Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области макрофагов и дендритной клеточной биологии о субклеточной локализации и динамике различных белков в этих типах клеток. Основные преимущества этого метода в том, что он относительно прост, недорог и демонстрирует лучшую эффективность и стабильность выражения, чем большинство других доступных методов. Демонстрацией процедуры будет Яремила Кралова, аспирантка моей лаборатории.
Для производства ретровируса пластина одноклеточной подвески платиновых эко-упаковочных клеток в 10-сантиметровой чашке Петри и культивировать клетки в 15 миллилитров DMEM, дополненный 10%fetal быvine сыворотки, или FBS, пока культура от 50 до 60% слияние. На следующий день добавьте 20 микрограммов ретровирусной конструкции интереса и 10 микрограммов вектора эко-упаковки PCL в 1 миллилитр DMEM без сыворотки, с нежным смешиванием. Добавьте 75 микролитров PEI в 1 миллилитр DMEM без сыворотки и антибиотиков во вторую трубку в течение пяти минут инкубации при комнатной температуре, и смешать содержимое обеих труб вместе в течение дополнительных 10 минут инкубации при комнатной температуре.
Далее, тщательно заменить среду на платиновых эко-клеток с 8 миллилитров свежих 37 градусов по Цельсию DMEM дополнен 2%FBS и осторожно добавить смесь трансфекции в каплях к пластине. После 4-часовой инкубации при 37 градусах по Цельсию замените супернатент 10 миллилитров 37 градусов по Цельсию DMEM, дополненный 10%FBS для 24-часовой инкубации при 37 градусах по Цельсию. На следующий день используйте трубу из 5 миллилитров для переноса экотропных ретровирусных частиц, содержащих супернатент, в 15-миллилитровую центрифугу и удаления мусора и содержания клеток путем центрифугации.
Между тем, добавить 10 миллилитров 37 градусов по Цельсию DMEM плюс 10%FBS к культуре блюдо еще 24 часа инкубации при 37 градусов по Цельсию и собирать второй раунд вирусных частиц, как только что продемонстрировали. Для сбора костного мозга, в капюшоне культуры тканей, используйте пинцет и ножницы, чтобы удалить кожу и часть мышц из задних конечностей и тщательно выбить ацетабулум из тазобедренного сустава, не нарушая бедренной кости. Вырезать лапы на голеностопных суставах и спрей кости с 70% этанола.
Затем удалите остальную часть мышцы бумажным полотенцем и поместите кости в 5-сантиметровую чашку Петри PBS, дополненную 2%FBS. Затем согните коленный сустав каждого набора костей и тщательно разделте кости ножницами. Используйте ножницы, чтобы удалить от одного до двух миллиметров каждого эпифиза одной кости и использовать два или пять миллилитров шприц оснащен 30 калибровочных иглы загружены свежим PBS плюс FBS, чтобы промыть костный мозг с обоих концов кости в 15 миллилитров центрифуги трубки.
Когда костный мозг был собран из каждой из костей, гранулы костных клеток центрифугации и повторно приостановить гранулы в 2,5 миллилитров красных кровяных клеток лиза буфера в течение двух-трех минут при комнатной температуре. После лиза, фильтровать клетки через 100 микрометровый ситечко клеток в новую 15 миллилитровую центрифугу трубки и восстановить упорство с 12 миллилитров PBS плюс FBS. Повторно приостановить гранулы в DMEM, дополняется 10%FBS и антибиотики для подсчета и пластины от пяти до 10 раз от 10 до шестой клетки костного мозга в 10 сантиметров, не-ткани культуры лечение Петри блюдо в 10 миллилитров DMEM дополнен сыворотки и макрофаг колонии стимулирующий фактор, или MCSF.
На пятый день культуры, тщательно наклонить блюдо клеточной культуры и удалить все, кроме примерно 5 миллилитров среды с поверхности вблизи края блюда. Затем добавьте 20 миллилитров свежей среды 37 градусов по Цельсию, дополненной FBS и MCSF, в блюдо и верните клетки в инкубатор клеточной культуры. Чтобы собрать клетки, на шестой-седьмой день, удалить все средние и плавающие клетки и мыть культуру с 37 градусов по Цельсию PBS.
Отсоедините адепт клетки с пятью миллилитров 0,02%EDTA и PBS в течение трех-пяти минут при 37 градусах по Цельсию в инкубаторе культуры тканей и используйте пятими миллилитровую пипетку, чтобы аккуратно смыть диссоциированные клетки со дна пластины. Затем перенесите клетки в 50-миллилитровую центрифугу, содержащую 25 миллилитров свежего PBS. Чтобы вызвать EGFP помечены выражение белка в костном мозге производных антигенов, представляя клетки, в начале протокола дифференциации клеток, разбавить клетки костного мозга в два-пять раз от 10 до шестой клетки на миллилитров DMEM плюс FBS и антибиотики conentration и пластины клетки одного миллилитра среды на колодец, дополненный соответствующей дифференциации цитокинов.
После четырех-шести часов в инкубаторе клеточной культуры добавьте два миллилитров первого раунда собранного вируса, дополненного полибреном, и трансдуцировать клеточные культуры центрифугой и четырехчасовой инкубацией в инкубаторе клеточной культуры. В конце периода трансдукции перенесите неадъердные клетки из каждого колодец в отдельные 15 миллилитровых центрифугных трубок и соберите клетки путем центрифугации. Если требуется большее количество клеток, клетки могут быть заражены одним и тем же консорциумом в нескольких скважинах и объединились перед дифференциацией.
Затем повторно приостановить гранулы в 10 миллилитров культуры среды дополняется соответствующей дифференциации цитокинов и пластины клеток на один 10 сантиметров, не ткани культуры лечение Петри блюдо на трубку, за их шесть-восемь дней культуры, как только что продемонстрировали. Оценка эффективности трансфекции Platinum Eco по цитометрии потока после сбора второго вируса, содержащего супернатент, показывает средняя эффективность трансинфекции 62% для PSTPIP2-EGFP и 53% для OPAL1-EGFP. Ретровирусная трансдукция не влияет на дифференциацию состояния клеток костного мозга с более чем 90% клеток в обеих культурах, демонстрирующих положительность для их соответствующих маркеров после трансдукции с любого вируса.
И с соответствующими, характерными морфологическими изменениями, наблюдаемыми для обоих типов дифференцированных клеток. Следует отметить, что общее выражение EGFP было ниже в костном мозге, полученных дендритных клеточных культур по сравнению с костного мозга, полученных макрофаг EGFP выражение, независимо от типа ретровируса. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы использовать не ткани, культуры лечение пластиковых блюд, которые обычно используются для выращивания бактерий, если вы планируете удалить клетки из блюда для эксперимента.
Следуя этой процедуре, другие методы живой клеточной визуализации, микроскопии супер разрешения или других видов микроскопии могут быть использованы, чтобы ответить на дополнительные вопросы о субклеточной локализации и динамике дендритных клеток и макрофагов белков, представляющих интерес. Этот метод проложил путь для исследователей в области иммунологии в изучении распределения и спациальных отношений белков, выраженных макрофагов и дендритных клеток и в дальнейшем наше понимание функции этих белков во время иммунных реакций. Не забывайте, что работа с вирусными частицами может быть чрезвычайно опасной, и что меры предосторожности, такие как минимизация производства аэрозолей, ношение защитного оборудования, и использование ламинарного капюшона потока, всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
