Aquí demostramos cómo criar el Tetra Astyanax Mexicanus mexicano, criar las larvas y realizar inmunohistoquímica de montaje integral en peces post larvarios para comparar los fenotipos de los peces adaptados a ríos y cuevas. Criamos los peces a la misma densidad en una dieta rica en nutrientes de rotíferos. Esta técnica garantiza un crecimiento constante y proporciona ventajas en costo, bioseguridad y calidad del agua.
Para empezar, coloque una malla de plástico en la parte inferior de un tanque de cinco galones. A continuación, llene el tanque con agua lista para peces. Coloque un calentador de agua en el lateral del tanque.
Agregue una hembra y dos peces Astyanax Mexicanus macho que tienen más de un año de edad al tanque. Ajuste la temperatura del calentador de agua a 24 grados Celsius. Después de 24 horas, aumentar la temperatura en un grado Celsius.
Brilla una linterna en la parte inferior del tanque todos los días para buscar huevos. Una vez que los huevos se identifican en el tanque de cría, retire el pescado adulto y la malla de plástico. Utilice un vaso de precipitados para reducir la profundidad del agua a 10 cm.
Para estimar el tiempo de fertilización, utilice una pipeta de transferencia para colocar varios huevos en un plato de petri y verlos con un microscopio estéreo para determinar su etapa. Retire los huevos o heces opacos. A continuación, llene el tanque con agua lista para peces y agregue siete gotas de azul de metileno al agua.
Después de esto, agregue un calentador y un burbujeador de acuario al tanque. Ajuste el calentador a 24 grados Centígrados y ajuste el regulador de la corriente de aire para producir una corriente suave de burbujas. A continuación, cubra el tanque para mantener la temperatura del agua.
Agregue 20 gramos de sal a ocho litros de agua lista para el pescado y revuelva hasta que se disuelva. A continuación, agregue un litro de agua preparada a cada recipiente del vivero. A continuación, utilice una pipeta de transferencia para mover 20 de las larvas eclosionadas a cada contenedor de vivero.
Agitar el agua en el tanque más grande para asegurarse de que todas las larvas han sido eliminadas. Para preparar el alimento de pescado, añadir tres ml de mezcla de algas a un litro de rotíferos cosechados. Cinco días después de la fertilización añadir tres ml de los alimentos de pescado a cada recipiente de cría.
Los rotíferos deben ser visibles en grupos densos en la esquina de los contenedores a menos que sean visibles cerca del centro. Compruebe el recipiente en busca de rotíferos todos los días y agregue más alimentos si la concentración se agota. Retire las larvas muertas.
En primer lugar, para limpiar el tracto gastrointestinal del contenido de los alimentos, verter el recipiente del vivero con el pescado de la edad deseada a través de un colador de malla de nylon. Coloque el colador en un recipiente con agua limpia y retenga los alimentos durante 24 horas. Después de eutanasiar el pescado, de acuerdo con las directrices institucionales, utilice una pipeta de transferencia para transferir el pescado a un tubo cónico.
Sustituya la solución de eutanasia por fijación. E incubar el tubo con mecerse durante la noche a 4 grados centígrados. Después de esto, quite el fijador y reemplácelo por PBST.
Incubar el tubo durante otros 15 minutos con balanceo. Y repita el proceso de lavado una vez más. A continuación, utilice una pipeta de transferencia para mover el pescado a un vial de vidrio de cuatro ml con una tapa de tornillo superior.
Retire el PBST del vial y añada tres ml de solución de bloqueo. Incubar el vial a temperatura ambiente durante una hora con balanceo. Después de esto, utilice una pipeta de transferencia para eliminar la solución de bloqueo y reemplácela por anticuerpo primario diluido en la solución de bloqueo.
Incubar el vial durante la noche a temperatura ambiente con agitación. A continuación, lave el pescado con PBST tres veces, como se describió anteriormente. Sustituya el PBST por un anticuerpo secundario diluido en la solución de bloqueo.
E incubar el vial durante la noche a temperatura ambiente con agitación. Finalmente, lave el pescado tres veces durante 15 minutos con PBST. Usando este protocolo, los peces de superficie Tinaja, Molino y Los peces de la cueva Pachon fueron criados en tanques de cría estáticos.
La superficie y los desoves de Pachon, con embriones fertilizados, siempre produjeron larvas eclosionadas. Mientras que el Molino y Tinaja no tuvieron éxito algunas veces. En general, los peces de superficie produjeron el mayor número de larvas por desove, seguido de Pachon, Tinaja y Molino respectivamente.
La técnica de inmunostaining de montaje integral se utilizó con éxito para etiquetar las neuronas y las células pancreáticas en etapas de hasta 12,5 días después de la fertilización. Es importante eliminar cualquier pez muerto a medida que levantes las larvas y registres el número de peces supervivientes. Si muchos peces mueren puede ser debido a la contaminación bacteriana o fúngica.
Los tanques deben esterilizarse con 70% de etanol antes de su uso. La técnica de inmunosu manchación que describimos se ha utilizado con éxito para los anticuerpos enumerados en la tabla de materiales. Después de la inmunosuchación, los peces pueden ser montados enteros o seccionados para ver cualquier tejido de interés.
En combinación, el procedimiento de cría, eclosión e inmunosuchado proporciona un método sólido para evaluar la actividad génica NC2 de una manera comparable entre laboratorios.
