שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום microRNA, על ידי מתן כלים כדי לזהות את lcalization היחסי של מולקולות חלבון ומיקרו-רנ"א. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאתה יכול לזהות הן מולקולות חלבון microRNA מאותו קטע רקמה. פרוטוקול זה מתחיל בהידרציה מחדש של הרקמות המותקנות על החלקה.
מחממים את השקופיות ב 60 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות בתנור ההכלאה. הפרפין צריך להיות נמס בעליל. לאחר מכן, הדגירה את המגלשות בצנצנת קופלין זכוכית המכילה חומר ניקוי זמין מסחרית במשך 10 דקות.
תעשה את זה פעמיים. לאחר מכן, להעביר את השקופיות מן לשטוף לשטוף כדי rehydrate את הרקמות. לאחר הידראט, דגירה את הרקמות פרוטאינאז K פתרון עבודה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
כדי להסיר את proteinase K, לשטוף את השקופיות ב 1x PBS פעמיים. עכשיו, לתקן את הרקמות. ראשית, לעשות מאגרים על המגלשות באמצעות עט הידרופובי לצייר מעגל דוחה מים סביב ההכנות.
לאחר מכן, להחיל 500 microliters של פתרון 4%PFA בתוך המכשול, ו דגירה את השקופיות במכסה המנוע אדים. כדי להסיר את התיקון, לשטוף את השקופיות בצנצנת קופלין המכיל PBS במשך חמש דקות פעמיים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את השקופיות ב 0.13 טוחן 1-Methylimidazole במשך 10 דקות.
לעשות את זה במכסה המנוע אדים בטמפרטורת החדר, ולבצע לשטוף את זה פעמיים. מוסיפים את התיקון EDC, ו דגירה בטמפרטורת החדר במכסה המנוע אדים במשך שעה אחת. לשטוף את השקופיות עם טריס 50 מילימולר.
כדי להתכונן להכלאה, ראשית לבנות תא לח. לטעון שתי חתיכות של מסנן או נייר טישו לתוך החלק התחתון של קופסה, ולהרטיב את הנייר עם תערובת של אחד לאחד של formamide ו 1x SSC. לאחר מכן, להחיל 200 microliters של פתרון הכלאה מחומם מראש על כל שקופית, ולהדגיר את התא לח של שקופיות במשך שעה עד שלוש שעות ב 50 מעלות צלזיוס.
לאחר הדגירה, החלף את פתרון ההכלאה ב-250 מיקרוליטרים של פתרון בדיקה, וכסה את השקופיות בפתק כיסוי נטול RNase. נסו להימנע מלכידה של בועות אוויר מתחת לפתק הכיסוי. עכשיו, בזהירות לאטום את התא עם parafilm, ולהודגר את המגלשות לילה בכ 30 מעלות צלזיוס מתחת לטמפרטורת המסת RNA של החללית.
ייתכן שיהיה צורך במיטוב. בנוסף לקביעת טמפרטורת הדגירה הנכונה, microRNAs שונים באים לידי ביטוי ברמות שונות, ולכן אופטימיזציה לגבי ריכוז החללית עשויה להידרש גם כדי לקבל את האות האופטימלי. לאחר ההכלאה, בצע את שטיפות ההמחשה.
ראשית, היה ב 2x SSC ב 50 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, או עד הכיסוי מחליק להשתחרר. לאחר מכן, לבצע שתי שטיפות ב 2x SSC בטמפרטורת החדר, כל אחד במשך חמש דקות. לאחר מכן, ממשיך בטמפרטורת החדר, לשטוף את השקופיות במשך חמש דקות ב 0.2x SSC, ואחריו חמש דקות PBST, ולבסוף, חמש דקות ב 1x PBS.
בשלב זה, היברידיות RNA-RNA יציבים, ותנאים מחמירים RNA כבר לא נחוצים. לגילוי נוגדנים DIG, ראשית, לגעת במחסומים הידרופוביים, ולהחיל 500 microliters של פתרון חסימה במשך שלושים דקות. הדגירה את המגלשות בטמפרטורת החדר בתא לח.
לאחר מכן, הסר את פתרון החסימה והחלף אותו ב-500 מיקרוליטרים של פתרון נוגדני DIG. הדגירה את המגלשות בטמפרטורת החדר בתא לח במשך שעה. לאחר מכן, באמצעות צנצנות קופלין, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBST במשך חמש דקות לכל לשטוף.
לאחר מכן, לשטוף את השקופיות בתתכנון מכתים מראש במשך חמש דקות פעמיים. לאחר מכן, העבר את השקופיות לצנצנת דיוור שקופיות פוליפרופילן, והוסף 20 מיליליטר של פתרון מצע AP. עכשיו, הדגירה את המגלשות ב37 מעלות צלזיוס במשך שש עד 24 שעות, מוגן מפני האור.
בעת השימוש הראשון במצע AP, חשוב לעקוב אחר התגובה. במרווחי זמן של שעתיים, בדוק את התפתחות הצבע בשקופיות באמצעות מיקרוסקופ, עד שנקבע זמן דגירה אופטימלי. כדי להסיר את מצע AP עודף, לשטוף את השקופיות פעמיים בפתרון KTBT במשך חמש דקות לכל לשטוף, ואחריו לשטוף אחד PBS במשך חמש דקות.
כדי לזהות את הנוגדן cTNT, הראשון, לחסום את הרקמות במשך שעה. לאחר מכן, להחיל 200 microliters של פתרון נוגדן cTNT, ולהדגיר את המגלשות לילה ב 4 מעלות צלזיוס בתא לח. למחרת, לשטוף את השקופיות בצנצנת קופלין המכיל PBS במשך חמש דקות.
תעשה את זה שלוש פעמים. לאחר מכן, להחיל 250 microliters של פתרון נוגדנים נגד ארנב 568, ולהדגיר את המגלשות במשך שעה בטמפרטורת החדר בתא לח. כדי לשטוף את הנוגדן המשני העודף, השתמש בשלושה שטיפות של חמש דקות ב- PBS.
לאחר מכן, אם תרצה, להחיל 250 microliters של פתרון עבודה DAPI, ולהדק את השקופיות במשך דקה אחת, מוגן מפני אור. כדי להסיר את כתם ה- DAPI העודף, השתמש בשתי שטיפות PBS של חמש דקות ולאחר השטיפה, תן את השקופיות. ההכלאה MicroRNA in-situ היה אופטימיזציה על חלקי לב העכבר באמצעות microRNA מקושקשות לשליטה שלילית, ו U6 snRNA כשליטה חיובית.
ביטוי ספציפי לקרדיומיוציט של microRNA-182 הוערך בחלקי לב משליטה ועכברים בדיכוי יתר של PlGF. העכברים נשאו טרנסג'נדר PlGF תחת מקדם אלפא-MHC, ופיתחו היפרטרופיה לבבית, משנית לאנגיוגנזה מוגברת, תוך שישה שבועות מהפעלת הטרנסג'ין. פרוטוקול הכתמים חשף ביטוי מוגבר של microRNA-182 בליבם של עכברי PlGF.
לאחר מכן, כדי לקבוע אילו סוגי תאים מבוטאים microRNA-182, אותם חלקים היו immunostained עבור cTNT. נעשה שימוש גם בכתמי DAPI. הן בבקרה והן בקטעי לב עכבר PlGF, microRNA-182 נמצא בתא הגרעיני של תאי קרדיומיוציט חיוביים cTNT.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך לבצע הכלאה microRNAse, ואחריו immunostaining חלבון. בעת ניסיון הליך זה, חשוב מאוד לזכור לשמור על תנאים ללא RNAse לאורך כל היום הראשון, במהלך כל השלבים המובילים כדי לתמוך הכלאה. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו כתם מערבי PCR בזמן אמת ניתן לבצע כדי לענות על שאלות כמו, מהן רמות הביטוי היחסי של microRNA מסוים זה ברקמות שונות, או חלבון מסוים זה באותו סעיף רקמות.
אל תשכח כי עבודה עם fixatives כגון PFA ו- ADC יכול להיות מסוכן מאוד. אמצעי זהירות, כולל ללבוש כפפות חלוקי מעבדה, כמו גם באמצעות ברדסים אדים, תמיד צריך להינקט בעת ביצוע הליך זה.
