Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo dei microRNA, fornendo strumenti per rilevare la relativa lcalizzazione delle molecole di proteine e microRNA. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile rilevare molecole di proteine e microRNA dalla stessa sezione tissutale. Questo protocollo inizia con una reidratazione dei tessuti montati sul vetrino.
Riscaldare gli scivoli a 60 gradi Celsius per 10 minuti nel forno di ibridazione. La paraffina dovrebbe sciogliersi visibilmente. Quindi, incubare le diapositive in un barattolo di coplin di vetro contenente agente di compensazione disponibile in commercio per 10 minuti.
Fallo due volte. Successivamente, trasferire le diapositive dal lavaggio al lavaggio per reidratare i tessuti. Una volta idratato, incubare i tessuti nella soluzione di lavoro proteinasi K a 37 gradi Celsius per 15 minuti.
Per rimuovere la proteinasi K, lavare le diapositive in 1x PBS due volte. Ora, aggiusta i tessuti. In primo luogo, creare serbatoi sugli scivoli usando una penna idrofobica per disegnare un cerchio idrorepellente intorno ai preparati.
Successivamente, applicare 500 microlitri di soluzione di PFA al 4% all'interno della barriera e incubare i vetrini in una cappa aspirante. Per rimuovere il fissatore, lavare le diapositive in un barattolo coplin contenente PBS per cinque minuti due volte a temperatura ambiente. Quindi, lavare gli scivoli in 0,13 molare 1-metillimidazolo per 10 minuti.
Fare questo nella cappa dei fumi a temperatura ambiente ed eseguire questo lavaggio due volte. Aggiungere il fissatore EDC e incubare a temperatura ambiente in una cappa aspirante per un'ora. Risciacquare le diapositive con Tris da 50 millimolare.
Per prepararsi all'ibridazione, costruire prima una camera umidificata. Caricare due pezzi di filtro o carta velina nella parte inferiore di una scatola e bagnare la carta con una miscela uno-a-uno di formamide e 1x SSC. Successivamente, applicare 200 microlitri di soluzione di ibridazione preri warmed su ogni diapositiva e incubare la camera umidificata dei vetrini per una o tre ore a 50 gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, sostituire la soluzione di ibridazione con 250 microlitri di soluzione di sonda e coprire le diapositive con uno slittamento di copertura privo di RNasi. Cerca di evitare di intrappolare bolle d'aria sotto lo scivolo di copertura. Ora, sigillare attentamente la camera con il parafilm e incubare le diapositive durante la notte a circa 30 gradi Celsius al di sotto della temperatura di fusione dell'RNA della sonda.
Potrebbe essere necessaria l'ottimizzazione. Oltre a impostare la giusta temperatura di incubazione, vengono espresse diverse microRNA a diversi livelli, quindi può anche essere necessaria un'ottimizzazione per quanto riguarda la concentrazione della sonda per ottenere il segnale ottimale. Dopo l'ibridazione, eseguire i lavaggi di rigore.
In primo luogo, è stato in 2x SSC a 50 gradi Celsius per cinque minuti, o fino a quando il coperchio scivola allentato. Quindi, eseguire due lavaggi in 2x SSC a temperatura ambiente, ciascuno per cinque minuti. Quindi, continuando a temperatura ambiente, lavare le diapositive per cinque minuti in 0,2x SSC, seguito da cinque minuti in PBST e, infine, cinque minuti in 1x PBS.
A questo punto, gli ibridi RNA-RNA sono stabili e non sono più necessarie condizioni rigorose per l'RNA. Per il rilevamento degli anticorpi DIG, in primo luogo, ritoccare le barriere idrofobiche e applicare 500 microlitri di soluzione di blocco per trenta minuti. Incubare i vetrini a temperatura ambiente in una camera umidificata.
Quindi, rimuovere la soluzione di blocco e sostituirla con 500 microlitri di soluzione anticorpale DIG. Incubare gli scivoli a temperatura ambiente in una camera umidificata per un'ora. Quindi, utilizzando i barattoli Coplin, lavare gli scivoli tre volte in PBST per cinque minuti per lavaggio.
Quindi, lavare gli scivoli in soluzione di pre-colorazione per cinque minuti due volte. Quindi, trasferire le diapositive in un barattolo di mailer per diapositive in polipropilene e aggiungere 20 millilitri di soluzione di substrato AP. Ora, incubare le diapositive a 37 gradi Celsius per sei-24 ore, protette dalla luce.
Quando si utilizza per la prima volta il substrato AP, è importante seguire la reazione. A intervalli di due ore, controllare lo sviluppo del colore sulle diapositive utilizzando un microscopio, fino a quando non è stato determinato un tempo di incubazione ottimale. Per rimuovere il substrato AP in eccesso, lavare le diapositive due volte in soluzione KTBT per cinque minuti per lavaggio, seguito da un lavaggio in PBS per cinque minuti.
Per rilevare l'anticorpo cTNT, in primo luogo, bloccare i tessuti per un'ora. Quindi, applicare 200 microlitri di soluzione anticorpale cTNT e incubare i vetrini durante la notte a 4 gradi Celsius in una camera umidificata. Il giorno dopo, lavare gli scivoli in un barattolo coplin contenente PBS per cinque minuti.
Fallo tre volte. Quindi, applicare 250 microlitri di soluzione anticorpale anti-coniglio 568 e incubare i vetrini per un'ora a temperatura ambiente in una camera umidificata. Per lavare l'anticorpo secondario in eccesso, utilizzare tre lavaggi di cinque minuti in PBS.
Quindi, se lo si desidera, applicare 250 microlitri di soluzione di lavoro DAPI e incubare le diapositive per un minuto, protette dalla luce. Per rimuovere la macchia DAPI in eccesso, utilizzare due lavaggi PBS di cinque minuti e, dopo i lavaggi, montare le diapositive. L'ibridazione microRNA in situ è stata ottimizzata sulle sezioni cardiache del mouse utilizzando un microRNA strapazzato per il controllo negativo e uno snRNA U6 come controllo positivo.
L'espressione cardiomiocita-specifica del microRNA-182 è stata valutata in sezioni cardiache dal controllo e topi sovraespressivi plGF. I topi trasportavano un transgene PlGF sotto un promotore alfa-MHC, e svilupparono ipertrofia cardiaca, secondaria all'aumento dell'angiogenesi, entro sei settimane dall'attivazione del transgene. Il protocollo di colorazione ha rivelato una maggiore espressione di microRNA-182 nel cuore dei topi PlGF.
Successivamente, per determinare quali tipi di cellule espresse microRNA-182, le stesse sezioni sono state immunostained per cTNT. È stata utilizzata anche la colorazione DAPI. Sia nelle sezioni del cuore del topo di controllo che in quello plGF, il microRNA-182 è stato trovato nel compartimento nucleare delle cellule cardiomiociti cTNT-positive.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'ibridazione microRNAse, seguita dall'immunosottenzione proteica. Durante il tentativo di questa procedura, è molto importante ricordare di mantenere le condizioni senza RNAse per tutto il primo giorno, durante tutti i passaggi che portano all'ibridazione di prop. Seguendo questa procedura, altri metodi come western blot in una PCR in tempo reale possono essere eseguiti per rispondere a domande come, quali sono i livelli di espressione relativa di questo particolare microRNA in diversi tessuti, o questa particolare proteina nella stessa sezione tissutale.
Non dimenticare che lavorare con fissivi come PFA e ADC può essere estremamente pericoloso. Le precauzioni, tra cui indossare guanti e cappotti da laboratorio, nonché l'uso di cappe aspiranti, devono sempre essere prese quando si esegue questa procedura.
