Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области микроРНК, предоставляя инструменты для обнаружения относительной икализации молекул белка и микроРНК. Основным преимуществом этой техники является то, что вы можете обнаружить как белок и молекулы микроРНК из той же части ткани. Этот протокол начинается с регидратации тканей, установленных на слайдах.
Разогрейте горки при температуре 60 градусов по Цельсию в течение 10 минут в духовке гибридизации. Парафин должен заметно таять. Затем инкубировать слайды в стеклянной банке Coplin, содержащей коммерчески доступный клиринговый агент в течение 10 минут.
Сделай это дважды. Затем перенесите слайды с мытья на стирку для регидратации тканей. После увлажнения, инкубировать ткани в proteinase K рабочий раствор при 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут.
Чтобы удалить протеиназу K, мыть слайды в 1x PBS два раза. Теперь почини ткани. Во-первых, сделать резервуары на слайдах с помощью гидрофобной ручкой, чтобы нарисовать водоотталкивающий круг вокруг препаратов.
Затем нанесите 500 микролитров раствора 4%PFA в пределах барьера и инкубировать горки в дымовой капот. Чтобы удалить фиксатор, мыть горки в банке Coplin содержащие PBS в течение пяти минут два раза при комнатной температуре. Затем промойте горки в 0,13 моляра 1-метилимидазола в течение 10 минут.
Сделайте это в дымовой капот при комнатной температуре, и выполнить эту стирку в два раза. Добавить EDC фиксации, и инкубировать при комнатной температуре в дым капот в течение одного часа. Смойте горки 50-миллимолярной трис.
Чтобы подготовиться к гибридизации, сначала постройте увлажненные камеры. Загрузите два куска фильтра или бумаги в нижней части коробки, и мокрой бумаги с один-к-одному смесь формамида и 1x SSC. Затем нанесите 200 микролитров предварительно разогретого раствора гибридизации на каждый слайд и инкубировать увлажненной камерой слайдов в течение одного-трех часов при 50 градусах Цельсия.
После инкубации замените раствор гибридизации на 250 микролитров раствора зонда и накройте слайды крышкой без RNase. Старайтесь избегать захвата пузырьков воздуха под крышкой скольжения. Теперь, тщательно запечатать камеру с парафильмом, и инкубировать слайды ночь примерно на 30 градусов по Цельсию ниже температуры плавления РНК зонда.
Может потребоваться оптимизация. В дополнение к установлению правильной температуры инкубации, различные микроРНК выражаются на разных уровнях, поэтому для достижения оптимального сигнала может потребоваться оптимизация концентрации зонда. После гибридизации, выполнить стренитность моет.
Во-первых, был в 2x SSC при 50 градусах по Цельсию в течение пяти минут, или до тех пор, пока крышка скользит ослабить. Затем выполните две стирки в 2x SSC при комнатной температуре, каждая в течение пяти минут. Затем, продолжая при комнатной температуре, мыть горки в течение пяти минут в 0,2x SSC, а затем пять минут в PBST, и, наконец, пять минут в 1x PBS.
На данный момент гибриды РНК-РНК стабильны, и условия, жесткие по РНК, больше не нужны. Для обнаружения антител DIG, во-первых, прикоснуться к гидрофобных барьеров, и применить 500 микролитров блокирующего раствора в течение тридцати минут. Инкубировать горки при комнатной температуре в увлажненной камере.
Затем удалите блокирующий раствор и замените его 500 микролитров раствора антител DIG. Инкубировать горки при комнатной температуре во влажной камере в течение часа. Затем, используя банки Coplin, мыть слайды три раза в PBST в течение пяти минут за стирку.
Затем дважды промойте слайды в растворе для предварительного окрашивания в течение пяти минут. Затем перенесите слайды в банку с полипропиленом слайд-почтальоном и добавьте 20 миллилитров субстратного раствора AP. Теперь инкубировать горки при 37 градусах по Цельсию в течение шести-24 часов, защищенных от света.
При первом использовании субстрата AP важно следить за реакцией. На двухчасовых интервалах проверьте развитие цвета на слайдах с помощью микроскопа, пока не будет определено оптимальное время инкубации. Чтобы удалить избыток субстрата AP, мыть горки дважды в растворе KTBT в течение пяти минут за стирку, а затем один мыть в PBS в течение пяти минут.
Чтобы обнаружить антитела cTNT, во-первых, блокировать ткани в течение часа. Затем нанесите 200 микролитров раствора антител cTNT и инкубировать горки на ночь при 4 градусах по Цельсию во влажной камере. На следующий день, мыть слайды в банке Коплин, содержащий PBS в течение пяти минут.
Сделай это три раза. Затем нанесите 250 микролитров анти-кролика 568 антитела раствора, и инкубировать слайды в течение часа при комнатной температуре в увлажненной камере. Чтобы вымыть избыток вторичного антитела, используйте три пятиминутных моет в PBS.
Затем, при желании, нанесите 250 микролитров рабочего решения DAPI и инкубировать горки на одну минуту, защищенные от света. Чтобы удалить избыток пятна DAPI, используйте две пятиминутные стирки PBS, а после стирки, смонтировать слайды. Гибридизация microRNA in-situ была оптимизирована на секциях сердца мыши с помощью скремблированной микроРНК для отрицательного контроля и SnRNA U6 в качестве положительного контроля.
Кардиомиоцит-специфическое выражение микроРНК-182 оценивалось в сердечных секциях от контроля и PlGF-переэкспрессии мышей. Мыши несли трансген PlGF под альфа-MHC промоутер, и разработали сердечной гипертрофии, вторичной по отношению к увеличению ангиогенеза, в течение шести недель трансгенной активации. Протокол окрашивания выявил повышенную экспрессию микроРНК-182 в сердцах мышей PlGF.
Далее, чтобы определить, какие типы клеток выражают микроРНК-182, те же участки были иммунотелены для CTNT. Также использовалось окрашивание DAPI. В обоих контрольных и PlGF мыши сердца разделов, микроРНК-182 был найден в ядерном отсеке CTNT-положительных клеток кардиомиоцитов.
После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как выполнить микроРНАЗ гибридизации, а затем белка иммуностимунизации. При попытке этой процедуры, очень важно помнить, чтобы сохранить RNAse свободных условиях в течение первого дня, во время всех шагов, ведущих к поддержке гибридизации. После этой процедуры, другие методы, такие как западная помарка в режиме реального времени ПЦР может быть выполнена, чтобы ответить на вопросы, как, каковы относительные уровни экспрессии этой конкретной микроРНК в различных тканях, или этот конкретный белок в той же части ткани.
Не забывайте, что работа с фиксаторами, такими как PFA и ADC, может быть чрезвычайно опасной. Меры предосторожности, в том числе носить перчатки и лабораторные пальто, а также с помощью дыма капюшоны, всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
