Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo do microRNA, fornecendo ferramentas para detectar a lcalização relativa de moléculas de proteína e microRNA. A principal vantagem desta técnica é que você pode detectar moléculas de proteína e microRNA da mesma seção tecidual. Este protocolo começa com uma reidratação dos tecidos montados em slides.
Aqueça os slides a 60 graus Celsius por 10 minutos no forno de hibridização. A parafina deve estar visivelmente derretendo. Em seguida, incubar os slides em um frasco de vidro Coplin contendo agente de compensação comercialmente disponível por 10 minutos.
Faça isso duas vezes. Em seguida, transfira os slides da lavagem para lavar para reidratar os tecidos. Uma vez hidratado, incubar os tecidos na solução de trabalho proteinase K a 37 graus Celsius por 15 minutos.
Para remover a proteína K, lave os slides em 1x PBS duas vezes. Agora, conserte os tecidos. Primeiro, faça reservatórios nos slides usando uma caneta hidrofóbica para desenhar um círculo repelente de água em torno dos preparativos.
Em seguida, aplique 500 microliters de solução 4%PFA dentro da barreira, e incubar os slides em um capô de fumaça. Para remover o fixador, lave os slides em um frasco de Coplin contendo PBS por cinco minutos duas vezes à temperatura ambiente. Em seguida, lave os slides em 0,13 molar 1-Metilimidazol por 10 minutos.
Faça isso no capô da fumaça à temperatura ambiente, e faça esta lavagem duas vezes. Adicione o EDC fixativo e incubar à temperatura ambiente em um capô de fumaça por uma hora. Enxágüe os slides com tris de 50 mililitros.
Para se preparar para a hibridização, primeiro construa uma câmara umidificada. Carregue dois pedaços de filtro ou papel de tecido na parte inferior de uma caixa, e molhe o papel com uma mistura de formamida e 1x SSC. Em seguida, aplique 200 microliters de solução de hibridização pré-aquecida em cada slide, e incubar a câmara umidificada de slides por uma a três horas a 50 graus Celsius.
Após a incubação, substitua a solução de hibridização por 250 microliters de solução de sonda e cubra os slides com um deslizamento de cobertura sem RNase. Tente evitar prender bolhas de ar sob o deslizamento de cobertura. Agora, sele cuidadosamente a câmara com parafilm, e incubar os slides durante a noite a aproximadamente 30 graus Celsius abaixo da temperatura de fusão do RNA da sonda.
Pode ser necessária otimização. Além de definir a temperatura de incubação certa, diferentes microRNAs são expressas em diferentes níveis, de modo que a otimização em relação à concentração da sonda também pode ser necessária para obter o sinal ideal. Após a hibridização, realize as lavagens de stringency.
Primeiro, estava em 2x SSC a 50 graus Celsius por cinco minutos, ou até que a tampa deslize. Em seguida, execute duas lavagens em 2x SSC em temperatura ambiente, cada uma por cinco minutos. Em seguida, continuando em temperatura ambiente, lave os slides por cinco minutos em 0,2x SSC, seguido de cinco minutos em PBST e, finalmente, cinco minutos em 1x PBS.
Neste ponto, os híbridos RNA-RNA são estáveis, e as condições rigorosas do RNA não são mais necessárias. Para detecção de anticorpos DIG, primeiro, retoque as barreiras hidrofóbicas e aplique 500 microliters de solução de bloqueio por trinta minutos. Incubar os slides à temperatura ambiente em uma câmara umidificada.
Em seguida, remova a solução de bloqueio e substitua-a por 500 microliters da solução de anticorpos DIG. Incubar os slides à temperatura ambiente em uma câmara umidificada por uma hora. Em seguida, usando frascos Coplin, lave os slides três vezes no PBST por cinco minutos por lavagem.
Em seguida, lave os slides em solução de pré-coloração por cinco minutos duas vezes. Em seguida, transfira os slides para um frasco de mailer de slides de polipropileno e adicione 20 mililitros de solução de substrato AP. Agora, incubar os slides a 37 graus Celsius por seis a 24 horas, protegidos da luz.
Ao usar pela primeira vez o substrato AP, é importante acompanhar a reação. Em intervalos de duas horas, verifique o desenvolvimento de cores nos slides usando um microscópio, até que um tempo ideal de incubação tenha sido determinado. Para remover o excesso de substrato AP, lave os slides duas vezes na solução KTBT por cinco minutos por lavagem, seguido de uma lavagem em PBS por cinco minutos.
Para detectar o anticorpo cTNT, primeiro, bloqueie os tecidos por uma hora. Em seguida, aplique 200 microliters de solução de anticorpos cTNT e incubar os slides durante a noite a 4 graus Celsius em uma câmara umidificada. No dia seguinte, lave os slides em um frasco de Coplin contendo PBS por cinco minutos.
Faça isso três vezes. Em seguida, aplique 250 microliters de solução de anticorpos anti-coelho 568, e incubar os slides por uma hora à temperatura ambiente em uma câmara umidificada. Para lavar o excesso de anticorpo secundário, use três lavagens de cinco minutos em PBS.
Em seguida, se desejar, aplique 250 microliters de solução de trabalho DAPI e incubar os slides por um minuto, protegidos da luz. Para remover a mancha de DAPI em excesso, use duas lavagens PBS de cinco minutos e, após as lavagens, monte os slides. A hibridização in-situ microRNA foi otimizada em seções cardíacas do mouse usando um microRNA mexido para controle negativo, e um SNRNA U6 como um controle positivo.
A expressão específica do cardiomiócito de microRNA-182 foi avaliada em seções cardíacas a partir do controle e dos camundongos que superexpressam o PlGF. Os camundongos carregavam um transgêgênio PlGF sob um promotor alfa-MHC, e desenvolveram hipertrofia cardíaca, secundária ao aumento da angiogênese, dentro de seis semanas após a ativação transgênica. O protocolo de coloração revelou aumento da expressão do microRNA-182 nos corações dos camundongos PlGF.
Em seguida, para determinar quais tipos de células expressas microRNA-182, as mesmas seções foram imunos detidas para cTNT. A coloração da DAPI também foi utilizada. Em ambas as seções cardíacas do rato de controle e plGF, microRNA-182 foi encontrado no compartimento nuclear das células de cardiomiócitos cTNT positivo.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a hibridização microRNAse, seguida por imunostaining proteico. Ao tentar este procedimento, é muito importante lembrar de manter as condições livres de RNAse durante todo o primeiro dia, durante todas as etapas que antecedem a hibridização prop. Após este procedimento, outros métodos como a mancha ocidental em um PCR em tempo real podem ser realizados para responder a perguntas como, quais são os níveis de expressão relativa deste microRNA particular em diferentes tecidos, ou esta proteína particular na mesma seção tecidual.
Não se esqueça que trabalhar com fixações como PFA e ADC pode ser extremamente perigoso. As precauções, incluem o uso de luvas e jalecos, bem como o uso de capuzes de fumaça, devem ser sempre tomadas ao realizar este procedimento.
