Este protocolo combina una metodología clínicamente relevante con un modelo de investigación en animales bien establecido. Ayudará a responder preguntas sobre el desarrollo auditivo y el refinamiento y los cambios funcionales en la audición después de la manipulación genética. Esta técnica no es invasiva, por lo que no requiere cirugía y podría combinarse con experimentos adicionales.
Además, solo toma alrededor de una hora realizarlo. Este método podría usarse en cualquier especie de ave pequeña. Así que la fisiología comparativa es relativamente fácil.
El POLLO ABR también puede evaluar el efecto sobre la audición funcional después de la manipulación genética. Comience por adquirir huevos de gallina de pata blanca fertilizados. A continuación, incube el huevo a 38 grados centígrados y una humedad del 50% durante 21 días antes de la fecha de prueba deseada.
Una vez que el huevo esté eclosionado, pese al animal colocándolo suavemente en un bote de pesaje grande. Después de la inyección de anestesia, coloque al animal de nuevo en la incubadora. Luego verifique si el cuello está cojeando y pellizque el dedo del pie del animal con fórceps.
Como siguiente paso, determine el sexo del pollo usando sus plumas de ala. Más tarde, aplique crema depilatoria con un aplicador de punta de algodón en el área de la cabeza y el cuello, especialmente cerca de la abertura de la oreja para el ave. Ahora use toallitas de alcohol isopropílico 70% para limpiar las plumas, cualquier crema depilatoria restante y la piel de la cabeza y el cuello.
Además, esterilice los electrodos subdérmicos y la sonda rectal con una toallita de alcohol isopropílico al 70%. Coloque al animal en una cámara de aislamiento acústico y blindada eléctricamente, asegurando que el entorno tenga un ruido eléctrico y acústico mínimo para las mejores grabaciones. Use una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal de los animales.
Ahora inserte la sonda rectal y fije la cabeza del animal en su lugar o apoye el pico contra un objeto para evitar movimientos no deseados. A continuación, asegúrese de que la cámara de control de temperatura mantenga la temperatura del animal entre 37 y 41 grados centígrados. Utilice tres electrodos de aguja de acero inoxidable y cloruro de plata como referencia, electrodos activos y de tierra común.
Coloque cada electrodo subdérmicamente de dos a tres milímetros en la cabeza, pero no lo suficientemente profundo como para penetrar en el cráneo, y luego saque el electrodo de la piel, exponiendo la punta. Para la grabación de un solo canal, coloque el electrodo activo sobre el cráneo en la línea media hasta el canal auditivo. Coloque el electrodo de referencia detrás de la oreja donde se entregará el estímulo y coloque el electrodo de tierra detrás de la oreja contralateral en el cuello.
Ahora verifique la impedancia del electrodo. Asegúrese de que la impedancia total del electrodo no exceda los cinco kilo ohmios. Además, mantener la impedancia interelectrodo por debajo de los tres kilos ohmios.
Para la grabación ABR, dependiendo del hardware y software de adquisición, asegúrese de calibrar los niveles de sonido correctos en todas las frecuencias de estímulo utilizadas. Ahora mueva el aparato del transductor de sonido hacia el oído activo del animal y colóquelo a poca profundidad de dos milímetros en el canal auditivo. Finalmente, verifique al animal durante la prueba.
Si los resultados parecen anormales o ausentes, reposicione el transductor de sonido en el canal auditivo. Primero, abra el software para adquirir grabaciones ABR. Establezca los límites superior e inferior de rechazo del artefacto en aproximadamente 25 microvoltios, de modo que el animal, el movimiento o el ruido durante un barrido excluyan ese barrido del análisis.
Recopile al menos 1024 barridos para obtener una gran respuesta promediada que se puede hacer en dos grabaciones de 512 barridos cada una. Esto asegura que la respuesta sea evocada y repetible. En la configuración del amplificador del software, establezca la ganancia en 100, 000, el filtro de paso bajo en 3, 000 Hertz y el filtro de paso alto en 100 Hertz.
Establezca la tasa de presentación del estímulo entre 10 y 20 estímulos por segundo, y la duración del tiempo del estímulo de clic en 100 microsegundos. A continuación, establezca la frecuencia de muestreo en 40 kilohercios, 25 microsegundos para obtener los mejores datos de resolución y configure la polarización del estímulo en alternancia. Si registra 512 barridos, combine dos pruebas separadas para crear un promedio de barrido de 1, 024 y continúe registrando a intensidades cada vez más bajas hasta que el potencial evocado ya no se pueda identificar.
Reduzca la intensidad del estímulo mediante pasos de cinco decibelios de presión acústica para encontrar la intensidad de estímulo más baja que provoque una respuesta evocada. Defina el umbral ABR como la intensidad de estímulo más baja que provoca una respuesta evocada detectable. Después de la eutanasia y decapitación del animal y el experimento mediante la limpieza de la almohadilla térmica, la sonda rectal y los electrodos de cloruro de plata con toallitas de alcohol isopropílico al 70%, asegúrese de que se hayan guardado todos los rastros adquiridos.
Esta figura representa el clic ABR. La latencia máxima de la onda I aumentó en aproximadamente 0,3 milisegundos por cada disminución de 20 decibelios en la intensidad del estímulo. La onda I también presentó la mayor amplitud de pico y la variabilidad de latencia de pico más baja de todos los picos de forma de onda.
El gráfico muestra la ráfaga de tono evocada ABR. La mejor respuesta se vio en 1.000 Hertz. La figura demuestra que si no se mantiene la temperatura corporal, las funciones de intensidad de latencia del ABR son muy variables y, a menudo, inexactas.
La figura muestra que los APR registrados de crías de menos de tres horas de edad, etiquetados como P1, tienen latencias máximas significativamente prolongadas y amplitudes máximas reducidas en comparación con las crías más viejas, etiquetadas como P2. La figura compara las huellas de clic de nivel de presión acústica de 75 decibelios en el mismo animal con diferentes colocaciones de electrodos de referencia. La amplitud del pico de la onda II para la colocación mastoidea ocurrió un milisegundo después del pico de la onda II para la colocación del cuello. Esta diferencia de tiempo probablemente refleja los sitios de generación neuronal ABR en relación con la colocación del electrodo.
Las respuestas entre los dos oídos fueron similares con cambios menores en las amplitudes máximas probablemente debido al posicionamiento de los auriculares. La latencia de la oreja izquierda y la derecha que es equivalente apoya la función igualmente saludable de las orejas y los hemisferios del tronco encefálico en el pollo recién nacido. La colocación correcta del transductor de sonido puede distinguir entre buenos y ningún resultado.
El ABR de pollo debe ser robusto con una buena relación señal-ruido. Todas las preguntas abordadas por los estudios ABR en otras especies de aves se pueden aplicar al pollo. Además, la investigación en fisiología molecular en pollo embrionario puede incorporar esta metodología in vivo.
