Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in den Bereichen Makrophagen und dendritische Zellbiologie über die subzelluläre Lokalisierung und Dynamik verschiedener Proteine in diesen Zelltypen zu beantworten. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie relativ einfach und kostengünstig ist und eine bessere Effizienz und Stabilität der Expression als die meisten anderen verfügbaren Methoden zeigt. Demonstriert wird das Verfahren jarmila Kralova, eine Grad-Studentin aus meinem Labor.
Um das Retrovirus herzustellen, platte eine einzellige Suspension von Platinum Eco-Verpackungszellen in einer 10-Zentimeter-Petrischale und kultivieren die Zellen in 15 Milliliter DMEM, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, oder FBS, bis die Kultur 50 bis 60% konfluent ist. Am nächsten Tag 20 Mikrogramm des retroviralen Konstrukts von Interesse und 10 Mikrogramm PCL-Öko-Verpackungsvektor zu 1 Milliliter DMEM ohne Serum, mit sanfter Mischung hinzufügen. Fügen Sie 75 Mikroliter PEI in 1 Milliliter DMEM ohne Serum und Antibiotika in ein zweites Rohr für eine fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur und mischen Sie den Inhalt beider Röhren für eine zusätzliche 10-minütige Inkubation bei Raumtemperatur.
Als nächstes ersetzen Sie das Medium auf den Platinum Eco Zellen sorgfältig durch 8 Milliliter frisches 37 Grad Celsius DMEM, ergänzt durch 2%FBS, und fügen Sie die Transfektionsmischung vorsichtig in Tropfen auf die Platte. Nach einer 4-stündigen Inkubation bei 37 Grad Celsius, ersetzen Sie das Überstand durch 10 Milliliter 37 Grad Celsius DMEM, ergänzt durch 10%FBS für eine 24-Stunden-Inkubation bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag verwenden Sie eine 5 Milliliter Pipette, um das ökotrope retrovirale partikelhaltige Überstand auf ein 15 Milliliter Zentrifugenrohr zu übertragen und die Trümmer zu entfernen und Zellen durch Zentrifugation zu enthalten.
Fügen Sie derweil 10 Milliliter 37 Grad Celsius DMEM plus 10% FBS für eine weitere 24-Stündige Inkubation bei 37 Grad Celsius hinzu und sammeln Sie eine zweite Runde von Viruspartikeln, wie gerade gezeigt. Um das Knochenmark in einer Gewebekulturhaube zu ernten, verwenden Sie Pinzette und Schere, um die Haut und einen Teil der Muskeln von den Hinterbeinen zu entfernen und das Acetabulum vorsichtig aus dem Hüftgelenk zu entfernen, ohne den Oberschenkelknochen zu brechen. Schneiden Sie die Pfoten an den Sprunggelenken und sprühen Sie die Knochen mit 70% Ethanol.
Dann entfernen Sie den Rest des Muskels mit einem Papiertuch und legen Sie die Knochen in eine 5 Zentimeter Petrischale von PBS mit 2%FBS ergänzt. Als nächstes biegen Sie das Kniegelenk jedes Knochensatzes und trennen Sie die Knochen vorsichtig mit einer Schere. Verwenden Sie die Schere, um etwa ein bis zwei Millimeter jeder Epiphyse eines Knochens zu entfernen und verwenden Sie eine Zwei- oder Fünf-Milliliter-Spritze, die mit einer 30-Spur-Nadel ausgestattet ist, die mit frischem PBS plus FBS beladen ist, um das Knochenmark von beiden Enden des Knochens in ein 15 Milliliter Zentrifugenrohr zu spülen.
Wenn das Mark von jedem der Knochen gesammelt wurde, pellet die Knochenzellen durch Zentrifugation und setzt das Pellet in 2,5 Milliliter roter Blutkörperchen LysePuffer für zwei bis drei Minuten bei Raumtemperatur wieder auf. Filtern Sie die Zellen nach dem Lysing durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb in ein neues 15-Milliliter-Zentrifugenrohr und stellen Sie die Hartnäckigkeit mit 12 Milliliter PBS plus FBS wieder her. Setzen Sie das Pellet in DMEM wieder aus, ergänzt mit 10%FBS und Antibiotika zum Zählen und Platten fünf bis zehn mal 10 bis zu den sechsten Knochenmarkzellen in einem 10 Zentimeter, nicht-Gewebe-Kultur behandelt Petrischale in 10 Milliliter DMEM ergänzt mit Serum und Makrophagen Kolonie stimulierenden Faktor, oder MCSF.
Am fünften Tag der Kultur, vorsichtig kippen sie die Zellkulturschale und entfernen Sie alle bis auf etwa 5 Milliliter Medium von der Oberfläche in der Nähe des Rands der Schale. Dann fügen Sie 20 Milliliter frisches 37 Grad Celsius Medium mit FBS und MCSF ergänzt in die Schale und geben Sie die Zellen an die Zellkultur Inkubator. Um die Zellen zu ernten, am Tag sechs bis sieben, entfernen Sie alle mittleren und schwimmenden Zellen und waschen Sie die Kultur mit 37 Grad Celsius PBS.
Lösen Sie die anhaftenden Zellen mit fünf Millilitern 0,02%EDTA und PBS für drei bis fünf Minuten bei 37 Grad Celsius im Inkubator der Gewebekultur und verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Pipette, um die dissoziierten Zellen vorsichtig vom Plattenboden zu spülen. Dann übertragen Sie die Zellen in ein 50 Milliliter Zentrifugenrohr mit 25 Millilitern frischer PBS. Um die EGFP-markierte Proteinexpression in Knochenmark abgeleiteten Antigen-Prägnozellen zu induzieren, verdünnen Sie zu Beginn des Zelldifferenzierungsprotokolls die Knochenmarkzellen auf zwei bis fünf Mal 10 bis sechs milliliter DMEM plus FBS und Antibiotika-Konentration und platten die Zellen von einem Milliliter Medium pro Brunnen, ergänzt durch die entsprechende Differenzierung Cytokin.
Nach vier bis sechs Stunden im Zellkultur-Inkubator zwei Milliliter der ersten Runde des gesammelten Virus hinzufügen, ergänzt durch Polybren, und transduce die Zellkulturen durch Zentrifugation und eine vierstündige Inkubation im Zellkultur-Inkubator. Übertragen Sie am Ende der Transduktionsperiode die nicht haftenden Zellen von jedem Bohrkörper in einzelne 15-Milliliter-Zentrifugenröhren und sammeln die Zellen durch Zentrifugation. Wenn eine größere Anzahl von Zellen benötigt wird, können die Zellen mit dem gleichen Einzieher in mehreren Brunnen infiziert und vor der Differenzierung gepoolt werden.
Dann setzen Sie die Pellets in 10 Milliliter Kulturmedium mit der entsprechenden Differenzierung Cytokin ergänzt und die Zellen auf eine 10 Zentimeter Non-Gewebe-Kultur behandelt Petrischale pro Tube, für ihre sechs bis acht Tage Kultur, wie gerade gezeigt. Die Bewertung der Wirksamkeit der Platin-Eco-Transfektion durch Durchflusszytometrie nach der Entnahme des zweiten Virus, das überlautende Viren enthält, zeigt eine mittlere Transfektionseffizienz von 62 % für PSTPIP2-EGFP und 53 % für OPAL1-EGFP. Die retrovirale Transduktion hat keinen Einfluss auf den Differenzierungsstatus der knochenmarkabgeleiteten Zellen, wobei mehr als 90 % der Zellen in beiden Kulturen nach der Transduktion mit beiden Viren Positivität für ihre jeweiligen Marker aufweisen.
Und mit den entsprechenden, charakteristischen morphologischen Veränderungen, die für beide Arten von differenzierten Zellen beobachtet wurden. Bemerkenswert ist, dass die Gesamtexpression von EGFP in knochenmarkabgeleiteten dendritischen Zellkulturen niedriger war als die von Knochenmark abgeleitete Makrophagen-EGFP-Expression, unabhängig von der Art des Retrovirus. Beim Versuch dieses Verfahrens, Es ist wichtig, daran zu denken, nicht Gewebe zu verwenden, Kultur behandelt Kunststoffgeschirr, die in der Regel für die Kultivierung von Bakterien verwendet werden, wenn Sie planen, Zellen aus der Schale für Experimente zu entfernen.
Nach diesem Verfahren können andere Methoden der Live-Zell-Bildgebung, der Superauflösungsmikroskopie oder anderer Arten von Mikroskopie eingesetzt werden, um zusätzliche Fragen zur subzellulären Lokalisierung und Dynamik von dendritischen Zell- und Makrophagenproteinen zu beantworten. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Immunologie bei der Erforschung der Verteilung und der räumlichen Beziehungen von Proteinen, die durch Makrophagen und dendritische Zellen exprimiert werden, und bei der Förderung unseres Verständnisses der Funktion dieses Proteins während der Immunantworten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit viralen Partikeln extrem gefährlich sein kann und dass Vorsichtsmaßnahmen, wie die minimale Aerosolerzeugung, das Tragen von Schutzausrüstung und die Verwendung einer laminaren Durchflusshaube, immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden sollten.
