이 방법은 단백질과 microRNA 분자 모두의 상대적 lcalization을 검출하는 도구를 제공함으로써 microRNA 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 동일한 조직 섹션에서 단백질과 microRNA 분자를 모두 검출할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜은 슬라이드 장착 조직의 재수화로 시작됩니다.
하이브리드화 오븐에서 슬라이드를 섭씨 60도에서 10분간 데우십시오. 파라핀은 눈에 띄게 녹아야 합니다. 그런 다음, 10 분 동안 시판 가능한 클리어링 에이전트를 포함하는 유리 코플린 항아리에 슬라이드를 배양.
두 번 이 작업을 수행합니다. 다음으로 슬라이드를 세척에서 세척으로 옮겨 조직을 수화합니다. 수분을 공급하면 단백질AE K 작업 용액의 조직을 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다.
단백질제 K를 제거하려면 슬라이드를 1x PBS로 두 번 세척합니다. 지금, 조직을 해결합니다. 첫째, 소수성 펜을 사용하여 슬라이드에 있는 저수지를 만들어 준비 주위에 발수 원을 그립니다.
다음으로, 장벽 내에 4%PFA 용액의 500마이크로리터를 적용하고 슬라이드를 연기 후드에 배양합니다. 고정을 제거하려면 실온에서 PBS가 들어있는 코플린 항아리에서 슬라이드를 실온에서 2 회 2 회 2 회 세척하십시오. 다음으로, 0.13 어금니 1-메틸리미다졸레로 슬라이드를 10분간 세척합니다.
실온에서 연기 후드에이 작업을 수행하고, 두 번 세척을 수행합니다. EDC 고정을 추가하고 연기 후드의 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오. 50 밀리머 트리스와 함께 슬라이드를 헹구십시오.
혼성화를 준비하기 위해 먼저 가습 챔버를 구축하십시오. 두 개의 필터 또는 티슈 페이퍼를 상자 바닥에 적재하고 포름아미데와 1x SSC의 일대일 혼합물로 종이를 적십니다. 다음으로, 각 슬라이드에 미리 따뜻워진 혼성화 용액 200마이크로리터를 적용하고, 50°C에서 1~3시간 동안 슬라이드의 가습 챔버를 배양한다.
인큐베이션 후 하이브리드화 솔루션을 250마이크로리터의 프로브 솔루션으로 교체하고 슬라이드를 RNase 프리 커버 슬립으로 덮습니다. 커버 슬립 아래에 기포가 포획되지 않도록 하십시오. 이제 파라필름으로 챔버를 조심스럽게 밀봉하고 프로브의 RNA 용융 온도 보다 약 섭씨 약 30도에서 밤새 슬라이드를 배양합니다.
최적화가 필요할 수 있습니다. 올바른 인큐베이션 온도를 설정하는 것 외에도 상이한 microRNA가 상이한 수준으로 표현되므로 프로브 농도에 대한 최적화도 최적의 신호를 얻기 위해 필요할 수 있습니다. 혼성화 에 따라 문자열 세차를 수행합니다.
첫째, 5 분 동안 섭씨 50도에서 2 x SSC에 있었고, 덮개가 느슨해질 때까지. 그런 다음 실온에서 2x SSC로 2개의 세척을 5분 동안 수행합니다. 그런 다음 실온에서 계속하여 0.2x SSC에서 5분 동안 슬라이드를 세척하고 PBST에서 5분, 마지막으로 1x PBS에서 5분 동안 세척합니다.
이 시점에서 RNA-RNA 하이브리드는 안정적이며 RNA-엄격한 조건이 더 이상 필요하지 않습니다. DIG 항체 검출을 위해 먼저 소수성 장벽을 터치하고 30 분 동안 블로킹 용액 500 마이크로 리터를 적용하십시오. 가습 챔버에서 실온에서 슬라이드를 배양합니다.
다음으로, 차단 용액을 제거하고 DIG 항체 용액의 500 마이크로리터로 대체하십시오. 1 시간 동안 가습 챔버에서 실온에서 슬라이드를 배양. 그런 다음 코플린 항아리를 사용하여 PBST에서 슬라이드를 세 번 씻고 세척 당 5 분 동안 씻습니다.
다음으로 슬라이드를 스테인딩 용액으로 두 번 5분간 세척합니다. 그런 다음 슬라이드를 폴리프로필렌 슬라이드 메일러 jar로 옮기고 AP 기판 용액20 밀리리터를 추가합니다. 이제 슬라이드를 섭씨 37도에서 6~24시간 동안 배양하여 빛으로부터 보호합니다.
먼저 AP 기판을 사용하는 경우 반응을 따르는 것이 중요합니다. 2시간 간격으로 최적의 잠복기가 결정될 때까지 현미경을 사용하여 슬라이드의 색상 개발을 확인하십시오. 초과 AP 기판을 제거하려면 KTBT 용액에서 슬라이드를 세척당 5분 동안 두 번 세척한 다음 PBS에서 5분간 세척합니다.
cTNT 항체를 검출하기 위해 먼저 조직을 한 시간 동안 차단한다. 그런 다음, cTNT 항체 용액의 200 마이크로리터를 적용하고, 가습 챔버에서 섭씨 4도에서 밤새 슬라이드를 배양한다. 다음 날, 5 분 동안 PBS가 들어있는 코플린 항아리에 슬라이드를 씻으십시오.
세 번 이 작업을 수행합니다. 이어서, 250마이크로리터의 항토끼 568 항체 용액을 적용하고, 가습챔버에서 실온에서 1시간 동안 슬라이드를 배양한다. 과잉 이차 항체를 씻어 내려면 PBS에서 3 개의 5 분 세척을 사용하십시오.
그런 다음 원하는 경우 DAPI 작업 솔루션 250 마이크로리터를 적용하고 슬라이드를 1분 동안 인큐베이션하여 빛으로부터 보호합니다. 과도한 DAPI 얼룩을 제거하려면 5분 PBS 세서히 2개를 사용하고 세동 후 슬라이드를 장착합니다. microRNA 인-시투 혼성화는 음성 제어를 위한 스크램블 마이크로RNA를 사용하여 마우스 심장 단면도에 최적화되었고, U6 snRNA는 양성 대조군으로서 최적화되었다.
microRNA-182의 심근 세포 특이적 발현은 대조군 및 PlGF 과잉 발현 마우스로부터 심장 섹션에서 평가되었다. 마우스는 알파-MHC 프로모터의 밑에 PlGF 전염유전자를 운반하고, 심장 비대, 증가한 혈관신생에 이차, 간질 활성화의 6 주 안에 개발했습니다. 염색 프로토콜은 PlGF 마우스의 심혼에 있는 microRNA-182의 증가한 발현을 밝혔습니다.
다음으로, 어떤 세포 유형이 microRNA-182를 발현했는지 를 결정하기 위해, 동일한 섹션은 cTNT를 위해 면역염색되었다. DAPI 염색도 사용되었습니다. 대조군과 PlGF 마우스 심장 단면 모두에서, microRNA-182는 cTNT 양성 심근세포 세포의 핵 구획에서 발견되었다.
이 비디오를 시청한 후, 당신은 단백질 면역 염색 다음에 microRNAse 혼성화를 수행하는 방법에 대한 좋은 이해가 있어야합니다. 이 절차를 시도하는 동안, 소품 혼성화로 이어지는 모든 단계 동안 하루 종일 RNAse가없는 조건을 유지하는 것을 기억하는 것이 매우 중요합니다. 이 절차에 따라, 실시간 PCR에서 서양 블롯과 같은 다른 방법은 다른 조직에서 이 특정 microRNA의 상대적 발현 수준은 무엇이거나, 또는 동일한 조직 섹션에서 이 특정 단백질과 같은 질문에 대답하기 위하여 수행될 수 있다.
PFA 및 ADC와 같은 고정 물질로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행할 때는 장갑과 실험실 코트 착용뿐만 아니라 연기 후드를 사용하는 것이 포함됩니다.
