该方法有助于回答巨噬细胞和树突细胞生物学领域有关这些细胞类型中各种蛋白质的亚细胞定位和动力学的关键问题。这种技术的主要优点是，它相对简单，价格低廉，并且比大多数其他可用方法表现出更好的表达效率和稳定性。演示这个程序的将是贾米拉·克拉洛娃，一个研究生从我的实验室。
为了产生逆转录病毒，在10厘米的培养皿中将铂金生态包装细胞的单细胞悬浮板，并在15毫升DMEM中培养细胞，辅以10%的胎儿牛血清或FBS，直到培养量为50%至60%的汇合。第二天，添加20微克的兴趣的逆转录病毒构造和10微克的PCL生态包装载体到1毫升DMEM没有血清，与温和的混合。在1毫升DMEM中加入75微升的PEI，无需血清和抗生素，在第二管中，在室温下孵育5分钟，并将两个管的内容混合在一起，在室温下再孵育10分钟。
接下来，小心地用8毫升的新鲜37摄氏度DMEM和2%FBS补充的铂金生态细胞上的介质，小心地将转染混合物加入到板材中。在37摄氏度下孵育4小时后，用10毫升37摄氏度DMEM代替超级支架，辅以10%FBS，在37摄氏度下24小时孵育。第二天，使用5毫升移液器将含有生态抗逆转录病毒颗粒的超高支架转移到15毫升离心管中，通过离心去除碎屑和含有细胞。
同时，在培养皿中加入10毫升37摄氏度DMEM加10%FBS，在37摄氏度下再进行24小时孵育，并收集第二轮病毒颗粒，正如刚刚证明的。要收获骨髓，在组织培养罩中，使用钳子和剪刀将皮肤和部分肌肉从后肢中去除，并小心地将乙酰氨从臀部关节上除去，而不会打碎股骨。切开脚踝关节的爪子，用70%乙醇喷洒骨头。
然后用纸巾取出肌肉的其余部分，将骨骼放在 PBS 的 5 厘米培养皿中，并辅以 2%FBS。接下来，弯曲每个骨骼的膝关节，用剪刀小心地分离骨骼。使用剪刀去除一根骨头的大约一到两毫米，并使用两到五毫升注射器，内装有30个量表针，并装有新鲜的PBS和FBS，将骨髓从骨的两端冲洗成15毫升的离心管。
从每个骨骼中采集骨髓后，通过离心对骨细胞进行颗粒状，并在2.5毫升红血球解液中重新悬浮该颗粒，在室温下两到三分钟。在开水后，通过100微米细胞过滤器将细胞过滤到一个新的15毫升离心管中，用12毫升PBS加FBS恢复坚韧。在DMEM中重新悬浮颗粒，辅以10%FBS和抗生素计数，并板5至10倍10至第六骨髓细胞在10厘米，非组织培养处理培养培养的培养培养在10毫升DMEM的培养，辅以血清和巨噬菌体组刺激因子，或MCSF。
在培养的第五天，小心地倾斜细胞培养皿，从靠近培养皿边缘的表面取出除约约5毫升的介质外的所有培养剂。然后加入20毫升的新鲜37摄氏度的培养，辅以FBS和MCSF到培养皿中，并将细胞返回细胞培养箱。为了收获细胞，第6至第7天，取出所有中和浮动细胞，用37摄氏度的PBS清洗培养物。
在组织培养培养箱中，用5毫升0.02%EDTA和PBS分离粘附细胞，在37摄氏度下3至5分钟，并使用5毫升移液器轻轻地将分离的细胞从板底冲洗。然后将细胞转移到一个50毫升的离心管，其中包含25毫升的新鲜PBS。为了诱导EGFP标记蛋白表达在骨髓衍生抗原呈现细胞，在细胞分化方案开始时，稀释骨髓细胞到2至5倍10至6细胞每毫升DMEM加FBS和抗生素结合和板细胞的一毫升中等每井，辅以适当的分化细胞因子。
在细胞培养孵化器中四到六个小时后，加入第一轮收集的病毒的两毫升，辅以多布雷尼，通过离心和细胞培养孵化器四小时的孵化来转导细胞培养。在转导期结束时，将非稳定细胞从每个井转移到单独的15毫升离心管中，通过离心收集细胞。如果需要大量细胞，细胞可以在多个孔中感染相同的收缩，并在分化前进行汇集。
然后重新悬浮在培养基的10毫升颗粒，辅以适当的分化细胞因子，并板将细胞到每管一个10厘米的非组织培养皿上，为它们6至8天的培养，正如刚刚证明的。通过流量细胞学对铂金生态转染的疗效进行评估，在收集了含有超毒的二号病毒后，发现PSTPIP2-EGFP的均转染效率为62%，OPAL1-EGFP的转染效率为53%。逆病毒转导不影响骨髓衍生细胞的分化状态，两种培养物中超过90%的细胞在转导后对各自的标记物表现出积极。
并且通过两种分化细胞的合适、有特征的形态变化观察。值得注意的是，与骨髓衍生的巨噬细胞EGFP表达相比，EGFP在骨髓衍生树突状细胞培养中的整体表达较低，而无论逆转录病毒的类型如何。在尝试此过程时，重要的是要记住使用非组织、培养处理的塑料盘，如果您计划从培养皿中去除细胞进行实验，通常用于培养细菌。
按照这个程序，其他方法活细胞成像，超分辨率显微镜或其他类型的显微镜可用于回答有关树突细胞和感兴趣的巨噬细胞蛋白质的亚细胞定位和动力学的其他问题。这项技术为免疫学领域的研究人员探索巨噬细胞和树突状细胞表达的蛋白质的分布和空间关系，以及加深我们对这些蛋白质在免疫反应过程中的功能的理解铺平了道路。不要忘记，使用病毒颗粒可能极其危险，在执行此过程时，应始终采取预防措施，例如将气溶胶生成降至最低、佩戴防护设备以及使用层流罩。
