この方法は、タンパク質およびマイクロRNA分子の両方の相対lcalizationを検出するツールを提供することにより、microRNA分野の主要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、同じ組織セクションからタンパク質とマイクロRNA分子の両方を検出できることです。このプロトコルは、スライドマウント組織の水分補給から始まります。
ハイブリダイゼーションオーブンで10分間摂氏60度でスライドを温めます。パラフィンは目に見えて溶けているはずです。次いで、市販のクリアリング剤を含有するガラスコプリンジャーにスライドを10分間インキュベートする。
これを2回行います。次に、洗浄から洗浄するためにスライドを移して組織を水分補給します。水和したら、プロテイナーゼKの働く溶液中の組織を摂氏37度で15分間インキュベートします。
プロテナーゼKを除去するために、スライドを1倍PBSで2回洗浄する。さて、組織を修正します。まず、疎水性ペンを使用してスライド上に貯水槽を作り、製剤の周りに撥水円を描きます。
次に、バリア内に4%PFA溶液の500マイクロリットルを塗布し、ヒュームフードにスライドをインキュベートします。固定剤を取り除くために、PBSを含むコプリン瓶でスライドを室温で2回5分間洗います。次に、0.13モル1-メチルイミダゾールで10分間スライドを洗浄します。
室温でフームフードでこれを行い、この洗浄を2回行います。EDC固定剤を加え、ヒュームフードで室温で1時間インキュベートします。スライドを50ミリモルトリスですすいでください。
ハイブリダイゼーションの準備をするために、まず加湿チャンバーを構築します。フィルターまたはティッシュペーパーを2枚を箱の底に積み込み、ホルムアミドと1x SSCの1対1の混合物で紙を濡らします。次に、各スライドに200マイクロリットルの事前温めハイブリダイゼーション溶液を塗布し、加湿したチャンバーを摂氏50度で1〜3時間インキュベートします。
インキュベーション後、ハイブリダイゼーション溶液を250マイクロリットルのプローブ溶液に交換し、スライドをRNaseフリーカバースリップで覆います。カバースリップの下に気泡をトラップしないようにしてください。さて、チャンバーをパラフィルムで丁寧に密封し、プローブのRNA融解温度より約30°C以下でスライドを一晩インキュベートします。
最適化が必要な場合があります。適切なインキュベーション温度の設定に加えて、異なるマイクロRNAが異なるレベルで発現されるため、最適な信号を得るためにプローブ濃度に関する最適化が必要になる場合があります。ハイブリダイゼーションに続いて、ストリンジェンシーの化しを行う。
まず、5分間摂氏50度で2倍のSSCに入ったか、またはカバースリップが緩むまでであった。次いで、室温で2倍のSSCで2回の洗剤を行い、それぞれ5分間行う。次いで、室温で続け、スライドを0.2x SSCで5分間洗浄し、続いてPBSTで5分間、最後に1x PBSで5分間洗浄します。
この時点で、RNA-RNAハイブリッドは安定しており、RNAに厳しい条件は必要なくなりました。DIG抗体検出の場合、まず疎水性バリアをタッチアップし、500マイクロリットルのブロッキング溶液を30分間塗布します。加湿チャンバ内で室温でスライドをインキュベートします。
次に、ブロッキング溶液を取り出し、DIG抗体溶液500マイクロリットルに交換します。加湿チャンバー内の室温でスライドを1時間インキュベートします。その後、コプリン瓶を使用して、PBSTでスライドを1回5分間洗浄します。
次に、スライドをプレ染色液で5分間洗浄します。次いで、スライドをポリプロピレンスライドメーラージャーに移し、20ミリリットルのAP基板溶液を加える。今、光から保護された6〜24時間、摂氏37度でスライドをインキュベートします。
まずAP基質を使用する場合、反応に従うことが重要である。2時間間隔で、最適なインキュベーション時間が決定されるまで、顕微鏡を使用してスライド上の色の発達を確認します。余分なAP基板を取り除くために、1回の洗浄につき5分間KTBT溶液でスライドを2回洗浄し、続いてPBSで5分間1回洗浄します。
cTNT抗体を検出するには、まず、組織を1時間ブロックする。次いで、200マイクロリットルのcTNT抗体溶液を塗布し、加湿チャンバ内で一晩4°Cでスライドをインキュベートします。翌日、PBSを含むコプリン瓶でスライドを5分間洗います。
これを3回行います。次いで、抗ウサギ568抗体溶液の250マイクロリットルを塗布し、加湿チャンバ内で室温で1時間スライドをインキュベートする。過剰な二次抗体を洗い流すために、PBSで5分間の洗浄を3回使用する。
次に、必要に応じて、250マイクロリットルのDAPI作業溶液を塗布し、光から保護されたスライドを1分間インキュベートする。余分なDAPI染色を除去するには、2つの5分間のPBSを使用し、その後、スライドを取り付けます。マイクロRNAインシトゥハイブリダイゼーションは、陰性制御用のスクランブルマイクロRNAと、陽性対照としてU6 snRNAを使用してマウス心臓切片で最適化しました。
マイクロRNA-182の心筋細胞特異的発現は、コントロールマウスおよびPlGF過剰発現マウスから心臓切片で評価した。マウスは、α−MHCプロモーターの下でPlGF導入遺伝子を運び、そして心臓肥大を発症し、血管新生を増加させ、トランスジーン活性化の6週間以内に二次的に発症した。染色プロトコルは、PlGFマウスの心臓におけるマイクロRNA-182の発現の増加を明らかにした。
次に、どの細胞タイプがマイクロRNA-182を発現するかを決定し、同じ切片をcTNTについて免疫染色した。DAPI染色も使用した。コントロールおよびPlGFマウス心臓切片の両方で、マイクロRNA-182はcTNT陽性心筋細胞の核コンパートメントに見られた。
このビデオを見た後、マイクロRNAAseハイブリダイゼーションを行う方法、続いてタンパク質免疫染色を行う方法をよく理解しているはずです。この手順を試みる間、プロップハイブリダイゼーションに至るまでのすべてのステップの間、1日目を通してRNAseフリーの状態を維持することを忘れないでください。この手順に従って、リアルタイムPCRにおけるウエスタンブロットのような他の方法は、異なる組織におけるこの特定のマイクロRNAの相対的な発現レベル、または同じ組織セクション内のこの特定のタンパク質のような質問に答えるために実行することができる。
PFA や ADC などの固定剤を使用すると、非常に危険な作業が行われる可能性があることを忘れないでください。予防措置には、手袋やラボコートの着用、ヒュームフードの使用など、この手順を実行する際には必ず服用する必要があります。
