Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im bereichmicroRNA zu beantworten, indem sie Werkzeuge bereitstellt, um die relative Lcalisierung von Protein- und MicroRNA-Molekülen zu erkennen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass Sie sowohl Protein- als auch MicroRNA-Moleküle aus demselben Gewebeabschnitt erkennen können. Dieses Protokoll beginnt mit einer Rehydrierung des auf Dergleit montierten Gewebes.
Die Dias bei 60 Grad Celsius 10 Minuten im Hybridisierungsofen erwärmen. Das Paraffin sollte sichtbar schmelzen. Dann inkubieren Sie die Dias in einem Glas Coplin Glas mit handelsüblichen Clearing-Agent für 10 Minuten.
Tun Sie dies zweimal. Als nächstes übertragen Sie die Rutschen von waschen zu waschen, um das Gewebe zu rehydrieren. Nach der Hydratisierung die Gewebe in Proteinase K Arbeitslösung bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten inkubieren.
Um die Proteinase K zu entfernen, waschen Sie die Dias in 1x PBS zweimal. Beheben Sie nun das Gewebe. Machen Sie zunächst Reservoirs auf den Rutschen mit einem hydrophoben Stift, um einen wasserabweisenden Kreis um die Präparate zu ziehen.
Als nächstes 500 Mikroliter 4%PFA Lösung innerhalb der Barriere auftragen und die Dias in einer Dunstabzugshaube inkubieren. Um das Fixativ zu entfernen, waschen Sie die Dias in einem Coplin-Glas, das PBS enthält, zwei Minuten lang zwei Mal bei Raumtemperatur. Als nächstes waschen Sie die Dias in 0,13 molarem 1-Methylimidazol für 10 Minuten.
Tun Sie dies in der Dunstabzugshaube bei Raumtemperatur, und führen Sie diese Wäsche zweimal durch. Fügen Sie das EDC Fixativ hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur eine Stunde lang in einer Dunstabzugshaube. Spülen Sie die Dias mit 50-Millimolar Tris ab.
Um sich auf die Hybridisierung vorzubereiten, bauen Sie zunächst eine befeuchtete Kammer. Zwei Teile Filter- oder Tissuepapier in den Boden einer Schachtel geben und das Papier mit einer Eins-zu-Eins-Mischung aus Formamid und 1x SSC befeuchten. Als nächstes 200 Mikroliter vorgewärmter Hybridisierungslösung auf jeden Schlitten auftragen und die befeuchtete Rutschkammer für ein bis drei Stunden bei 50 Grad Celsius inkubieren.
Ersetzen Sie nach der Inkubation die Hybridisierungslösung durch 250 Mikroliter Sondenlösung und bedecken Sie die Dias mit einem RNase-freien Abdeckungsschlupf. Versuchen Sie, Luftblasen unter dem Deckelschlupf zu vermeiden. Nun die Kammer vorsichtig mit Parafilm versiegeln und die Dias über Nacht bei etwa 30 Grad Celsius unter der RNA-Schmelztemperatur der Sonde bebrüten.
Möglicherweise ist eine Optimierung erforderlich. Neben der Einstellung der richtigen Inkubationstemperatur werden verschiedene microRNAs auf unterschiedlichen Ebenen ausgedrückt, so dass auch eine Optimierung der Sondenkonzentration erforderlich sein kann, um das optimale Signal zu erhalten. Führen Sie nach der Hybridisierung die Stringenz-Wähvorgänge aus.
Zuerst war in 2x SSC bei 50 Grad Celsius für fünf Minuten, oder bis die Abdeckung rutscht lockern. Führen Sie dann zwei Wässer in 2x SSC bei Raumtemperatur, jeweils für fünf Minuten. Dann, weiter bei Raumtemperatur, waschen Sie die Rutschen für fünf Minuten in 0.2x SSC, gefolgt von fünf Minuten in PBST, und schließlich, fünf Minuten in 1x PBS.
Zu diesem Zeitpunkt sind die RNA-RNA-Hybriden stabil, und RNA-strenge Bedingungen werden nicht mehr benötigt. Für die DIG-Antikörperdetektion können Sie zunächst die hydrophoben Barrieren hochgreifen und 30 Minuten lang 500 Mikroliter Blockierlösung anwenden. Inkubieren Sie die Dias bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer.
Entfernen Sie als Nächstes die Blockierlösung und ersetzen Sie sie durch 500 Mikroliter DIG-Antikörperlösung. Inkubieren Sie die Dias bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer für eine Stunde. Dann, mit Coplin Gläser, waschen Sie die Dias dreimal in PBST für fünf Minuten pro Wäsche.
Als nächstes waschen Sie die Dias zweimal in Vorfärbelösung für fünf Minuten. Übertragen Sie dann die Dias in ein Polypropylen-Dia-Mailer-Glas, und fügen Sie 20 Milliliter AP-Substratlösung hinzu. Jetzt inkubieren Sie die Rutschen bei 37 Grad Celsius für sechs bis 24 Stunden, vor dem Licht geschützt.
Bei der ersten Verwendung von AP-Substrat ist es wichtig, der Reaktion zu folgen. Überprüfen Sie in Zwei-Stunden-Intervallen die Farbentwicklung auf den Dias mit einem Mikroskop, bis eine optimale Inkubationszeit bestimmt ist. Um das überschüssige AP-Substrat zu entfernen, waschen Sie die Dias zweimal in KTBT-Lösung für fünf Minuten pro Wäsche, gefolgt von einer Wäsche in PBS für fünf Minuten.
Um den cTNT-Antikörper zu erkennen, blockieren Sie zunächst das Gewebe für eine Stunde. Dann 200 Mikroliter cTNT-Antikörperlösung auftragen und die Dias über Nacht bei 4 Grad Celsius in einer befeuchteten Kammer bebrüten. Am nächsten Tag die Dias in einem Coplin-Glas mit PBS für fünf Minuten waschen.
Tun Sie dies dreimal. Dann 250 Mikroliter Anti-Kaninchen 568 Antikörperlösung auftragen und die Dias eine Stunde bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer bebrüten. Um den überschüssigen Sekundärantikörper auszuwaschen, verwenden Sie drei fünfminütige Wähschüsse in PBS.
Dann, wenn gewünscht, 250 Mikroliter DAPI-Arbeitslösung anwenden und die Dias für eine Minute inkubieren, vor Licht geschützt. Um den überschüssigen DAPI-Fleck zu entfernen, verwenden Sie zwei fünfminütige PBS-Wärungen, und montieren Sie nach dem Einheben der Folien die Folien. Die MicroRNA-In-situ-Hybridisierung wurde für Mausherzabschnitte optimiert, indem eine gewürfelte microRNA für negative Kontrolle und eine U6 snRNA als positive Kontrolle verwendet wurden.
Die Kardiomyozyten-spezifische Expression von microRNA-182 wurde in Herzabschnitten von Kontroll- und PlGF-überexzierenden Mäusen untersucht. Die Mäuse trugen ein PlGF-Transgen unter einem Alpha-MHC-Promotor und entwickelten eine Kardialhypertrophie, sekundär zur erhöhten Angiogenese, innerhalb von sechs Wochen nach der Transgenaktivierung. Das Färbeprotokoll zeigte eine erhöhte Expression von microRNA-182 in den Herzen von PlGF-Mäusen.
Um zu bestimmen, welche Zelltypen microRNA-182 exprimierten, wurden dieselben Abschnitte für cTNT immunstainiert. DAPI-Färbung wurde ebenfalls verwendet. Sowohl in Kontroll- als auch in PlGF-Mausherzabschnitten wurde microRNA-182 im Kernraum von cTNT-positiven Kardiomyozytenzellen gefunden.
Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine MikroRNAse-Hybridisierung durchführen können, gefolgt von Protein-Immunostaining. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es sehr wichtig, daran zu denken, RNAse-freie Bedingungen während aller Schritte, die zur Prop-Hybridisierung führen, den ersten Tag über zu behalten. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Western Blot in einer Echtzeit-PCR durchgeführt werden, um Fragen wie, was sind die relativen Expressionsniveaus dieser bestimmten microRNA in verschiedenen Geweben, oder dieses besondere Protein in der gleichen Gewebeabschnitt zu beantworten.
Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Fixativen wie PFA und ADC extrem gefährlich sein kann. Vorsichtsmaßnahmen, einschließlich des Tragens von Handschuhen und Labormänteln sowie der Verwendung von Dunstabzugshauben, sollten immer bei der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.
