und zwischen den Otocysten unter Verwendung des Mikromanipulators. Ein Schema der idealen Platzierung ist in Fig. 1A gezeigt . </li><li> Tragen Sie Luftdruck (18 psi, 5 μs Dauer) von der Picospritzer, um DNA in der Neuralröhre auszustoßen. </li></ol> 5. Elektroporation <ol><li> Einschalten tEr Strom / Spannung Stimulator. </li><li> Füllen Sie eine 3-ml-Spritze mit PBS und befestigen Sie den Spritzenfilter. Füge 1-2 Tropfen PBS auf den Embryo hinzu. </li><li> Senken Sie die bipolare Elektrode zum Embryo unter Verwendung des Mikromanipulators mit der negativen Elektrode oberhalb der Injektionsstelle (medial) und der positiven Elektrode lateral zum R5 / R6 (Abbildung 1A ). Vermeiden Sie direkten Kontakt mit dem Embryo. Verwenden Sie bipolare Elektroden, bei denen das Elektrodenmaterial Platin-Iridium ist. Den Abstand zwischen den Spitzen auf 0,5 mm mit Pinzette einstellen. </li><li> Mit einem Strom- / Spannungsstimulator, Puls 20 mal bei 50 V für 1 ms in 1 s Intervallen. </li><li> Nach der Elektroporation fügen Sie einen Tropfen PBS über den exponierten Bereich hinzu. Entfernen Sie die Elektrode vorsichtig und reinigen Sie sie mit einem Laborgewebe und 70% Ethanol. Schließen Sie das Fenster, das den Embryo mit Klebeband aussetzt. </li><li> Etikett Eierschale mit dem injizierten Plasmid-Typ und die Luke Datum. </li><li> Lege die Eier wieder in den Inkubator mit der Fensterseite nach oben. Inkubieren bei 38 ° C mit 50% Luftfeuchtigkeit bis zur gewünschten Entwicklungsstufe erreicht. </li><li> Wenn ein Tet-on-Vektor für die zeitliche Kontrolle der Genexpression elektroporiert wird, müssen alle 24 h Doxycyclin (Dox) angewendet werden, um die Genexpression zu induzieren (siehe Abschnitt 6). </li></ol> 6. Tet-on-System zur zeitlichen Kontrolle der Genexpression <ol><li> Verwenden Sie die folgenden Plasmide: PCAGGS-T2TP: eine Transposase, die Plasmid exprimiert. PT2K-CAGGS-rtTA-M2: ein Plasmid, das das Dox-bindende Protein stabil exprimiert. PT2K-BI-TRE-EGFP: ein Plasmid, das einen bidirektionalen Tet-on-Promotor (TRE) -abhängige Expression des EGFP-Reporters und ein zweites Gen von Interesse enthält. HINWEIS: Die obigen drei Plasmide müssen im Verhältnis 1: 1: 1 co-elektroporiert werden. </li><li> Lagerlösungsvorbereitung: <ol><li> Dox in sterilem PBS auflösen, um eine 1 mg / ml Stammlösung zu erzeugen. Bei -20 ° C aufbewahren. </li></ol></li><li> Dox Anwendung: <ol><li> Um das expressio zu induzierenN des Gens von Interesse während bestimmter Entwicklungsstadien, gelten Dox alle 24 Stunden. </li><li> Bei der Anwendung von Dox nehmen Sie das Ei heraus, öffnen Sie das Fenster, pipettieren Sie 50 μL Dox auf die chorioallointoische Membran, schließen Sie das Fenster und legen Sie das Ei wieder in den Inkubator. </li></ol></li></ol> 7. Vorbereitung der Dissektionsfläche für Hirnstammscheiben HINWEIS: Die folgenden Abschnitte (7 - 9) und Verfahren wurden vor 14 veröffentlicht. Bitte beachten Sie diese Hinweise für weitere visuelle Informationen. <ol><li> Eine Agarlösung (40 mg / ml Agarose, dh 4% in ddH 2 O) zubereiten. Agar-Lösung in eine Petrischale geben und bei Raumtemperatur erstarren lassen. Lagern Sie die gedeckte Agarplatte im Kühlschrank für die zukünftige Verwendung während des Hirnstammes, der das Gewebe schneidet. </li><li> Kontinuierliche Blase künstliche zerebrale Spinalflüssigkeit (ACSF) mit 95% O 2 und 5% CO 2 (pH 7,2-7,4 und Osmolarität: 295-310 mOsm / L).</li><li> Den Arbeitsbereich und Vibratom mit 70% EtOH reinigen und die Klinge mit destilliertem Wasser spülen. </li><li> Legen Sie einen sauberen Flüssigkeitsabsorptionskissen auf den Arbeitsbereich mit geeigneten Sektionswerkzeugen. </li><li> Nehmen Sie die Agarplatte aus dem Kühlschrank, schneiden Sie einen kleinen Agarwürfel (10 mm x 10 mm x 8 mm). Kleben Sie den Agarblock auf die Stufe einer Vibrationsschneidkammer mit handelsüblichem Sekundenkleber. </li></ol> 8. Isolierung des Hühnchen-akustischen Hirnstamms <ol><li> Öffnen Sie das Ei an der Taped-Fenster-Seite. Punktion der Membran Sac mit einem Skalpell und entfernen Sie den Kopf des Hühnerembryos. </li><li> Enthaupte das Huhn mit scharfer Schere. </li><li> Legen Sie die Rasierklingenspitze etwas nach hinten in die Augen. Schneide durch den Schädel an der rostral-to-caudalen Mittellinie. Tragen Sie leichten Druck je nach Alter des Embryos. Ältere Embryonen erfordern mehr Druck. </li><li> Schieben Sie die Haut und die Federn vorsichtig ab, um Schädel auszusetzen und den Mittellinienschnitt zu überprüfen. </li><li> Anwenden sDrehen Sie den rostralen Teil des Schädels mit einer Rasierklinge. Setzen Sie die Klinge sofort nach hinten und schneiden Sie durch den ganzen Schädel und das Gehirngewebe. </li><li> Machen Sie Mittellinie-zu-laterale Schnitte mit einer Schere im Schädel &quot;sududalen Bereich, etwas anterior bis Nackenmuskeln auf beiden Seiten des Kopfes. Expose Gehirn und Kleinhirn durch Ziehen weg Schädel und überschüssiges Gewebe. </li><li> Schneide Gewebe an den Hirnstamm mit Schere befestigt und entfernen Sie die Hirnstamm, die frei löst sich vom Schädel. </li></ol> 9. Vorbereitung von Hirnstammscheiben für In-vivo- Elektrophysiologie oder Imaging <ol><li> Pin Hirnstamm durch die Optik tecta. </li><li> Entfernen Sie das Kleinhirn, indem Sie Stöcke mit einer Schere schneiden und den Boden des vierten Ventrikels aussetzen. </li><li> Mit Pinzetten, entfernen Sie alle membranösen Gewebe und Blutgefäße aus der Hirnstamm Oberfläche. </li><li> Um den Hirnstamm zu blockieren, machen Sie einen horizontalen Schnitt am östlichsten Ende des Bodens der vierTh ventrikel, nur kaudal der kortex Setzen Sie seitliche Schnitte senkrecht durch die Optik tecta, um den Hirnstamm zu isolieren. </li><li> Legen Sie eine kleine Menge von Leim auf die Vibrationsstufe direkt vor dem Agarblock. </li><li> Heben Sie den Hirnstamm am Rückenmark mit Pinzette an und legen Sie ihn auf den Superleim mit rostraler Seite nach unten und dorsaler Seite zur Vibrationsklinge. Entfernen Sie überschüssigen Kleber mit einem Laborgewebe oder Filterpapier. </li><li> Gießen Sie sauerstoffhaltiges ACSF in die Vibrationsstufe. Setzen Sie die Vibrationsklinge auf einen Winkel von 20-22 °. Start Vibratom bei maximaler Amplitude Oszillation. Bewege die Bühne in Richtung der Klinge, so dass die Oberseite des Gewebes parallel zur Klinge ist. </li><li> Die Klinge schnell in Richtung Hirnstammgewebe bewegen. Verlangsamen Sie die Klinge erheblich vor dem Kontakt der Klinge mit dem Gewebe. </li><li> Scheibengewebe mit der langsamsten Vorwärtsgeschwindigkeit. Sobald die Klinge durch den gesamten koronalen Gewebeabschnitt ist, entfernen Sie die Scheibe vorsichtig mit einer Transferpipette/ Li&gt; <li> Die Stufe 200-300 μm absenken und wieder schneiden. Wiederholen, bis anatomische Landmarken von Hörkernen sichtbar werden, zB die deutliche dorsale / ventrale Neuropilregion NL und die mediale Lage von NM im Vergleich zu NL. </li><li> Sorgfältige Aufbewahrung von Scheiben in ACFS. Dies kann bei Raumtemperatur (22 ° C) oder in der Nähe von physiologischen Bedingungen (~ 41 ° C) mit einem warmen Wasserbad erfolgen. Beachten Sie die Reihenfolge des Schneidens. Die erste Scheibe entspricht der kaudalsten Gewebsfläche und die letzte Scheibe entspricht der rostralen Region. Dies stellt grob die tonotopische Organisation des auditorischen Hirnstamms dar, von Nieder- bis Hochfrequenz-Kodierungsregionen. </li></ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In ovo Elektroporation ist eine Methode zur Expression oder Klopfen von Genen von Interesse, um in vivo Gen-Funktion 8 , 9 zu analysieren. Im Hühnerembryo ist es eine innovative Methode zur Expression von Plasmid-codierten Genen in verschiedene akustische Hirnstammregionen 8 . Um einen optimalen Ausdruck zu gewährleisten, sind mehrere kritische Schritte erforderlich. Zuerst nur Embryonen injizieren, deren Otozysten deu...

Eine schnelle neuronale Kodierung von Klängen ist für normale Hörfunktionen unerlässlich. Dazu gehören die Klanglokalisierungsfähigkeiten 1 , die Sprache in der Rauschunterscheidung 2 und das Verständnis anderer verhaltensrelevanter Kommunikationssignale 3 . Analoge Neuronen, die sich im auditorischen Hirnstamm von Vogel und Säugetieren befinden, sind hochspezialisiert für eine schnelle neuronale Kodierung 4 . Dazu gehören der Hühnerkern Magnocellularis (NM), der Nucleus laminaris (NL) und deren Säugetieranaloga, der anteroventrale Cochlearkern (AVCN) und der mediale Superior Olive (MSO) bzw. 5 . Allerdings sind Entwicklungsmechanismen, die eine schnelle neuronale Kodierung regulieren, im auditorischen Hirnstamm schlecht verstanden. Daher ist es vorteilhaft, spezifische Gene zu studieren, die für eine schnelle neuronale Kodierung verantwortlich sind, um ihren Ausdruck, ihre Regulierung und ihre Funktion in au zu verstehenDitory Entwicklung. Der Entwicklung von Hühnerembryo ist ein wirksames und etabliertes Forschungsinstrument, um grundlegende biologische Fragen der auditorischen Systementwicklung zu untersuchen 6 , 7 . Jüngste molekulare Fortschritte haben diese biologischen Fragen in den sich entwickelnden Hühnerembryo durch Ausdrücken oder Klopfen von Genen von Interesse, um in vivo Gen-Funktion 8 , 9 zu analysieren. Die Untersuchung der regulatorischen Rolle von spezifischen Genen ist ein wichtiger Fortschritt beim Verständnis von Pathologien im Zusammenhang mit akustischen Defiziten. Hier präsentieren wir in der Ovo- Elektroporation von Plasmid-codierten Genen in den Hühner-Hirnstamm, wo eine schnelle neuronale Kodierung des Klangs auftritt 10 . Durch die Ausrichtung auf auditorische neuronale Vorläuferregionen, die mit den Rhombomeren 5 und 6, 11 , 12 (R5 /R6) zeigen wir die räumliche Kontrolle der Plasmid-Transfektion in NM und NL. Darüber hinaus zeigen wir eine zeitliche Regulierung des Ausdrucks durch die Annahme eines Tet-on-Vektorsystems. Dies ist ein Arzneimittel-induzierbares Verfahren, das die interessierenden Gene in Gegenwart von Doxycyclin (Dox) 8 exprimiert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fertilized white leghorn chicken eggs</td>
			<td>Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>052-0500-900</td>
			<td>Picospritzer III, single or dual channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current/voltage stimulator</td>
			<td>Grass Technologies</td>
			<td>SD9</td>
			<td>SD9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfil syringe needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF28G67-5</td>
			<td>28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1280</td>
			<td>MP Series: Non-Electrical Pressure Applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulating microelectrode</td>
			<td>FHC</td>
			<td>PBSA1075</td>
			<td>PBSA1075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air tank/regulator</td>
			<td>NU Laboratory Services</td>
			<td></td>
			<td>Air dry 300 CF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>F7258-25G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear plastic tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9891-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg refrigerator</td>
			<td>Vissani Wine Refrigerator</td>
			<td></td>
			<td>13.3-16.1&#176; C (56-61&#176; F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Hova-Bator</td>
			<td></td>
			<td>37.8&#176; C (100&#176; F), ~50% humidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4.35E+15</td>
			<td>SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold-light source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4.36E+15</td>
			<td>CL6000 LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>Model: MM-3</td>
			<td>2 Micromanipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF150-86-10</td>
			<td>Thick-walled borosilicate (dimensions)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mL, 3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>BD Precision Glide&#160;</td>
			<td></td>
			<td>27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>No. 5 Super Fine Dumont</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg holder</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td></td>
			<td>Clay base works as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td></td>
			<td>Model P-97</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Ultra Cruz</td>
			<td>sc-358811</td>
			<td>PVDF 0.22 &#956;m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in ovo electroporation in the chicken auditory brainstem

Elektroporation ist eine Methode, die interessante Gene in biologisch relevante Organismen wie den Hühnerembryo einführt. Es ist lange festzustellen, dass der Hühnerembryo ein wirksames Forschungsmodell für das Studium der grundlegenden biologischen Funktionen der auditorischen Systementwicklung ist. In jüngster Zeit ist der Hühnerembryo besonders wertvoll bei der Untersuchung von Genexpression, Regulation und Funktion, die mit dem Hören verbunden ist. In ovo Elektroporation kann verwendet werden, um auditorische Hirnstammregionen zu bestimmen, die für hochspezialisierte auditive Funktionen verantwortlich sind. Zu diesen Regionen gehören der Hühnerkern Magnozellularis (NM) und der Kernlaminaris (NL). NM- und NL-Neuronen entstehen aus verschiedenen Vorläufern der Rhombomere 5 und 6 (R5 / R6). Hier präsentieren wir in der Ovo- Elektroporation von Plasmid-codierten Genen, um gen-bezogene Eigenschaften in diesen Regionen zu untersuchen. Wir zeigen eine Methode zur räumlichen und zeitlichen Kontrolle der Genexpression, die entweder Gewinn oder Verlust des funktionellen Phänotyps fördernEs Durch die Ausrichtung auf auditorische neuronale Progenitorregionen, die mit R5 / R6 assoziiert sind, zeigen wir die Plasmid-Transfektion in NM und NL. Die zeitliche Regulation der Genexpression kann durch die Annahme eines Tet-on-Vektorsystems erreicht werden. Dies ist ein Arzneimittel-induzierbares Verfahren, das die interessierenden Gene in Gegenwart von Doxycyclin (Dox) exprimiert. Die in ovo- Elektroporationstechnik - zusammen mit biochemischen, pharmakologischen und oder in vivo funktionellen Assays - bietet einen innovativen Ansatz zur Untersuchung der auditorischen Neuronenentwicklung und der damit verbundenen pathophysiologischen Phänomene.

Wir zeigen hier, dass in ovo Elektroporation die Genexpression in einem normal sich entwickelnden biologischen System erlaubt. Plasmid-codierte Gene werden fokal in das Neuralrohr injiziert, das über R5 / R6 liegt. Ein schematisches Beispiel für die Elektroden- und Pipettenplatzierungen relativ zu wichtigen anatomischen Markern ist in Fig. 1A gezeigt . Die korrekte Position der Plasmidinjektion wird 24 h nach der Elektroporation bestätigt und in 1B ge...

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In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Auditorische Hirnstamm Neuronen von Vogel und Säugetiere sind spezialisiert auf schnelle neuronale Kodierung, ein grundlegendes Verfahren für normale Hörfunktionen. Diese Neuronen entstehen aus verschiedenen Vorläufern des embryonalen Hinterhirns. Wir präsentieren Techniken, die die Elektroporation verwenden, um Gene im Hirnhirn von Hühnerembryonen zu exprimieren, um die Genfunktion während der auditorischen Entwicklung zu untersuchen.

In Ovo Electroporation im Hühnchen auditorischen Hirnstamm

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

8.4K Aufrufe.  Northwestern University.  Auditorische Hirnstamm Neuronen von Vogel und Säugetiere sind spezialisiert auf schnelle neuronale Kodierung, ein grundlegendes Verfahren für normale Hörfunktionen. Diese Neuronen entstehen aus verschiedenen Vorläufern des embryonalen Hinterhirns. Wir präsentieren Techniken, die die Elektroporation verwenden, um Gene im Hirnhirn von Hühnerembryonen zu exprimieren, um die Genfunktion während der auditorischen Entwicklung zu untersuchen. 

Serie: In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

Effizienten Gentransfer in Küken Netzhäute für primäre Zellkulturstudien: Eine<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elektroporation Ansatz

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental manipulations in ovo/in vivo makes the chicken embryonic retina a versatile and very efficient experimental model. Although the chicken retina is easy to target in ovo by intraocular injections or electroporation, the effective and exact concentration of the reagents within the retina may be difficult to fully control. This may be due to variations of the exact injection site, leakage from the eye or uneven diffusion of the substances. Furthermore, the frequency of malformations and mortality after invasive manipulations such as electroporation is rather high.
This protocol describes an ex ovo technique for culturing whole retinal explants from chicken embryos and provides a method for controlled exposure of the retina to reagents. The protocol describes how to dissect, experimentally manipulate, and culture whole retinal explants from chicken embryos. The explants can be cultured for approximately 24 hr and be subjected to different manipulations such as electroporation. The major advantages are that the experiment is not dependent on the survival of the embryo and that the concentration of the introduced reagent can be varied and controlled in order to determine and optimize the effective concentration. Furthermore, the technique is rapid, cheap and together with its high experimental success rate, it ensures reproducible results. It should be emphasized that it serves as an excellent complement to experiments performed in ovo.

This protocol describes a method to dissect, experimentally manipulate and culture whole retinal explants from chicken embryos. The explant cultures are useful when high success rate, efficacy and reproducibility are needed to test the effects of plasmids for electroporation and/or reagent substances, i.e., enzymatic inhibitors.

Whole Retinal Explantaten aus Hühnerembryonen für die Elektroporation und Reagens-Behandlungen

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Technik auf Zielmikroinjektions an die Entwicklungs<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

Gentransfer in das Huhn Hörorgan von<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-Elektroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and molecular level. To alter intracardiac hemodynamics, fertilized chicken eggs are incubated in a humidified chamber to obtain embryos of the desired stage (HH17). Once this developmental stage is achieved, the embryo is maintained ex ovo and hemodynamics in the embryonic heart are altered by partially constricting the outflow tract (OFT) with a surgical suture at the junction of the OFT and ventricle (OVJ). Control embryos are also cultured ex ovo but are not subjected to the surgical intervention. Banded and control embryos are then incubated in a humidified incubator for the desired period of time, after which 2D ultrasound is employed to analyze the change in blood flow velocity at the OVJ as a result of OFT banding. Once embryos are maintained ex ovo, it is important to ensure adequate hydration in the incubation chamber so as to prevent drying and eventually embryo death. Using this new banded model, it is now possible to perform analyses of changes in the expression of key players involved in valve development and to understand the role of hemodynamics on cellular responses in vivo, which could not be achieved previously.

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

For the first time we present here a reproducible banding procedure to alter hemodynamics in the developing heart ex ovo. This is achieved by partially constricting the outflow tract (OFT).

Ein Roman<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Banding-Technik intrakardialer Hämodynamik in einem embryonalen Hühner System ändern

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

Embryo Mikroinjektions und Elektroporation in der bei Chor<em&gt; Schlauchseescheide</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

Anwendung von RNAi und Hitze-Schock-induzierte Transkription Faktor Ausdruck zu programmieren Keimzellen Neuronen in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Visualisierung der Knoten und Notochordal Platte In Gastrulating Maus-Embryonen mittels Rasterelektronenmikroskopie und ganze Mount Immunfluoreszenz

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...