이 방법은 이러한 세포 유형에 있는 각종 단백질의 세포 소소화 및 역학에 관하여 대식세포 및 수지상 세포 생물학의 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 비교적 간단하고 저렴하며 사용 가능한 대부분의 다른 방법보다 표현의 효율성과 안정성을 입증한다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원 생 인 Jarmila Kralova가 될 것입니다.
레트로바이러스를 생산하기 위해, 10센티미터 페트리 접시에 플래티넘 에코 패키징 세포의 단일 세포 현탁액을 플레이트와 DMEM의 15 밀리리터에서 세포를 육성하고, 배양이 50 내지 60%의 컨실루물이 될 때까지 10%의 태아 소 혈청 또는 FBS로 보충한다. 다음 날, 관심의 레트로 바이러스 구조의 20 마이크로 그램과 부드러운 혼합과 함께 세럼없이 DMEM의 1 밀리리터에 PCL 에코 패키징 벡터의 10 마이크로 그램을 추가합니다. 실온에서 5분 동안 두 번째 튜브에 세럼과 항생제없이 DMEM의 1 밀리리터에 75 마이크로리터의 PEI를 추가하고 실온에서 추가로 10 분 배양을 위해 두 튜브의 내용을 혼합합니다.
다음으로, 플래티넘 에코 셀의 배지를 2%의 FBS로 보충한 신선한 섭씨 37도의 8밀리리터로 조심스럽게 교체하고, 플레이트에 낙하하여 경질 혼합물을 조심스럽게 첨가한다. 섭씨 37도에서 4시간 배양 후, 수퍼네티드를 섭씨 37도의 10밀리리터로 대체하고, 섭씨 37도에서 24시간 배양시 10%의 FBS를 보충합니다. 다음 날, 5 밀리리터 파이펫을 사용하여 에코트로픽 레트로바이러스 입자 함유 슈퍼나텐트를 15밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 원심분리에 의한 이물질을 제거하고 세포를 포함한다.
한편, 섭씨 37도의 밀리리터 10밀리리터와 10%의 FBS를 문화 요리에 추가하여 섭씨 37도에서 24시간 배양을 더하고, 방금 입증된 바와 같이 두 번째 바이러스 성 입자를 수집합니다. 골수를 수확하려면 조직 배양 후드에서 핀셋과 가위를 사용하여 뒷다리에서 근육의 피부와 부분을 제거하고 대퇴골을 깨지 않고 엉덩이 관절에서 아세타부를 조심스럽게 제거하십시오. 발목 관절에서 발을 자르고 뼈를 70 %에탄올로 스프레이하십시오.
그런 다음 종이 타월로 근육의 나머지 부분을 제거하고 2 % FBS로 보충 된 PBS의 5 센티미터 페트리 접시에 뼈를 놓습니다. 다음으로 각 뼈 세트의 무릎 관절을 구부리고 뼈를 가위로 조심스럽게 분리합니다. 가위를 사용하여 한 뼈의 각 표피의 약 1 ~2 밀리미터를 제거하고 신선한 PBS 플러스 FBS가장착 된 2 개 또는 5 밀리리터 주사기를 사용하여 뼈의 양쪽 끝에서 골수를 15 밀리리터 원심분리기로 플러시하십시오.
골수가 각 뼈로부터 수집되었을 때, 원심분리에 의해 뼈 세포를 펠릿과 실온에서 2~3분 동안 적혈구 용해 버퍼의 2.5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 용해 후, 새로운 15 밀리리터 원심 분리기 튜브로 100 마이크로 미터 세포 여과기를 통해 세포를 필터링하고 PBS 플러스 FBS의 12 밀리리터와 끈기를 복원합니다. DMEM에서 펠릿을 다시 중단, 계산 및 10 센티미터에서 여섯 번째 골수 세포에 5 ~ 10 배 10 배 10 배, 비 조직 배양 처리 페트리 접시에 10 혈청 및 대식세포 식민지 자극 계수, 또는 MCSF에 펠릿을 다시 중단.
문화의 5 일째에, 조심스럽게 세포 배양 접시를 기울이고 접시의 가장자리 근처 표면에서 매체의 약 5 밀리리터를 제외한 모든 제거. 그런 다음 FBS 및 MCSF로 보충된 신선한 섭씨 37도 의 20 밀리리터를 접시에 추가하고 세포를 세포 배양 인큐베이터로 되돌려 보입니다. 세포를 수확하려면 6~7일째에 모든 배지 및 부동 세포를 제거하고 37도 의 PBS로 배양을 세척한다.
조직 배양인인큐베이터에서 섭씨 37도에서 3~5분간 5밀리리터와 PBS의 5밀리리터를 부착하고 5밀리리터 파이펫을 사용하여 플레이트 바닥에서 분리된 세포를 부드럽게 플러시합니다. 그런 다음 신선한 PBS의 25 밀리리터를 포함하는 50 밀리리터 원심분리기 튜브로 세포를 전송합니다. 골수 유래 항원 제시 세포에서 EGFP 태그 단백질 발현을 유도하기 위해, 세포 분화 프로토콜의 시작 부분에서, 골수 세포를 DMEM 플러스 FBS 및 항생제 의 밀리리터 당 6세포당 2~5배 10배로 희석시키고, 적절한 상이한 사이토킨으로 보충하였다.
세포 배양 인큐베이터에서 4~6시간 후, 폴리브레인으로 보충된 수집된 바이러스의 첫 번째 라운드의 밀리리터 2개를 추가하고 세포 배양배기에서 원심분리및 4시간 배양에 의해 세포 배양을 트랜스듀스한다. 전이 기간이 끝나면, 각 웰에서 비부착 세포를 개별 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 원심분리에 의해 세포를 수집한다. 세포의 더 큰 양이 필요한 경우, 세포는 여러 우물에서 동일한 단점으로 감염될 수 있으며 분화 전에 풀로 만들 수 있습니다.
그런 다음 적절한 분화 사이토카인으로 보충된 배양 배지의 10밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 튜브당 10센티미터 비조직 배양처리페트리 접시에 세포를 플레이트, 6~8일 배양에 대해 단지 입증하였다. 슈퍼네이트를 함유한 제2 바이러스의 수집 후 혈류 세포측정에 의한 플래티넘 에코 경화의 효능에 대한 평가는 PSTPIP2-EGFP의 평균 회전 효율이 62%, OPAL1-EGFP의 경우 53%의 평균 경전 효율을 나타낸다. 레트로바이러스 트랜스듀션은 두 배양에서 세포의 90% 이상을 가진 골수 유래 세포의 분화 상태에 영향을 미치지 않으며, 둘 중 어느 바이러스와도 의전후 각각의 마커에 대한 양성을 입증한다.
그리고 분화 된 세포의 두 가지 유형에 대해 관찰 된 적절한 특성 형태학적 변화가 있습니다. 참고, EGFP의 전반적인 발현은 레트로바이러스의 종류에 관계없이 골수 유래 수지상 세포 배양에서 하부되었다. 이 절차를 시도하는 동안, 실험을 위해 접시에서 세포를 제거하려는 경우 일반적으로 박테리아를 재배하는 데 사용되는 비 조직, 문화 치료 플라스틱 요리를 사용하는 것이 중요합니다.
이 절차에 따라, 다른 방법은 세포 이미징, 슈퍼 해상도 현미경 검사또는 현미경 검사법의 다른 유형은 수지상 세포 및 관심의 세포 단백질의 세포 소세포 국소화 및 역학에 대한 추가 질문에 대답하기 위해 사용될 수있다. 이 기술은 대식세포와 수지상 세포에 의해 표현된 단백질의 분포 그리고 간격 관계를 탐구하고 면역 반응 도중 이 단백질의 기능에 대한 우리의 이해를 발전시키기에서 면역학 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다. 바이러스 성 입자와 함께 작업하는 것은 매우 위험 할 수 있으며 에어로졸 생성을 최소화하고 보호 장비를 착용하고 라미나르 유동 후드를 사용하는 것과 같은 예방 조치는 항상이 절차를 수행하는 동안 취해야한다는 것을 잊지 마십시오.
