Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del microARN, proporcionando herramientas para detectar la relativa lcalización de moléculas de proteínas y microARN. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden detectar moléculas de proteínas y microARN de la misma sección tisular. Este protocolo comienza con una rehidratación de los tejidos montados en las diapositivas.
Caliente los portaobjetos a 60 grados centígrados durante 10 minutos en el horno de hibridación. La parafina debe derretirse visiblemente. A continuación, incubar los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio que contenga un agente de limpieza disponible comercialmente durante 10 minutos.
Haz esto dos veces. A continuación, transfiera los portaobjetos del lavado al lavado para rehidratar los tejidos. Una vez hidratados, incubar los tejidos en la solución de trabajo de proteinasa K a 37 grados Celsius durante 15 minutos.
Para eliminar la proteinasa K, lave los portaobjetos en 1x PBS dos veces. Ahora, arregla los tejidos. Primero, haz depósitos en los portaobjetos usando una pluma hidrófoba para dibujar un círculo repelente al agua alrededor de los preparativos.
A continuación, aplicar 500 microlitros de solución 4%PFA dentro de la barrera, e incubar los portaobjetos en una campana de humo. Para retirar el fijador, lave los portaobjetos en un frasco de Coplin que contenga PBS durante cinco minutos dos veces a temperatura ambiente. A continuación, lave los portaobjetos en 0,13 molares 1-Methylimidazol durante 10 minutos.
Haga esto en la campana de humo a temperatura ambiente, y realice este lavado dos veces. Agregue el fijador EDC e incubar a temperatura ambiente en una campana de humo durante una hora. Enjuague los portaobjetos con Tris de 50 mililitros.
Para prepararse para la hibridación, primero construya una cámara humidificada. Cargue dos trozos de filtro o papel tisú en la parte inferior de una caja y moje el papel con una mezcla uno a uno de formamida y 1x SSC. A continuación, aplique 200 microlitros de solución de hibridación precalentizada a cada tobogán e incubar la cámara humidificada de los portaobjetos durante una a tres horas a 50 grados centígrados.
Después de la incubación, reemplace la solución de hibridación con 250 microlitros de solución de sonda y cubra los portaobjetos con un resbalón de cubierta sin RNase. Trate de evitar atrapar burbujas de aire debajo del resbalón de la cubierta. Ahora, selle cuidadosamente la cámara con parafilm, e incubar los portaobjetos durante la noche a aproximadamente 30 grados Celsius por debajo de la temperatura de fusión del ARN de la sonda.
Es posible que se requiera una optimización. Además de establecer la temperatura de incubación correcta, diferentes microRNas se expresan en diferentes niveles, por lo que la optimización con respecto a la concentración de la sonda también puede ser necesaria para obtener la señal óptima. Después de la hibridación, realice los lavados de rigency.
En primer lugar, estuvo en 2x SSC a 50 grados Celsius durante cinco minutos, o hasta que la cubierta se afloja. A continuación, realice dos lavados en 2x SSC a temperatura ambiente, cada uno durante cinco minutos. Luego, continuando a temperatura ambiente, lave los portaobjetos durante cinco minutos en 0.2x SSC, seguido de cinco minutos en PBST, y finalmente, cinco minutos en 1x PBS.
En este punto, los híbridos ARN-ARN son estables, y las condiciones estrictas del ARN ya no son necesarias. Para la detección de anticuerpos DIG, primero, retoque las barreras hidrofóbicas y aplique 500 microlitros de solución de bloqueo durante treinta minutos. Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente en una cámara humidificada.
A continuación, retire la solución de bloqueo y sustitúyalo por 500 microlitros de solución de anticuerpos DIG. Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente en una cámara humidificada durante una hora. Luego, usando tarros Coplin, lave los portaobjetos tres veces en PBST durante cinco minutos por lavado.
A continuación, lave los portaobjetos en una solución de premanchas durante cinco minutos dos veces. A continuación, transfiera las diapositivas a un frasco de portaobjetos de polipropileno y agregue 20 mililitros de solución de sustrato AP. Ahora, incuba los toboganes a 37 grados Celsius durante seis a 24 horas, protegidos de la luz.
Cuando se utiliza por primera vez el sustrato AP, es importante seguir la reacción. En intervalos de dos horas, compruebe el desarrollo del color en las diapositivas con un microscopio, hasta que se haya determinado un tiempo de incubación óptimo. Para eliminar el exceso de sustrato AP, lave los portaobjetos dos veces en solución KTBT durante cinco minutos por lavado, seguido de un lavado en PBS durante cinco minutos.
Para detectar el anticuerpo cTNT, primero, bloquee los tejidos durante una hora. A continuación, aplique 200 microlitros de solución de anticuerpos cTNT e incubar los portaobjetos durante la noche a 4 grados centígrados en una cámara humidificada. Al día siguiente, lave los portaobjetos en un frasco de Coplin que contenga PBS durante cinco minutos.
Hazlo tres veces. A continuación, aplique 250 microlitros de solución de anticuerpos anti-conejo 568, e incubar los portaobjetos durante una hora a temperatura ambiente en una cámara humidificada. Para eliminar el exceso de anticuerpos secundarios, utilice tres lavados de cinco minutos en PBS.
A continuación, si lo desea, aplique 250 microlitros de solución de trabajo DAPI e incubar los portaobjetos durante un minuto, protegidos de la luz. Para eliminar el exceso de manchas DAPI, utilice dos lavados PBS de cinco minutos y, después de los lavados, monte los portaobjetos. La hibridación in situ de MicroRNA se optimizó en secciones del corazón del ratón utilizando un microARN revuelto para el control negativo, y un ARN U6 como control positivo.
La expresión cardiomiocitos específica de microRNA-182 se evaluó en secciones cardíacas de ratones de control y sobreexpresores de PlGF. Los ratones llevaban un transgén bajo un promotor alfa-MHC, y desarrollaron hipertrofia cardíaca, secundaria al aumento de la angiogénesis, dentro de las seis semanas de la activación del transgén. El protocolo de tinción reveló una mayor expresión de microRNA-182 en los corazones de ratones PlGF.
A continuación, para determinar qué tipos de células expresaron microRNA-182, se inmunotendieron las mismas secciones para cTNT. También se utilizó la tinción DAPI. Tanto en las secciones de control como en las secciones del corazón del ratón PlGF, el microRNA-182 se encontró en el compartimento nuclear de las células cardiomiocitos positivas cTNT.
Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo realizar la hibridación microRNAse, seguido de la inmunostaining de proteínas. Al intentar este procedimiento, es muy importante recordar mantener las condiciones libres de RNAse durante todo el primer día, durante todos los pasos que conducen a la hibridación de prop. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como Western blot en un PCR en tiempo real para responder preguntas como, ¿cuáles son los niveles de expresión relativa de este microRNA en particular en diferentes tejidos, o esta proteína en particular en la misma sección de tejido.
No olvide que trabajar con fijadores como PFA y ADC puede ser extremadamente peligroso. Las precauciones, incluya el uso de guantes y abrigos de laboratorio, así como el uso de campanas de humo, siempre deben tomarse al realizar este procedimiento.
